SN∕T 3560-2013 国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 国境口岸黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狀 犵犿 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犢 犲 犾 犾 狅 狑犳 犲 狏 犲 狉狏 犻 狉 狌 狊、犇 犲 狀 犵 狌 犲狏 犻 狉 狌 狊、犆 犺 犻 犽 狌 狀 犵 狌 狀 狔 犪狏 犻 狉 狌 狊、犠 犲 狊 狋犖 犻 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊犫 狔犿 狌 犾 狋 犻 狆 犾 犲 狓狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 犮 犲犚 犜 犘 犆 犚犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国上海出入境检验检疫局、 中华人民共和国广东出入境检验检疫局、 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 田桢干、 郑夔、 李强、 孙立新、 黄吉城、 章琪、 李平、 曹敏、 贾巍、 何宇平、 张显光、卢钟山。犛 犖犜 国境口岸黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法范围本标准规定了国境口岸黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的多重实时荧光 检测方法检验的对象、 检测方法、 程序及结果报告。本标准适用于国境口岸入出境人或蚊类携带黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的实验室快速筛查检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 临床诊断中聚合酶链反应（ ） 技术的应用缩略语下列缩略语适用于本文件。实时荧光 ： 实时荧光反转录聚合酶链反应 值： 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 ： 荧光染料， 一种荧光报告基团 ： 荧光染料， 一种荧光报告基团 ： 荧光染料， 一种荧光报告基团 ： 荧光染料， 一种荧光报告基团 ： 黑洞淬灭基团 ： 锁核苷酸术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 黄热病毒犢 犲 犾 犾 狅 狑犳 犲 狏 犲 狉狏 犻 狉 狌 狊属于黄病毒科黄病毒属成员， 为 病毒， 是引起人类黄热病的病原体。传播媒介为蚊虫。 登革病毒犇 犲 狀 犵 狌 犲狏 犻 狉 狌 狊属黄病毒科黄病毒属， 包括、四种血清型， 是有包膜的单股正链 病毒。登革病毒犛 犖犜 可感染人， 并引起登革热， 严重者甚至可引起登革出血热或登革休克综合症。埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革病毒的主要传播媒介。 基孔肯雅病毒犆 犺 犻 犽 狌 狀 犵 狌 狀 狔 犪狏 犻 狉 狌 狊披膜病毒科甲病毒属的第四组， 核心含单股 。人体感染该病毒后， 可以引起基孔肯雅热， 该病起病快， 传播范围广。我国南方广泛存在的白纹伊蚊是其主要的传播媒介。 西尼罗病毒犠 犲 狊 狋犖 犻 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊黄病毒科黄病毒属的重要成员， 其基因组为单股正链 分子。西尼罗病毒可感染人， 引起西尼罗热。库蚊是西尼罗热病毒的主要传播媒介。在欧洲和北美为尖音库蚊， 在亚洲则为三带喙库蚊和致倦库蚊。仪器和设备需要如下仪器、 设备： 含 、 、 、 四种荧光检测通道的实时荧光 仪； 生物安全柜； 普通冰箱； 超低温冰箱； 普通台式离心机； 高速冷冻离心机（ 转速可达 犵） ； 微量可调移液器（ 、 、 ） 及配套带滤芯吸头； 离心管（ ） ； 涡旋器。检测对象 入出境口岸疑似携带黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的媒介蚊虫。 入出境口岸疑似感染黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的人员。检测 准备实验室生物安全应符合 的规定。 防污染措施按 的要求。 实验室检测 标本的采集、 运输和保存 人血清标本无菌采集发病后内静脉血 ， 室温静置 使其凝固， 然后 犵离心 ，去除纤维蛋白和红血球， 收集血清于 无菌螺口塑料管中， 用耐低温油性记号笔记上编号， 于 送样箱中尽快送到实验室检测， 或 以下保存待检。犛 犖犜 蚊子标本根据实际工作需要采集蚊子标本。将采集的蚊子直接放入 冰箱冻死后， 取出， 分类编号， 按 只一份。