台州市手足口病采样与实验室检测技术要点.doc

附件5
台州市手足口病采样与实验室检测技术要点

引发手足口病的肠道病毒有20多种，包括柯萨奇病毒A组、肠道病毒71型等，其中最常见的病原为肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇A16型(Cox A16)。为规范我省手足口病采样与实验室检测各项工作，按照卫生部《手足口病预防控制指南（2008年版）》和省中心有关文件要求，制订本技术要点。
一、标本采集及注意事项
（一）标本采集对象：⑴危重病例和死亡病例；⑵住院病例；⑶聚集性病例（学校与幼托机构一周内出现2例及以上病例）；⑷以乡镇为单位首发病例。
（二）采样时间：用于病毒核酸检测及分离的标本采集尽可能在发病的初期，急性期或患者入院的当天进行，同时最好在感染的急性期和恢复期采集用于抗体检测的双份血清（相隔2～4周）。
（三）标本种类；用于检测的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。对于血清学诊断，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。
（四）采样液：常用的采样液有以下几种： pH7.4～7.6的Hank’s、Eagle’s、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml,和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管2-3ml,-20℃冻存。
（五）采集方法
1.疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有1-2 ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
2.粪便：采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
3.脑脊液：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
4.咽拭子：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
5.含漱液：用5-6 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动，尽可能在咽喉深部反复含漱，然后用平皿、烧杯或一次性杯子收集洗液，倒入15ml带螺旋盖内有橡胶圈试管里，旋紧盖子。
6.血清标本：采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。
（六）标本采集注意事项
用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。在采集咽拭子及漱口液前半小时内不要喝水，以保证采样质量。漱口液中严禁加入抗生素，以防过敏。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。
二、标本的保存与运输
(一)保存：病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，因此样本采集后要尽快送检，标本可暂时（数小时）保存在0～4℃低温环境中，或放置在－20℃的冰箱中。长期保存时标本不经稀释，直接冻存于在-70℃以下，并避免反复冻融。
（二）运输：标本应在 £4℃条件下，由专业人员使用标本运送箱尽快送至实验室。若不能在24小时内送达，则应尽快保存在－70℃以下低温冰箱，如无－70℃以下低温冰时，则暂时保存在－20℃低温冰箱（1天内），并尽快联系递送标本。送检标本时需随带样本送检表（附表（1））。
三、病毒核酸检测
病毒核酸快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于病毒性疾病暴发疫情的早期病原学检测。
（一）样本处理
脑脊液标本无需处理，咽拭子、含漱液或疱疹液样本均需充分混匀，室温静止10分钟，取上清液200μl用于病毒核酸提取。粪便样本用生理盐水或PBS制成20%粪便悬液，即1克粪便加5毫升PBS，充分混匀，4500转/分，离心20分钟， 取上清液200μl用于提取病毒核酸。
（二）病毒核酸提取
试剂盒：采用RNA RNeasy mini Kit
1.材料：二巯基乙醇（β－2ME），QIAGEN Reansy Mini Kit (RLT，RW1，RPE) ，75％乙醇，离心柱， Rnase的去离子水。1.5 ml　Eppendorf管，0.5 ml PCR反应管，2.0 ml　园底管。
2.操作步骤：(室温下进行)
(1）取1.5 ml　Eppendorf管，加入二巯基乙醇（β－2ME）6μl，再加入RLT 600μl。
(2）加入200μl样本剧烈振荡1分钟。
(3）加600μl 75％乙醇（－20℃保存），用手颠倒混匀。
(4）将700μl混合液加入离心柱中，12000rpm离心15秒，弃去液体，管子仍可以用。
(5）再将余下的700μl混合液加入离心柱中， 12000rpm离心15秒，弃去液体，管子仍可以用。
在柱子中加入700μl RW1，12000rpm离心15秒，弃去离心液及2ml收集管。
取新的2ml收集管套在柱子下面，在柱子中加入500μl RPE，12000rpm离心15秒，弃去液体，不换管子。
在柱子中再加入500μl RPE，12000rpm离心15秒，弃去液体及收集管。
准备新的2ml收集管，置柱子下面，15000rpm离心2分钟，弃去离心液及收集管（目的是把残留的RPE尽量离掉）。
取新的1.5ml eppendorf管置柱子下面，加入30μl 无Rnase的去离子水（Kit供应）于柱子中（加在膜的中央），放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
将提取的病毒RNA置于－80℃保存备用，或立即进行RT-PCR。
（三）RT-PCR方法
1. 引物序列
1）人肠道病毒（包括EV71、CA16）核酸检测通用引物序列：
PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`
PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
PCR产物长度116bp

