从炎症机制探讨Notch通路抑制剂对小鼠脑缺血模型的神经保护作用.pdf

论著607脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期18Frullanti E,Papa FT,Grillo E,et al.Analysis of the phenotypes inthe Rett networked databaseJ.Int J Genomics,2019,2019:6956934.19Artuso R,Mencarelli MA,Polli R,et al.Early-onset seizure variantof Rett syndrome:definition of the clinical diagnostic criteriaJ.Brain Dev,2010,32(1):17-24.20Saitsu H,Osaka H,Nishiyama K,et al.A girl with early-onsetepileptic encephalopathy associated with microdeletion involvingCDKL5J.Brain Dev,2012,34(5):364-367.21Jakimiec M,Paprocka J,Smigiel R.CDKL5 deficiency disorder-Acomplex epileptic encephalopathyJJ.Brain Sci,2020,10(2):107.22Mei D,Marini C,Novara F,et al.Xp22.3 genomic deletions involvingthe CDKL5 gene in girls with early onset epileptic encephalopathyJ.Epilepsia,2010,51(4):647-654.23Melani F,Mei D,Pisano T,et al.CDKL5 gene-related epilepticencephalopathy:electroclinical findings in the first year of lifeJJ.DevMed Child Neurol,2011,53(4):354-360.24 Melikishvili G,Epitashvili N,Tabatadze N,et al.New insightsin phenomenology and treatment of epilepsy in CDKL5encephalopathyJJ.Epilepsy Behav,2019,94:308-311.25 Velisek L,Jehle K,Asche S,et al.Model of infantile spasms inducedby N-methyl-D-aspartic acid in prenatally impaired brainJJ.AnnNeurol,2007,61(2):109-119.（收稿日期：2 0 2 2-0 9-2 0）从炎症机制探讨Notch通路抑制剂对小鼠脑缺血模型的神经保护作用刘捷钱爱丽刘桂阳孙菁妮李严霜【摘要】目的探讨Notch通路抑制剂对小鼠脑缺血模型的神经保护作用。方法7 8 只成年BALB/c小鼠按简单随机抽样方法分为Sham组、二甲基亚砜（DMSO）组、-分泌酶抑制剂（DAPT）组，每组2 6 只；线栓法制作小鼠脑缺血模型，其中Sham组小鼠接受相同手术，但未插人缝线；DAPT组小鼠在大脑中动脉闭塞前3h腹腔注射DAPT溶液（5mLkg），Sh a m组、二甲基亚砜（DMSO）组小鼠注射等剂量DMSO溶液，将Longa评分1 3分的小鼠作为实验小鼠；应用尼氏染色及TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色鉴定右额叶皮质神经元，免疫荧光检测缺血半脑右半脑皮质Notch1、胶质纤维酸性蛋白（CFAP）阳性细胞，Western-blot检测缺血半脑右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达，透射电镜观察各组右额叶皮质神经元超微结构变化，ELISA检测右前额叶皮质白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-）水平。结果与Sham组比较，DMSO组、DAPT组皮质神经元存活数显著下降，皮质神经元调亡数显著上升（P0.05）；与DMSO组比较，DAPT组皮质神经元存活数显著上升，皮质神经元调亡数显著下降（P0.05）；与Sham组比较，DMSO组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著上升（P0.05），D A PT 组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著下降（P0.05），D A PT 组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著低于DMSO组（P0.05）；与Sham组比较，DMSO组、DAPT组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达显著高于Sham组（P0.05），D A PT 组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达显著低于DMSO组（P 0.0 5）；Sh a m组小鼠梗死周围皮质神经元超微结构正常，线粒体内外结构正常；DMSO组小鼠神经元细胞核形状欠规则，核膜欠清晰，核周间隙扩大，染色质欠均匀呈聚集状，胞质内可见空泡，线粒体肿胀，线粒体内外嗜被破坏；DAPT组神经元超微及线粒体内外结构接近正常；与Sham组比较，DMSO组、DAPT组右前额叶皮质IL-6、T NF-因子水平显著上升（P0.05），但DAPT组右前额叶皮质IL-6、TNF-因子水平显著低于DMSO组（P0.05）。