人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案.doc

2006-5-26 人感染高致病性禽流感应急预案
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案

一、 采集对象
二、 采集要求
三、 标本种类
四、 标本采集方法
五、 标本包装
六、 标本保存
七、 标本送检
八、 实验室生物安全
九、 标本的实验室检测
十、 检测结果的判断和报告
十一、 实验室检测流程
十二、 人禽流感实验室检测职责

为及时、科学地采集和运送人禽流感病例或疑似污染环境等各种类型的标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，明确诊断或开展相关科学研究，特制定本方案。

一、 采集对象
1. 人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例。
2. 其他需要进行人禽流感诊断或排除者。
3. 需要采集的环境标本。

二、 采集要求
1. 从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员参照规定的防护措施进行安全防护。
2. 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾病预防控制机构专业人员指导下采集。
3. 标本采集具体种类和数量由现场工作组确定。
4. 密切接触者标本由当地疾病预防控制机构负责采集。
5. 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。

三、 标本种类
每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本；需要排除人禽流感的死亡病例则依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫生部令第43号）的规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。

1. 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。最佳采集时间为发病后3天内。
2. 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活检标本。
3. 尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
4. 血清标本：每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复期双份血清。第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后第3～4周采集。采集量要求5ml，以空腹血为佳，建议使用真空采血管。
5. 其他标本：如果病例有腹泻症状，可在发病后采集粪便标本；有胸水者可采集胸水标本。

四、 标本采集方法
1. 咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
2. 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
3. 鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
4. 咽漱液：用10ml不含抗菌素的采样液漱口。漱口时让患者头部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动。然后将咽漱液收集于50ml无菌的螺口塑料管中。无条件的可用平皿或烧杯收集咽漱液并转入10ml螺口采样管中。
5. 深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于50ml含3ml采样液的螺口塑料管中。
6. 呼吸道灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（亦可用小孩导尿管接在50ml注射器上来替代收集）。
7. 胸水：在B超定位下进行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于无菌的塑料螺口管中。
8. 肺组织活检标本：在超声或X线定位下，经皮穿刺取肺组织活检标本，置于含3ml采样液的塑料螺口管中。
9. 尸检标本：每一采集部位分别使用不同消毒器械，以防交叉污染；每种组织应多部位取材，各部位应取20～50g，淋巴结取2个。
10. 粪便标本：采集5～10g粪便置于含5～10ml采样液无菌螺口管中，严格密封。
11. 血清标本：用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管中。

注：常用的采样液配方为：pH 7.4～7.6的Hanks氏液或MEM/DMEM液。在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。

五、 标本包装
标本采集后在生物安全Ⅱ级实验室生物安全柜内分装成一式三份（分装标本的生物安全柜不能用于提取核酸）。一份当地检测用，一份送中国疾病预防控制中心检测，一份保存以备复核。

1. 所有标本应放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的塑料管里，拧紧。容器外注明样本编号、种类、姓名及采样日期。
2. 将密闭后的标本放入大小合适的塑料袋内密封，每袋装一份标本。
3. 标本有关信息填写“疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检单”见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005]526号），用另一塑料袋密封。

六、 标本保存
用于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进行检测，24小时内能检测的标本可置于4℃保存，24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存。如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存。血清可在4℃存放3天、-20℃以下长期保存。标本运送期间应避免反复冻融。标本应设立专库或专柜单独保存。

七、 标本送检
1. 上送标本
检测结果阳性或可疑的原始标本或分离物应及时送中国疾病预防控制中心复核和进一步检测；省级疾病预防控制机构实验室检测阴性，且有明确流行病学证据的病例的标本送中国疾病预防控制中心进一步检测。

2. 标本运送的生物安全要求
按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）等有关规定执行。

3. 标本送检的程序
各省（区、市）需要向中国疾病预防控制中心送检标本时，应事先与中国疾病预防控制中心疾病控制与应急处理办公室联系。具体要求见《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》（中疾控疾发[2005]526号）。

八、 实验室生物安全
从事人禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能，在检测的过程中必须采取生物安全Ⅲ级防护。不同的标本检测生物安全级别要求如下。

1. 标本的分装和核酸提取在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内进行，病毒培养物的核酸提取必须在生物安全Ⅲ级实验室的生物安全柜内进行。
2. 标本的抗原快速检测在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜内进行。
3. 人禽流感病毒的分离、鉴定必须在生物安全Ⅲ级实验室里进行。
4. 采用灭活抗原进行血凝抑制试验检测血清抗体时，要求在生物安全Ⅱ级实验室内操作。采用微量中和试验进行血清抗体检测必须在生物安全Ⅲ级实验室操作。
5. 阳性标本和分离物的保存及销毁应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令）执行。

