大豆GmCLC-d1_d2基因参与盐胁迫适应过程的生理功能.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()江苏省农业科技自主创新项目()作者简介:张露硕士研究生通信作者:於丙军教授博导主要从事植物逆境生理生态与分子遗传改良研究:.张露黄巧玥程聪等.大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能.南京农业大学学报():./.():.大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能张露黄巧玥程聪刘询於丙军(.南京农业大学生命科学学院植物逆境生物学实验室江苏 南京.新疆农业大学生命科学学院新疆 乌鲁木齐)摘要:目目的的 本文旨在研究大豆/基因及其启动子对盐胁迫的响应并探索其参与植物盐胁迫适应过程的生理机制 方方法法 从大豆品种中克隆了/基因分别构建其植株 干扰()和过表达载体通过发根农杆菌介导转化获得 和过表达大豆发根组合植株利用根癌农杆菌介导转化获得过表达拟南芥分析和比较盐胁迫下植株的形态和生理指标变化 结结果果 与转空载大豆发根组合植株相比盐处理下/植株鲜重、叶片相对含水量()和叶绿素含量根和叶过氧化氢酶()、过氧化物酶()和超氧化物歧化酶()活性明显下降根、叶相对电解质渗漏率()和丙二醛()含量以及根、茎、叶 含量明显上升含量显著下降导致根、茎和叶特别是地上部/值显著上升而发根过表达大豆植株/的上述指标表现相反耐盐性有所增强盐胁迫下过表达/拟南芥种子发芽率、幼苗根长以及 周龄植株鲜重、叶片 及叶绿素含量等均明显优于野生型地上部 和 含量显著降低、和 活性明显增强根和地上部 含量明显降低含量明显上升导致根和地上部特别是后者/值显著下降 结结论论/可通过增强盐胁迫下 在发根过表达大豆组合植株或过表达拟南芥化植株根部的吸收以及向地上部的转运和分配并在一定程度上抑制 的吸收和转运以维持植株特别是地上部较低的/值从而增强耐盐性其中 基因的效应更明显关键词:/基因大豆发根过表达过表达拟南芥/值耐盐性中图分类号:.文献标志码:文章编号:()/(.):/./()()/.()()()()/()()/././.()第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能/././.:/盐胁迫是造成植物生长和发育受阻、作物产量和品质下降以及威胁农业和食品安全的主要非生物逆境因子之一 由于盐渍化土壤中的盐分以 为主以、为主的离子毒害是植物盐害的主要形式之一其中 是造成盐害的主要阴离子 氯离子通道蛋白()是一类主要介导以 和 等阴离子的转运蛋白广泛定位于原核和真核生物的内膜系统 当植物遭受盐胁迫时 在参与植株体内阴离子吸收、转运和分配或稳态调控等方面发挥着重要作用 目前已陆续在拟南芥、烟草、水稻、马铃薯、玉米、波菜、柑橘、盐芥、大豆等多种植物中发现 基因 其中对拟南芥 基因家族 个成员()编码蛋白的功能研究较多如定位于液泡膜上的 主要作为/驱动 在液泡中的积累 与 相似性最接近两者在功能上可能有重复、和 都主要表现 转运活性 主要负责叶肉细胞叶绿体基质中(由 还原而来)或 向叶绿体类囊体腔中运输大豆是我国主要农作物之一也是世界上种植最广泛的谷类豆科植物是人类重要的食用油、蛋白质和动物饲料的原料来源 栽培大豆()属于中度盐敏感植物相比较而言盐胁迫下栽培大豆对较 更敏感植株受伤害程度与其茎和叶或地上部 含量呈正相关 关于大豆 基因家族成员除 外还发现、和 等家族成员其中栽培大豆 和野生大豆 都可通过调控、等在植株根部的吸收及其向地上部(含茎和叶)的转运和分配以维持较低的/值和协调的阴离子稳态来增强转基因大豆和拟南芥植株的耐氯(盐)性 目前关于植物 家族中 同源基因功能的相关研究较少 等研究表明 可通过介导 或 等阴离子运输来维持反式高尔基体()内 值的稳定 等发现 可负调控拟南芥幼苗的先天病菌免疫 突变体植株表现对致病菌丁香假单胞菌更强的抗性 本文主要研究了大豆/基因及其启动子对盐胁迫的响应模式并利用大豆发根和拟南芥转化技术探究其参与植物盐胁迫适应过程的生理机制旨在为今后利用该基因深入开展培育大豆或其他作物耐盐新种质材料提供理论依据 材料与方法.