结论Notch通路抑制剂的应用可阻断脑缺血后Notch信号通路传导，通过抑制Notch1及其下游Hes1蛋白、Hes5蛋白表达，下调IL-6、T NF-水平来发挥神作者单位：2 50 0 0 0 山东，济南市第四人民医院康复医学科（刘捷、孙菁妮），感染管理办公室（钱爱丽），神经外一科（刘桂阳）；山东第一医科大学附属中心医院神经内科（李严霜）通信作者：李严霜，Email：l y a n s h 16 3.c o m608脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期经元保护作用，值得临床重视。【关键词】-分泌酶抑制剂；小鼠；脑缺血模型；神经保护；炎症机制中图分类号：R651.1文献标识码：A文章编号：10 0 6-351X（2 0 2 3）10-0 6 0 7-0 7The neuroprotective effect of notch pathway inhibitors on cerebral ischemia in mice from the mechanism ofinflammationLiu Jie,Qian Aili,Liu Guiyang,Sun Jingni,Li YanshuangDepartment of Rehabilitation Medicine,Jinan Fourth Peoples Hospital,Shandong 250000,ChinaCorresponding author:Li Yanshuang,Email:Abstract Objective To investigate the neuroprotective effect of Notch pathway inhibitors on cerebralischemia in mice based on the mechanism of inflammation.Methods By simple random sampling method78 adultBALB/c mice were divided into Sham group,Dimethylsurfoxide(DMSO)group,-glucodenase inhibitor(N-N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl)-s-phenylglcine t-butyl ester,DAPT)group,with 26 mice in each group;Themodel of cerebral ischemia in mice was established by thread embolism mice in the Sham group received the sameoperation but no suture was inserted;mice in DAPT group were intraperitoneally injected with DAPT solution(5mL kg)3 hours before middle cerebral artery occlusion,and mice in Sham group and Dimethyl sulfoxide(DMSO)group were intraperitoneally injected with equal dose of DMSO solution.Mice with Longa score of 1 to 3 were selectedas experimental mice;the neurons of the right frontal cortex were identified by Nigner staining and TUNEL/NeuNimmunofluorescent staining.Positive cells of Notchl,glial fibrillary protein(GFAP)after ischemia in the right cerebralcortex were detected by immunofluorescence.The expression of Hesl and Hes5 proteins in the right cerebral cortexwas detected by Western-blot,and the ultrastructural changes of neurons in the right frontal cortex were observed bytransmission electron microscopy.The levels of interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor(TNF-)in the rightprefrontal cortex