装入螺口塑料管内， 用耐低温油性记号笔记上编号， 于 以下运输或保存待检。 标本的处理 血清标本的处理血清标本无需处理可直接提取核酸进行检测， 如不能及时检测应存放在 冰箱。 蚊标本的处理在冰上操作。从 容器中取出蚊标本， 倒入研磨器中， 加入 标本处理液， 反复研磨至组织碎片基本消失， 随后将研磨液吸入 离心管， 配平后置预冷的离心机上， 犵离心 。取上清液进行核酸提取， 剩余的蚊标本研磨液需保存在 冰箱以备复查。 病毒核酸提取可采用市售病毒 提取试剂盒以 ， 德国 公司产品为例）， 内含 、 、 、 等成分。）取血清标本或蚊标本研磨液 加入 裂解缓冲液（ ） （ ） ， 在旋涡混合器上振荡 混匀， 室温静置 。） 加入 无水乙醇终止反应， 在旋涡混合器上振荡 混匀。） 裂解后的液体分两次移入管柱， 每次 犵离心 ， 此时病毒 会吸附在管柱底部的膜上。） 加 洗液（ ） 至管柱上， 犵离心 ， 弃去 。） 加 洗液（ ） 至管柱上， 犵离心 ， 弃去 。进一步 犵离心 以彻底去除残留在膜上的乙醇。） 加入 洗脱液（ ） ， 室温静置 。） 将管柱置于 离心管上， 犵离心 ， 得到的 即可进行实时荧光 检测。 多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测 用于多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测的引物及探针用于多重实时荧光 检测黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的引物及探针序列及探针标记的荧光染料见表。）由指定单位提供， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。犛 犖犜 表多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测的引物及探针序列及标记的荧光染料引物探针引物探针序列（ ）片段大小 目标病毒 黄热病毒 登革病毒 基孔肯雅病毒 西尼罗病毒注：登革病毒探针 为 探针， 探针序列中的字母前带“” 号的表示 修饰碱基。其他三种病毒探针均为常规犜 犪 狇 探针。 阳性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为根据黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒核苷酸序列体外合成的 片段， 空白对照用无菌水作为荧光 反应的模板。 多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚反应体系组成多重实时荧光 采用一步法实时 试剂盒（ 以 ，德国 公 司 产 品）为 例） ， 多 重 实 时 荧 光 反 应 体 系 采 用 以 下 参 数： ； 引物探针混合液（ 每种探针终浓度为 、 每种引物终浓度为 ） ； 模板； 去离子水 ； 总体积 。 反应条件多重实时荧光 反应条件： 逆转录 ； 变性 ； 变性 ， 退火（ 延伸） ， 个循环， 在退火（ 延伸） 阶段检测荧光信号。 荧光域值的设定 反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的（ ） 值。以 反应的前个 个循环的荧光信号作为基线信号（ 噪音） ， 荧光阈值理论上定义为基线信号的标准偏差的 倍。在实际应用中可以根）由指定单位提供， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。犛 犖犜 据仪器基线信号进行人工调整， 设定原则是以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（ 无规则的噪音线） 的最高点， 且不出现（ ） 值为准。 质控标准本文件质控标准为： 阴性对照： 无扩增曲线； 阳性对照： 出现典型的扩增曲线， 值应小于 。否则， 试验视为无效。 检验结果判断及报告本方法检验结果判断及报告如下： 某种病毒探针对应的检验样本 值小于或等于 时， 报告该病毒核酸检测结果阳性； 某种病毒探针对应的检验样本 值大于 且小于 时， 重复检测一次， 如果 值仍小于 ， 且曲线有明显的对数增长期， 可报告该病毒核酸检测结果阳性， 否则报告阴性； 某种病毒探针对应的样本检测不到 值时， 报告该病毒核酸检测结果阴性； 筛选阳性的样本进行黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒 特异性检测和进一步鉴定。废弃物的处理检验过程中的废弃物， 收集后进行高压蒸汽灭菌处理或其他等效的处理方法。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸黄热病毒、 登革病毒、 基孔肯雅病毒、 西尼罗病毒的多重实时荧光犚 犜 犘 犆 犚检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元