植物材料、菌株和质粒植物材料包括拟南芥(野生型)、本氏烟草()、栽培大豆(.)品种 菌株包括大肠杆菌、根癌农杆菌株 和发根农杆菌株 双元表达质粒包括 和.方法.基因结构和氨基酸序列特征分析 根据本实验室前期研究报道从大豆数据库 数据库(:/./)下载 (.)和(.)的基因序列、序列和所编码蛋白的氨基酸序列 利用 在线工具(:/./.)分析 和 的基因结构 利用 .软件(:/./.)对 和 的氨基酸序列进行比对.大豆幼苗培养、提取和 大豆种子用 乙醇消毒后浸泡于去离子水中 后将种子转移至铺有湿润吸水纸的塑料盘中置于培养箱()暗中催芽 挑选发芽良好、一致的种子播种于含蛭石的塑料周转箱中用/营养液浇灌后放于植物生长室进行培养培养条件:昼、夜温度分南 京 农 业 大 学 学 报第 卷别为()和()光照强度 相对湿度 待第 三出复叶完全展开后将大豆幼苗分成 组一组继续用/营养液浇灌()另一组用含 的/营养液浇灌()分别于、取叶片(均为 组生物学重复)迅速用液氮冷冻后于 保存备用 使用 提取试剂盒(上海生工)提取总 使用 型荧光定量 仪进行 检测 反应体系包含 ()引物 和 各.以大豆(.)为内参基因用 法计算相对表达量 引物如表 所示表 本研究中使用的引物 命名正向()反向()目的 .载体构建 选择 和 起始密码子 上游 的序列作为基因的启动子区设计引物分别克隆得到 和 的启动子片段插入 载体使其控制 基因表达即得到重组载体 和 基于 和 的 相似性很高选择二者完全相同的 序列作为 靶序列通过正向、反向分别插入 载体 内含子的上、下游获得重组 载体/分别克隆 和 的全长 序列插入 载体 启动子下游分别获得重组过表达载体 和 重组载体 、和 分别导入根癌农杆菌 用于拟南芥遗传转化空载体()、基因沉默载体/和过表达载体、分别转化发根农杆菌 用于构建大豆发根组合植株 构建载体所用引物及序列见表.烟草叶片瞬时转化和 染色将含有重组载体 或 的根癌农杆菌 接种于含有 卡那霉素和 利福平的 液体培养基、振荡培养 待菌液 .时离心收集菌体后用含 乙酰丁香酮()的 溶液重悬然后于 黑暗静置 取生长 周的本氏烟草使用注射器将菌体重悬液注射到其叶片中注射后的烟草正常生长 后用 溶液处理正常培养的烟草作为对照()处理 后取叶片进行 染色最后用无水乙醇除去叶绿素观察着色深浅.大豆发根组合植株耐盐性分析 将已导入空载体或重组载体/、的发根农杆菌 接种于含 卡那霉素的 液体培养基、振荡培养 待菌液.时离心收集菌体后用含 的 液体培养基(.)重悬室温静置 后根据 等的方法进行大豆发根转化和盐处理 主要步骤包括:在蛭石上培养 的大豆幼苗从子叶节下方 处剪下浸泡在已准备好的发根农杆菌重悬液中于室温黑暗静置过夜共培养 然后将转化受体转移到湿润的蛭石上继续培养待下胚轴伤口处出现愈伤组织并长出根时取出 第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能幼苗剪去侧根移至/营养液中继续培养 周并取少量毛状根提取 进行 鉴定仅保留毛状根为基因 或过表达的大豆发根组合植株 转移至营养液继续培养 周后随机分成 组即正常营养液培养()和含 的营养液培养()处理 后拍照观察表型差异 根据 等的方法测定植株鲜重叶片相对含水量()和叶绿素含量根和叶相对电解质渗漏率()和丙二醛()含量以及抗氧化酶(、)活性 取新鲜根或叶(.)用 含 和.的 缓冲液(.)匀浆在 条件下 离心 取上清液即为粗酶液用于抗氧化酶活性测定 将正常培养和盐处理的大豆植株于烘箱中烘干至恒重后研磨成粉末根据 等的方法分别测定、含量.