were measured by ELISA.Results Compared with Sham group,the survival number of corticalneurons in DMSO and DAPT groups significantly decreased,and the apoptosis number of cortical neurons significantlyincreased(P0.05);Compared with DMSO group,the survival number of cortical neurons in DAPT group significantlyincreased,while the apoptosis number of cortical neurons significantly decreased(P 0.05);Compared with Shamgroup,the number of Notchl and CFAP positive cells in DMSO group significantly increased(P 0.05),and thenumber of Notch1 and GFAP positive cells in DAPT group significantly decreased(P 0.05).The number of Notch1and GFAP positive cells in DAPT group was significantly lower than that in DMSO group(P 0.05);Compared withSham group,the expressions of Hesl protein and Hes5 protein in right cerebral cortex in DMSO group and DAPTgroup were significantly higher than those in Sham group(P 0.05),while the expressions of Hesl protein and Hes5protein in right cerebral cortex in DAPT group were significantly lower than those in DMSO group(P O.05);in Shamgroup,the ultrastructure of neurons in the cortex around infarction was normal,and normal mitochondrial and inner andouter crists;In DMSO group,the shape of the neurons nuclei was irregular,the nuclear membrane was unclear,theperinuclear space was enlarged,the chromatin was uneven and clustered,the vacuoles were visible in the cytoplasm,the mitochondria were swollen,and the mitochondrial internal and external cristae were destroyed;the ultrastructureand posterior ridge structure in mitochondria in DAPT group were close to normal;compared with Sham group,thelevels of IL-6 and TNF-in right prefrontal cortex in DMSO and DAPT groups significantly increased(P 0.05),but the levels of IL-6 and TNF-in right prefrontal cortex in DAPT group were significantly lower than those inDMSO group(P 0.05).Conclusion The application of Notch pathway inhibitors can block the conduction of Notchsignaling pathway after cerebral ischemia,and play a neuronal protective role by inhibiting the expression of Notch1and its downstream Hes1 and Hes5 proteins,and down-regulating the levels of IL-6 and TNF-,which is worthy ofclinical attention.Key words-secretase inhibitor;Mice;Cerebral ischemia model;Neuroprotection;Mechanism ofinflammation脑缺血患者缺血半暗带区程序性细胞调亡和炎症反应参与脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤，也是脑缺血患者经溶栓等再灌注治疗后预后不良的重要机制 1-2 。