九、 标本的实验室检测
1. 核酸检测：方法包括RT-PCR和Real-Time PCR，建议使用国家流感中心或世界卫生组织推荐的引物和探针。
2. 抗原快速检测方法包括ELISA法和金标法，本方法仅具参考价值，不作为诊断依据。
3. 病毒分离及鉴定：采用SPF鸡胚和MDCK细胞分离方法。病毒的鉴定采用血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验或序列测定。
4. 血清学检测：方法包括微量中和试验、血凝抑制试验、单扩溶血试验。
5. 以上实验室检测方法详见《全国流感/人感染高致病性禽流感监测实施方案》。

十、 检测结果的判断和报告
1. 各检测项目阳性报告
(1) H5基因核酸检测：A型特异性引物能够扩增出预期大小的产物，两对H5亚型特异性引物都能够扩增出预期大小的产物。
(2) 抗原快速检测：按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为阳性。
(3) 病毒分离及鉴定：分离出病毒，并经鉴定为H5亚型或H5N1亚型。
(4) 血清学检测：双份血清抗体滴度4倍或以上增高有诊断意义。

2. 各检测项目阴性报告
(1) H5基因核酸检测： 两对H5亚型特异性引物均不能够扩增出预期大小的产物。
(2) 抗原快速检测：按照试剂盒说明书进行检测，结果判断为阴性。
(3) 病毒分离：培养物红细胞凝集试验阴性。
(4) 血清学检测：血清抗体滴度＜1:20为阴性。

3. H5基因核酸检测不一致
两对H5亚型特异性引物扩增出的产物检测结果不一致时，则对阳性扩增产物进行测序，如果为H5N1病毒序列，则判断为阳性。
标本检测结果有关信息填写“人感染高致病性禽流感标本检测结果反馈表”（具体见《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例标本送检、接收、检测和结果报告反馈工作流程》中疾控疾发[2005]526号）。

十一、 实验室检测流程
应采集人禽流感检测对象上呼吸道标本和下呼吸道标本进行禽流感病毒的核酸检测和病毒分离，同时要采集病例的急性期和恢复期血清标本进行H5N1亚型特异性抗体检测。
原则上，先由省级及以下疾病预防控制机构进行初步检测，阳性标本送中国疾病预防控制中心复核；省级疾病预防控制机构实验室检测阴性，且有明确流行病学证据的病例标本送中国疾病预防控制中心进一步检测。
省级疾病预防控制机构不具备检测条件的，送中国疾病预防控制中心或邻近具备相应条件和资格认证的省级疾病预防控制机构进行检测。
具体步骤见人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图。

十二、 人禽流感实验室检测职责
1. 中国疾病预防控制中心职责
(1) 对省级以及其他人禽流感检测实验室的检测结果进行复核，并对上送的标本做进一步检测。
(2) 对不具备禽流感病毒核酸检测、病毒分离条件的省级上送的标本进行检测。
(3) 对需做微量中和实验的血清标本进行微量中和试验。
(4) 对分离到的禽流感病毒株做抗原及基因分析。
(5) 及时向送检标本的机构反馈检测结果。
(6) 对省级疾病预防控制机构实验室人员进行实验室技术和生物安全培训。
(7) 对省级疾病预防控制机构实验室提供技术和试剂支持并进行质量控制。
(8) 对省级疾病预防控制机构的实验室检测和生物安全工作进行督导。

2. 省级疾病预防控制机构职责
(1) 对辖区内人禽流感标本的采集工作提供技术指导和物质支持，必要时直接参与标本的采集。
(2) 按照生物安全要求，对采集到的标本进行禽流感病毒的核酸检测、血清学检测和抗原检测。获得国家认证的生物安全Ⅲ级实验室才可开展病毒分离和微量中和试验。
(3) 按照生物安全要求妥善保存原始标本或禽流感病毒株。
(4) 符合上送条件的标本或毒株按规定及时送中国疾病预防控制中心。
(5) 及时向中国疾病预防控制中心上报人禽流感检测的相关信息。
(6) 及时向送检标本的机构反馈检测结果。
(7) 根据疫情的发展和工作需要，向中国疾病预防控制中心申请指定辖区内符合要求的国家级流感网络实验室开展相应的人禽流感检测工作。
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呼吸道、尸检标本、其他标本
病毒分离和鉴定
人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图
标本采集对象
血清标本
微量中和试验、HI试验、单扩溶血
报告结果
采集检测
第三份血清
双份血抗体滴度有4倍增高
双份血抗体滴
度无4倍增高
核酸检测：RT-PCR或Real-Time PCR 引物至少应包括A、两对H5
按照人流感监测方法分离鉴定*
可疑
A及两对
H5阳性
两对
H5阴性
阴性
扩增产物序列测定
报告
报告
报告
阳性
再次采样
再次检测

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信息来源：《人感染高致病性禽流感应急预案》