拟南芥遗传转化及耐盐性分析 利用根癌农杆菌介导的浸花法获得/过表达拟南芥收获的 代种子播种于营养土中喷洒 草铵膦溶液叶片不变黄能够正常生长的即为抗性植株 提取抗性植株叶片的 利用 检测确定基因过表达植株进一步收获 代纯合子种子并参照 等的方法进行耐盐性分析 分别取拟南芥、和 种子用 乙醇消毒 在无菌超净台吹干后均匀播在 培养基、含 或 的 培养基上每天统计萌发率连续统计 此外将萌发一致的拟南芥移至 培养基、含 或 的 培养基上垂直培养 后统计根长 此外在营养土中培养约 周龄的拟南芥植株用 溶液处理 观察表型差异并拍照后测定植株鲜重、叶片、叶绿素含量、和 含量、抗氧化酶(、)活性以及根和地上部、含量.数据分析以上各试验均重复 次 应用 .软件对试验数据进行均值、标准差、差异显著性分析 结果与分析./基因及其编码蛋白氨基酸序列特征根据 数据库中、的基因序列和 序列进行分析显示 基因全长 基因全长 但两者均含有 个内含子(个外显子)且 序列均为 (图)通过对所编码蛋白的氨基酸序列比对发现:和 氨基酸序列一致性高达.仅有 处氨基酸不同均含有 蛋白家族典型的 个保守的跨膜结构域和 个()结构域都具有()、()和()等氨基酸残基保守区其中相应关键氨基酸残基位点如保守区()表明它们对阴离子如 较 可能具有优先选择属性保守区()(“门控”谷氨酸)和保守区()(“质子”谷氨酸)是 蛋白家族中/的关键谷氨酸可表明它们的转运蛋白属性(图)./基因及启动子对盐胁迫的响应模式 结果显示正常培养()的大豆幼苗叶片 和 基因的表达维持在相对稳定的水平但在 处理 过程中两者的表达水平均显著上调上调倍数分别达.和.倍(图)分别将 和 基因的启动子片段克隆到 载体的()基因上游得到重组载体 和 经根癌农杆菌介导烟草叶片瞬时表达后在 处理 时 和 转化的烟草叶片 染色程度较转空载明显加深(图)这说明 和 基因及其启动子都能够响应盐胁迫诱导基因表达水平明显增强./干扰或过表达大豆发根组合植株耐盐性分析在正常培养条件下转空载、/、和 大豆发根组合植株的生长表型、植株鲜重、叶片、叶绿素含量、根和叶 和 含量均无明显差异(图)经 处理 后上述 种大豆材料的生长均受到明显抑制其中/植株受盐害最严重植株表现矮小叶片干枯发黄植株鲜重、叶片 和叶绿素含量都显著低于转空载植株根和叶 和 含量均显著升高而 和 植株生长相对较好在植株表型和鲜重、叶片、叶绿素含量、以及 含量等生理指标方面均显著优于/植株(.)且已恢复到转空载植株的水平其中 植株部分指标如叶片叶绿素含量、根 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 /基因及其编码蛋白氨基酸序列特征 /.基因结构.氨基酸序列多重对齐和保守结构域:跨膜结构域:胱硫醚合成酶结构域.:.及 含量已明显优于转空载植株(图、)此外正常培养条件下 种大豆植株根和叶的、和 活性均无明显差异但经 处理 时与对照相比上述植株根和叶的抗氧化酶活性均显著增强其中/植株增幅最小并显著低于转空载、和 植株(图)盐胁迫下 和 植株根和叶、和 活性均明显高于转空载植株其中 植株根和叶 及根 活性都显著高于转空载植株(图)在 处理下与对照相比上述 种大豆植株根、茎和叶 含量均显著上升含量则显著下降其中/植株根、茎、叶 含量的升幅或 含量降幅表现最明显而 和 植株则维持在 含量低于或 含量高于转空载植株的水平 这就导致盐处理下/植株根、茎和叶/值显著上升而 和 植株根、茎和叶/值明显下降其中 植株叶/值降幅最大较转空载植株降低了.(图)盐处理也导致上述 种大豆植株根、茎和叶 含量显著增加含量显著降低 其中/植株 含量增幅和 含量降幅均最大这就导致其根、茎和叶/值显著增大与转空载植株相比 和 植株根、茎和叶 含量均明显降低含量变化虽不明显但它们根、茎和叶/值也表现明显下降(图).过表达/拟南芥耐盐性分析利用根癌农杆菌介导的浸花法转化拟南芥通过喷洒 草铵膦溶液获得抗性植株提取抗性植株叶片 进行 鉴定最终分别获得过表达 或 基因的拟南芥 和(图 )收获并鉴定 代纯合子进行试验 在正常培养条件下拟南芥、第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能图 /基因及其启动子对盐胁迫的响应模式 /.