脑缺血是以脑部缺血损伤症状609脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期为主要临床表现的疾病，其疾病发生进展涉及多条信号通路的调控，如Notch通路，作为一个进化保守的信号通路，其参与神经元增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，是重要的自适应信号通路 3-5。Notch信号的经典生物学效应是通过Notch受体与其配体之间的相互作用来介导的，Notch受体与配体之间的相互作用来释放细胞内的Notch区域，进而形成转录激活复合物来调控依赖于Notch的基因表达，如Notch1信号通路下游相关蛋白Hes1和Hes5、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,CFAP）6-7 。既往研究证实Notch通路可通过抑制炎症和调亡来保护肾脏免受I/R损伤 8 ，但无直接证据表明Notch通路参与GFAP、H e s 1和（或）Hes5蛋白表达对脑I/R损伤的保护作用。基于此，本研究拟初步探究Notch通路抑制剂在脑组织I/R损伤小鼠模型中的神经保护作用及其可能机制，为脑血管疾病的防治提供新的策略。材料与方法1.实验动物实验动物为成年BALB/c小鼠，体质量2 4.0 26.0g，9 w 龄，SPF级，共7 8 只，所有小鼠均常规饲养于SPF级动物房，恒温恒湿，12 h/12h夜循环条件，确保食物及水源充足。实验动物由山东第一医科大学附属中心医院实验室提供。2.试剂与仪器尼氏染色液（Aspen，美国），TUNEL试剂盒（R o c h e，瑞士），NeuN鼠抗（Abcam，美国），CY3标记山羊抗小鼠（Aspen，中国）4，6-二基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole,DAPT）（A s p e n，中国），乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraaceticacid，ED T A）抗原修复缓冲液（江莱生物，中国），即用型山羊血清工作液（博士德，中国），Notchl抗体、GFAP抗体（GeneTex，美国），鼠源二抗稀释液（Abcam，美国），十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegelelectrophcresis，SD S-PA G E）制备试剂盒（康润，中国），RIPA裂解液（RIPALysisBuffer）（新赛美，中国），PMSF（A PEx BIO，美国），BCA蛋白定量试剂盒（普利莱，中国），蛋白Marker（A b c a m，美国），聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜（赛默飞世尔，中国），抗Hesl、抗Hes5抗体、碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠二抗（艾美捷，中国），电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）试剂盒（泰新，中国），显微镜（CarlZeiss，德国），荧光显微镜（OlympusCorporation，日本），HT7700投射电镜(Hitachi，日本)。3.动物模型构建小鼠腹腔内注射10%（w/v）水合氯醛5mLkg麻醉，固定于手术台上，双侧颈总动脉经颈中线切口显露，与颈动脉鞘及迷走神经分离；将右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉暴露分离；用微型血管钳临时夹住颈内动脉；颈总动脉分叉处3 4mm处有小切口；制作2.0 cm尼龙缝线（直径0.16 0.0 2 mm)，针尖向颈内动脉加热成圆形，直至闭合大脑中动脉原点，脑缺血9 0 min后取出线栓。在所有的手术和术后程序中，小鼠体温均维持在37，直至小鼠恢复知觉；麻醉恢复后，所有小鼠SPF级动物房饲养，自由获得食物和水。4.实验动物分组72只成年BALB/c小鼠按简单随机抽样方法分为Sham组、二甲基亚砜(dimethylsurfoxide,DMSO)组、-分泌酶抑制剂（N-N-（3,5-d i f l u o r o p h e n a c e t y l）-1-alanyl)-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT组三组,每组2 6 只。Sham组小鼠接受相同手术，但未插人缝线；DAPT组小鼠在大脑中动脉闭塞前3h腹腔注射DAPT溶液（5mLkg），Sh a m组、DMSO组小鼠注射等剂量DMSO溶液。取材前由一名不了解各组情况的观察者对小鼠进行Longa评分，Longa评分13分的小鼠作为实验小鼠，造模失败或死亡造成不足预定动物数量组别按随机抽样原则补足。5.尼氏染色鉴定神经元及TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色每组随机取6 只小鼠，造模成功后2 4h后应用10%水合氯醛过量麻醉，暴露心脏后剪开右心耳，经左心室灌注生理盐水2 0 0 ml+4%多聚甲醛2 0 0 ml，断头去脑，打开颅骨剥除脑膜取出完整脑组织4%多聚甲醛将脑组织固定2 4h以上，手术刀将目的部位组织修平整后制成4m厚的切片。