2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`
EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
PCR产物长度226bp
3）CA16核酸检测引物序列：
Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
PCR产物长度208bp
2.引物的稀释
稀释加水量的计算：合成好的引物探针用双蒸水（最好经无RNA酶处理）稀释成20pmol/ul的浓度，分成几管，然后放-20℃保存。如果是配成20pmol/ul的浓度，那么所加水的量是（ul）＝（OD数×33）÷分子量×50000
注：稀释前先短暂离心，并小心打开管盖，小心加入水（无RNA酶）。加水后充分涡旋振荡溶解1－2分钟。分装使用!! 避免反复冻融!
3.反应体系配置
试剂盒：选用TAKARA one step RT-kit（货号DRR024A） ,体系共25 μl，模板量可根据样本情况自行决定，不够部分以ddw补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。
从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温下融化后，2000rpm离心5秒钟。按n＋1配置反应体系（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：（不同的病毒检测体系引物探针的量可做相应调整）
内容
1份样本的量
10×buffer
2.5 ul
MgCl2
5 ul
dNTPmix
2.5ul
RNasin
0.5ul
AMV
0.5ul
Taq
0.5ul
上游引物
0.5ul
下游引物
0.5ul
H2O
4.5ul
RNA模板
8 ul
4.反应条件
RT－PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物和试剂盒更换，相应的反应条件需要做适当调整。
⑴50℃ 30 min
⑵95℃ 3min
⑶95℃ 20 sec
⑷45℃ 25 sec
⑸72℃ 30 sec 返回第3步，循环31次
⑹72℃ 10 min
⑺4℃ soak
5.PCR 产物检测
琼脂糖凝胶配置：用1×TBE 将琼脂糖配成1.2%～1.5%溶液，加热使之完全溶解。冷却到50～60℃时加入溴化乙锭（Ethidium Bromide EB，10ug/μl），终浓度为0.5μg/ml。
PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer ，使它淹没过胶面。每份标本取8μl PCR产物，与1.5μl 6× Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶的第一孔加入分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v，电泳时间约30～40min。
6.电泳结果观察：用UV～254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm 下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
注意事项：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用。含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。
（五）结果解释
通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。
RT-PCR实验结果解释表
待检标本RT-PCR结果
鉴定结果
所有引物（－）
非肠道病毒（NEV）
EV（＋），EV71（－），CA16（－）
非EV71、CA16的其它肠道病毒
EV（＋），EV71（＋），CA16（－）
EV71
EV（＋），EV71（－），CA16（＋）
CA16
(四)荧光RT-PCR方法检测肠道病毒
1. EV荧光RT-PCR引物和探针(肠道病毒通用引物)
EV- F12： 5′-CTGYRGCGGAACCGACTAC-3′；
EV- R13：5′-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3′；
EV-Probe：5′FAM-TTGGGTGTCCGTGTTT- MGB-3′
2.引物和探针的稀释
稀释加水量的计算：合成好的引物探针用双蒸水（最好经无RNA酶处理）稀释成20pmol/ul的浓度，分成几管，然后放-20℃保存，还应该注意避光保存探针。如果是配成20pmol/ul的浓度，那么所加水的量是（ul）＝（OD数×33）÷分子量×50000
注：稀释前先短暂离心，并小心打开管盖，小心加入水（无RNA酶）。加水后充分涡旋振荡溶解1－2分钟。分装使用!! 避免反复冻融，探针需避光保护!
3.反应体系配置
试剂盒：选用Takara公司的one step Prime Script RT-PCR ( Perfect Real time) ，Code:DRR064A ,反应体系共25 μl，模板量可根据样本情况自行决定，不够部分以无菌双蒸水（ddw）补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。
从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温下融化后，2000rpm离心5秒钟。按n＋1配置反应体系（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：（不同的病毒检测体系引物探针的量可做相应调整）

内容
1份样本的量
2×one step RT-PCR buffer
12.5ul
Ex Taq HS
0.5ul
RT Enzyme Mix II
0.5ul
上游引物
0.8ul
下游引物
0.8ul
探针
0.4ul
H2O
1.5ul
RNA模板
8 ul
4.荧光RT-PCR循环条件设置
程序
循环数
温 度(摄氏度)
反应时间（分钟：秒）
1
1
42
30 min
2
1
95
2 min
3
40
95
5 sec
55
35 sec
读荧光
5.对照设置
(1)阴性内对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替样本。
(2)阴性外对照：荧光PCR反应时以灭菌双蒸水代替模板RNA。
(3)阳性外对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA。
6．结果分析条件设定和结果判断
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
（1）Ct值无数值的样本为阴性样本。
（2）Ct值≤30.0的样本为阳性。
（3）Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
四、检测要求
对住院病例（含危重、死亡病例）和暴发疫情病例应主动采样检测，县区疾控中心负责样本的采集和运送；市级疾控中心负责辖区内样本检测。（附表2）
五、生物安全
根据2006年卫生部《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒 71型和目前分类未定的其它肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。
操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。
灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。
所有操作应遵守国家相关法律法规。

附表5-1
手足口病例标本送检登记表

患者姓名 性别 出生日期 年 月 日（阴/阳历）
家长姓名 家庭住址 市 乡（镇、街办） 村（居） 号
家庭电话
发病日期 年 月 日
初诊日期 年 月 日；初诊单位 （省级/市级/县级/乡级/村级） 初步诊断：_______________________________
住院治疗（是/否），如住院，则：
入院日期 年 月 日，入院诊断
出院日期 年 月 日，出院诊断
病程 天
预后：痊愈/好转/未愈/死亡/其他 ；后遗症（有， ；无）

标本统一编号：
标本类型
采样
日期
送检
日期
是否
冷藏
标本
量
收样
日期

检测
日期
报告
日期
实验结果
肠道病毒
EV71
CoxA16
咽拭子

血
清
急性期

恢复期

粪便标本

脑脊液

疱疹液

注：送检标本编号为“标本统一编号+标本类型”，其中“T”为咽拭子代码， “S1”为急性期血清代码，“S2” 为恢复期血清代码，“F”为粪便标本代码，“CSF”为脑脊液代码，“H”为疱疹液代码。

采样人： 采样单位： 送样人：
附表5-2
台州市手足口病临床标本检测结果报表
报告单位: 填表人： 联系方式：

姓名

性别

年龄

现住址
标本类型
临床诊断
发病
日期
采样
日期
检测
日期
实验结果
肠道
EV71
CoxA16
备注
轻型
重型

主题词：疾病控制 手足口病 方案 通知
抄送：
台州市疾病预防控制中心办公室 2008年5月8日印发