处理、的大豆幼苗叶片中/基因的表达变化.盐胁迫下/启动子转化烟草 组织化学染色 不同字母表示同一处理在不同处理时间差异显著(.)下同././.(.).和 的种子萌发率未见明显差异 时都可达 左右在 或 处理下上述 种拟南芥材料的萌发率都明显下降 时 萌发率仅分别为.和.但过表达材料特别是 可维持相对于 较高的萌发率 时可分别达到.和.(图)正常培养 的 种拟南芥幼苗的根长无明显差异在 或 处理下 和 幼苗的根长均明显大于 特别是 处理下上述过表达材料根长分别是 的.和.倍且差异显著(图)类似的现象也出现在盆钵土培过表达拟南芥植株中尤其是 植株在盐处理下的伤害症状相对较轻具体可体现在植株表型差异和植株鲜重、叶片、叶绿素含量、和 含量等指标的变化较小(图、)此外盐处理也导致拟南芥、和 植株地上部有关的抗氧化酶(、和)活性都明显上升 和 植株的升幅明显高于(图)进一步分析盐胁迫下拟南芥、和 拟南芥植株根和地上部、含量以及/、/值的变化发现盐处理导致植株根和地上部 和 含量显著增加其中地上部尤其明显和 含量明显下降其中 和 植株根和地上部 和含量低于 而相应的 和 含量则高于 这就导致根和地上部/、/值均显著低于 植株(图)在上述变化中 植株都表现更明显(图 图)南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 盐胁迫对 和/大豆发根组合植株表型和生理指标的影响 /.生长表型.单株鲜重、叶片相对含水量和叶绿素含量.根和叶相对电解质渗漏率和丙二醛含量.抗氧化酶(、和)活性.().讨论与结论在植物体内主要以离子形式存在的 被认为是高等植物生长和发育所必需的重要微量营养元素之一可参与光合作用、细胞膨压和电荷平衡、气孔运动及抑制植物病害等过程 盐胁迫下过量积累和 所导致的离子毒害是构成植物盐害的重要因素但两者的毒害机制不同 从对光合作用的抑制效应角度来看前者主要是通过促进叶绿素降解和 电子传递效率下降以及叶绿体活性氧大量积累所引起的氧化损伤等后者则通过抑制、等营养元素的吸收以及降低气孔导度等 此外 第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能图 盐处理下 和/大豆发根组合植株根、茎、叶中离子含量的变化 /是植物组织和细胞中除 外的主要矿质阴离子之一从盐胁迫下阴离子毒害的角度如何维持或调节盐胁迫下植株体内积累过量的 和基本生长所需的 间的比例是决定植物表现盐害还是产生适应性的重要因素 在细胞水平上如主动向细胞外排 或进行细胞内(如液泡)区域化分配以及器官(如根、茎、叶或地上部)水平上的 转运和再分配实现植物体内、等阴离子稳态是其抵抗盐分胁迫和提高耐盐性的一种重要生理策略 拟南芥 或 突变体幼苗在 胁迫下盐敏感性增强主要与地上部积累 显著多于野生型有关 在生长介质中增加 水平可降低盐胁迫下植株叶片 含量减轻植物盐害程度/关系的重要性甚至可与制约植物耐盐性的/选择性相当 等最新研究表明盐生植物高碱蓬叶中 基因的表达水平受高浓度(和 )诱导显著上调生物信息学分析并结合酵母突变体互补试验可表明其/逆向转运体的蛋白属性 不过 等研究表明 在正常培养的拟南芥幼苗各器官中的表达水平相对较低 胁迫下该基因突变体 植株体内、含量与 相比未见明显差异 本研究中与拟南芥 第亚家族 的同源基因 和 两者尽管基因全长不同但是基因结构类似(内含子/外显子数目相同)且所编码蛋白的氨基酸序列一致性高达.由此可推测它们之间可能存在功能冗余 等研究结果显示栽培和野生大豆 基因家族成员中正常培养或盐处理条件下 和 基因在植株叶中的表达水平都明显高于根和茎 栽培大豆植株叶 和 基因及其启动子都能够响应盐胁迫诱导基因表达水平明显上调 我南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 盐处理下过表达/拟南芥种子萌发率和幼苗根长的变化 /.