取右额叶皮质石蜡切片常规脱蜡、水洗后置于6 0 尼氏染色液染色40 min，蒸馏水水洗3次，单次水洗时长1 2 min，95%乙醇分化至细胞颗粒清晰可见，时长约5min，再脱水、晾干，中性树胶封片，2 0 0 显微镜下拍照，并对尼氏染色神经元进行计算。另将右额叶皮质石蜡切片至6 5烘箱2 h，脱蜡至水，EDTA缓冲液微波修复，3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶；5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭2 0 min，去除BSA液，每张切片加人50 1稀610脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期释的一抗（NeuN,1:150）覆盖组织，4过夜；每张切片加50 l1001相应种属的二抗（CY3标记山羊抗小鼠，1:50），37 孵育50 min；按片子数量及组织切片大小取TUNEL试剂盒内适量试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）按1：9 比例混合，加至圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 水浴锅孵育6 0 min；取出切片后PBS缓冲液冲洗3次，单次5min，去除PBS液，每张切片加50 10 0 1DAPI，室温避光孵育5min，染色后将切片置于PBS缓冲液冲洗3次，单次5min，滴加适量抗荧光淬灭剂于组织切片，盖玻片封片后于2 0 0 荧光显微镜下随机选取皮质半暗带缺血区内四个不重叠的视野，计算神经元细胞凋亡率【神经元凋亡数（红色+绿色荧光标记）神经元细胞数（红色荧光标记）10 0%。6.免疫荧光单标法检测缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P 阳性细胞每组随机取6 只小鼠，取缺血半脑右半脑皮质组织切片，6 0 烘箱烤片15min，而后依次二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、3%H,02消除内源性过氧化物酶、抗原修复液微波加热进行抗原修改后滴加即用型山羊血清工作液，38 烘箱封闭1h，依次孵育一抗 Notch1抗体稀释液（1：10 0）、二抗（鼠源二抗稀释液（1:10 0），最后核标记，抗荧光淬灭剂封片，倒置显微镜下观察并拍片；免疫荧光单标法检测缺血半脑右半脑皮质GFAP参考上述方法，将一抗换为GFAP抗体稀释液夜(1:10 0)。7.Western-blot检测缺血半脑右半脑皮质Hesl、Hes5蛋白表达情况每组随机取6 只小鼠，水合氯醛过量麻醉后经心脏快速灌注4%多聚甲醛150 ml+2.5%戊二醛150ml，取缺血半脑右半脑皮质组织，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）+R IPA 裂解液（RIPALysisBuffer）混合液匀浆，进行BCA蛋白浓度检测，依据蛋白浓度选择上样量，依次SDS-PAGE凝胶电泳、PVDF转膜，非特异性封闭；加人一抗抗Hes1（1:10 0 0）抗Hes5（1:10 0 0）4冰箱孵育过夜，再加入碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠二抗（1:50 0 0）室温孵育6 0 min，等渗缓冲盐溶液（T r i s-Bu f f e r e d Sa li n e T w e e n-2 0,T BST）洗涤后ECL显影，胶片定影，SuperSignalWestFemto系统（美国Pierce公司）观察免疫反应带，Quantity One对SDS-PACE结果进行统计分析。8.透射电镜观察各组右额叶皮质神经元超微结构变化每组随机处死2 只小鼠，水合氯醛过量麻醉后经心脏快速灌注4%多聚甲醛150 ml+2.5%戊二醛150ml，开颅取1mm1mm1mm脑梗死病灶周围皮质组织，将脑梗死病灶周围皮质组织常规固定、脱水、包埋后进入胶囊固化，而后进行定位切片，将组织切成薄片后甲苯胺蓝染色，光学显微镜下定位，体视显微镜下修块标记，UC7型超薄切片机切成1.0 m半薄切片，置于干净载玻片，6 0 烤干，UC7型超薄切片机切成7 0 nm厚切片制作铜网。将切片用醋酸双氧铀染色10 min，蒸馏水清洗3次，滤纸条吸去多余水，自然干燥后转人枸橡酸铅染液15min，结束后0.01M氢氧化钠溶液洗涤，蒸馏水清洗3次后用滤纸条吸去多余水，自然干燥后电镜观察；每个标本制作一张铜网，铜网根据斜线移动，自左上角至右下角方向移动，HT7700投射电镜（HitachiJapan）随机拍摄10 张照片，观察神经元形态及超微结构。9.ELISA检测右前额叶皮质白细胞介素6（i n t e r l e u k i n-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，T NF-）水平实验结束后每组随机取6 只小鼠，10%水合氯醛过量麻醉处死小鼠后取右前额叶皮质组织置入液氮，-8 0 冰箱保存；参照ELISA试剂盒说明书，应用全自动生化分析仪检测右前额叶皮质IL-6，TNF-因子水平，酶标仪在450 nm测定光吸收值，每个样本间检测一次，按曲线方程计算各样本IL-6、TNF-浓度。10.统计学方法采用SPSS24.0统计分析软件。尼氏染色、TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色等实验结果以xs表示，单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1.三组小鼠尼氏染色和TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色结果比较（表1、图1）表1三组小鼠尼氏染色和TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色结果比较（n=6，x s）组别皮质神经元存活数（%）皮质神经元调亡数（%）Sham 组280.27 37.663.61 1.02DMSO组75.34 8.02a144.85 26.17aDAPT组176.54 25.36ab50.63 10.62abF88.908116.579P0.0000.000注：与Sham组比较，*P0.05；与DMSO组比较；P0.05美2611脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期A400B200（%）（%）300-150-ab200100-100-50Sham组DMSO组DAPT组Sham组DMSO组DAPT组A：皮质神经元尼氏染色检测结果B：皮质神经元调亡TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色检测结果n=6；与Sham组比较，P0.05；与DMSO组比较，bP0.05图1三组小鼠尼氏染色和TUNEL/NeuN免疫荧光双标染色结果比较三组皮质神经元存活数、皮质神经元调亡数比较差异有统计学意义（P0.05）；与Sham组比较，DMSO组、DAPT组皮质神经元存活数显著下降，皮质神经元凋亡数显著上升（均P0.05）；与DMSO组比较，DAPT组皮质神经元存活数显著上升，皮质神经元凋亡数显著下降（均P0.05）。2.免疫荧光检测缺血半脑右半脑皮质Notch1、GFAP阳性细胞（表2、图2）免疫荧光检测缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞（n=6,xs)组别Notch1阳性细胞（%）GFAP阳性细胞（%）Sham 组0.64 0.0325.73 2.84DMSO组0.98 0.05a47.25 2.73aDAPT组0.42 0.04b18.24 2.65abF286.560181.109P0.0000.000注：与Sham组比较，P0.05；与DMSO组比较，p0.05A1.5B60（%）a1.0-40-ab0.5-20-0.0Sham组DMSO组DAPT组Sham组DMSO组DAPT组A：缺血半脑右半脑皮质Notch1阳性细胞检测结果B：缺血半脑右半脑皮质GFAP阳性细胞检测结果n=6；与Sham组，P0.05；与DMS0组比较，p0.05图2免疫荧光检测缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞三组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞差异有统计学意义（P0.05）；与Sham组比较，DMSO组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著上升（P0.05），D A PT 组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著下降（P 0.0 5），D A PT 组缺血半脑右半脑皮质Notch1、GFAP阳性细胞数显著低于DMSO组（P0.05）。3.Western-blot检测缺血半脑右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达情况（表3、图3）表3Western-blot检测缺血半脑右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达情况（n=6，s）组别Hes1蛋白Hes5蛋白Sham组0.320.090.19 0.04DMSO组0.77 0.10a0.33 0.04aDAPT组0.48 0.10ab0.25 0.03abF33.33121.659P0.0000.000注：与Sham组比较，P0.05；与DMSO组比较；pP0.05A1.07B0.410.8ab0.30.60.2-0.40.20.10.00.0-Sham组DMSO组DAPT组Sham组DMSO组DAPT组A：缺血半脑右半脑皮质Hes1蛋白检测结果B：缺血半脑右半脑皮质Hes5蛋白检测结果n=6；与Sham组比较，“P0.05；与DMSO组比较，P0.05图3Western-blot检测缺血半脑右半脑皮层Hes1蛋白、Hes5蛋白表达三组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达差异有统计学意义（P0.05）；与Sham组比较，DMSO组、DAPT组右半脑皮质Hesl蛋白、Hes5蛋白表达显著高于Sham组（q=11.389、4.0 50、9.2 7 6、3.9 7 6,均P0.05），D A PT 组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达显著低于DMSO组，差异有统计学意义(q=7.3540、5.30 1,均 P0.05)。4.