过表达/基因拟南芥筛选和 鉴定.和含 的 培养基上种子萌发率.和含 的 培养基幼苗的根长./.们对 和 基因启动子区的顺式作用元件进行分析后发现两者都含有比较丰富的 类顺式作用元件但 类顺式作用元件仅在 中较多存在 中未发现类顺式作用元件在 中也明显多于(未发表资料)、和 等都是植物在响应盐胁迫等逆境过程中发挥特定作用的重要顺式作用元件推测 和 基因在盐胁迫大豆叶和根中表达响应的差异可能与之有关栽培大豆 和 除含有 蛋白家族典型的跨膜结构域和 结构域外也同样具有()、()和()保守基序以及 个保守谷氨酸残基位点(和)其中和 同时存在表明 和 蛋白的阴离子/属性 此外一般认为植物、细菌、酵母和动物 蛋白家族的保守区()中的 氨基酸残基可决定该蛋白主要转运离子的种类即若为(脯氨酸)优先转运 若为(丝氨酸)则优先转运 由/蛋白保守区()的存在推测/蛋白对 较 具有优先转运特性 不过本研究发现:在盐胁迫下采用发根农杆菌介导的发根转化技术获得的/大豆植株受害最严重根、茎、叶 含量较转空载植株明显上升含量显著下降导致根、茎和叶特别是地上部/值显著增加而发根过表达大豆植株或转基因拟南芥幼苗/表型相反根和地上部 含量明显降低含量明显上升导致根和地上部特别是后者/第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能图 盐胁迫对过表达/基因拟南芥植株表型()和生理指标(、)的影响 ()()/图 盐处理下过表达/基因拟南芥根和地上部离子含量的变化 /.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷值显著下降 此外/过表达大豆或拟南芥植株不同部位的/值也相应下降抗氧化酶(、和)活性也都明显增强 在上述变化中过表达 植株表现更明显 这似乎暗示/蛋白对 较 具有优先转运特性与上文有关生物信息学分析的理论预测或早期研究者通过膜片钳技术在动物细胞上的体外检测结果并不相符可见 家族成员在植物体内阴离子吸收及转运方面的优先选择性还需进一步验证 等报道玉米 基因转录水平在冷、干旱、盐和热胁迫以及 和 处理后都上调转 基因拟南芥则对寒冷、干旱和盐胁迫的耐受性增强盐胁迫下植株根中 含量显著低于 等发现 突变体植株体内 和 含量几乎不受影响这可能与拟南芥 家族其他成员如 的替代功能有关 本课题组前期研究表明源于野生大豆的 发根过表达大豆植株盐胁迫下可通过增加 在根中的积累降低向地上部的转运同时增加 在根、茎和叶中的积累以维持植株各部位特别是地上部更低的/值来缓解盐害综合来看/与 在大豆发根或拟南芥幼苗中过表达时都可通过增强盐胁迫下植株根和地上部 含量以维持植株根和地上部特别是后者较高的 水平和较低的/值从而增强植株的耐盐性 在对盐胁迫下植株体内 含量的协同吸收和转运控制方面/与 可能略有不同前者可降低根部对 的吸收和向地上部的转运而后者则可增加 在根部的积累并减少向地上部的转运 本研究中/基因可通过调节盐胁迫下 和 在植株根和地上部(茎和叶)等不同器官的吸收和转运进而维持不同器官特别是地上部较低的/值参与其盐胁迫适应过程 这可为今后进一步综合利用大豆 基因家族资源深入开展大豆或其他作物耐盐性的分子机制研究及培育耐盐种质新材料提供新的工作思路/基因参与大豆盐胁迫应答过程所发挥的具体功能可能还涉及其他 基因家族成员的协同机制这有待今后深入探究参考文献:.():.:.:.於丙军刘振卫培培.基于盐逆境下植物 同源基因的发掘和功能解析的研究进展.南京农业大学学报():.:./.():()./.:./.():.:.:.:.():.:./.:.().:.:.:.第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能 ./.:.():.().:.:.():.().:.:.:.:.:.:.:./.:.:.:.():.:.:.():.()(.).:./:.:.():.责任编辑:刘怡辰