透射电镜观察各组右额叶皮质神经元超微结构变化（图4)BSham组DMSO组DAPT组A：Sh a m 组右额叶皮质神经元超微结构变化；B：D M SO 组右额叶皮质神经元超微结构变化；C：D A PT 组右额叶皮质神经元超微结构变化图4电镜下小鼠脑梗死灶周围皮质神经元超微结构（7 0 0 0，bar=lm，Nm：核膜；Ch：染色质；Mi：线粒体；Vc：空泡）Sham组小鼠右额叶皮质神经元超微结构正常，胞浆丰富，细胞核大且圆，核膜光滑清晰，染色质均匀，线粒体内外结构正常；DMSO组小鼠神经元细胞核形状欠规则，核膜欠清晰，核周间隙扩大，染色质欠均匀呈聚集状，胞质内可见空泡，线粒体肿胀，线粒体内外被破坏；DAPT组神经元超微结构接近正常，胞浆较丰富，几乎未见空泡，细胞612脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第10 期核核膜较清晰，染色质较均匀，聚集现象相对少见，线粒体内外结构接近正常。5.ELISA检测右前额叶皮质IL-6、T NF-因子表达水平（表4、图5）表4ELISA检测右前额叶皮质IL-6、T NF-因子表达水平(n=6,xs)组别IL-6(ng L-)TNF-(ng L)Sham 组36.71 6.121.47 0.17DMSO组129.44 15.03a2.91 0.46aDAPT组70.45 12.61ab1.93 0.16abF93.87836.591P0.0000.000注：与Sham组比较，*P0.05；与DMSO组比较，bp0.05AB200471503-(7/6u)9-71(7/Bu)D-Nab100-ab250Sham组DMSO组DAPT组Sham组DMSO组DAPT组A：右前额叶皮质IL-6检测结果B：右前额叶皮质TNF-检测结果n=6；与Sham组比较，P0.05；与DMSO组比较，bp0.05图5ELISA检测右前额叶皮质IL-6、T NF-因子表达水平各组小鼠右前额叶皮质L-6、T NF-因子水平差异有统计学意义（P0.05），与Sham组比较，DMSO组、DAPT组右前额叶皮质IL-6、T NF-因子水平显著上升（均P0.05），但DAPT组右前额叶皮质IL-6、T NF-因子水平显著低于DMSO组，差异有统计学意义（P0.05）。讨论Notch是高度保守的跨膜受体蛋白家族，研究证实 9 ，中枢神经系统Notch1表达较高，并参与细胞亡调控及成人神经元突触的可塑性调节，但其对脑缺血后细胞凋亡的影响机制尚未明确。炎症反应在缺血性脑卒中疾病发生及病理进展中扮演重要角色，当脑缺血发生后引起损伤级联反应，其中炎症反应过程中，白细胞异常聚集于损伤局部，诱导其他炎症递质及黏附分子表达，加重局部炎症损伤10 。本研究构建小鼠脑缺血模型，以炎症机制为入口，通过抑制Notch1信号递质神经元调亡数比较差异有统计学意义；与Sham组比较，DMSO组、DAPT组皮质神经元存活数显著下降，皮质神经元调亡数显著上升；与DMSO组比较，DAPT组皮质神经元存活数显著上升，皮质神经元调亡数显著下降。由此可见，抑制Notch1信号通路表达可减少脑缺血小鼠皮质神经元凋亡，更利于皮质神经元存活，减轻脑损伤。Liang等 构建I/R损伤的体内模型，结果证实DAPT抑制剂可通过阻断Notch1信号通路传导发挥神经保护作用，这与本研究结论相似。本实验中，与Sham组比较，DMSO组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著上升，DAPT组缺血半脑右半脑皮质Notch1、G FA P阳性细胞数显著下降，DAPT组缺血半脑右半脑皮质Notch1、CFA P阳性细胞数显著低于DMSO组。由此可见，脑缺血小鼠缺血半脑右半脑皮质存在Notch1、GFAP异常高表达现象，Notch1信号通路抑制剂的应用可明显抑制Notch1、G FA P异常高表达。Hes1、Hes5是Notch1信号通路的下游因子，前者是影响细胞增殖分化的下游因子，后者则是前神经碱性螺旋环螺旋基因（basic/Helix-Loop-Helix,bHLH）结构的转录因子，主要参与神经干细胞增殖分化 12-13。本研究中，三组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达差异有统计学意义；与Sham组比较，DMSO组、DAPT组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白显著升高。分析可能与脑缺血发生后机体内源性激活Notch1信号通路，上调Hes1蛋白、Hes5蛋白表达有关，当Notchl信号通路激活、Hesl蛋白、Hes5蛋白表达上调后抑制神经干细胞向神经元分化 14。但DAPT组右半脑皮质Hes1蛋白、Hes5蛋白表达显著低于DMSO组，分析其原因，DAPT可特异性阻断-分泌酶活性的Notch信号通路，抢占早老蛋白（Pr e s e n i l i n,PS）中Notch受体水解位点，阻断Notch受体胞内段水解，下调Hes1蛋白、Hes5蛋白表达，促进神经干细胞向神经元转化，而神经元又利于受损脑组织修复，最终发挥神经保护作用 15。采用透射电镜观察各组右额叶皮质神经元超微结构变化也证实上述结论，Sham组小鼠梗死周围皮质神经元超微结构及线粒体内外结构正常；但DMSO组小鼠神经元细胞核形状欠规则，核膜欠清晰，核周间隙扩大，染色质欠均匀呈聚集状，胞质内可见空泡，线粒体肿胀，线粒体内外被破坏；DAPT组神经元超微结构及线粒体内外结构则接近正常，这也进一步印证了N