UPLC一标多测法测定淫羊藿中4个黄酮醇苷的含量.pdf

中 国 药 品 标 准 ，（）基金项目：国家重点研发计划（，）第一作者简介：韩志岭，主管药师；研究方向：中药新药研发及中药质量分析。：；：通信作者简介：高云佳，硕士，主管药师；研究方向：中药新药研发及中药质量分析。：；：一标多测法测定淫羊藿中 个黄酮醇苷的含量韩志岭，高云佳，莫梦，张庆英，屠鹏飞（北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 ；北京华医神农医药科技有限公司，北京 ）摘要目的：建立测定淫羊藿中淫羊藿苷、朝藿定 、朝藿定 和朝藿定 等 个黄酮醇苷含量的超高效液相色谱一标多测分析方法。方法：采用超高效液相色谱，以淫羊藿苷为内参物，建立朝藿定 、朝藿定 和朝藿定与淫羊藿苷之间的校正因子，并考察校正因子在不同条件下的稳定性，同时比较一标多测法（）和外标法（）测定结果的差异，验证 的准确性。结果：个化合物平均回收率分别为 、，分别为 、。该方法在不同实验条件下耐用性良好；朝藿定、朝藿定 和朝藿定 个化合物相对于淫羊藿苷的校正因子分别为 、，两种分析方法所得结果基本无差异。结论：所建立的 简便、快捷、准确度高，对控制淫羊藿的质量具有参考价值。关键词：淫羊藿；一标多测；超高效液相色谱；淫羊藿苷；黄酮醇苷中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，）：（）（）：，（）：，：，中 国 药 品 标 准 ，（）：；（）；（）；淫羊藿为小科植物淫羊藿 、箭叶淫羊藿 （）、柔毛淫羊藿 或朝鲜淫羊藿 的干燥叶。夏、秋季茎叶茂盛时采收，晒干或阴干。具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效 。淫羊藿中主要含有黄酮类、酚酸类、生物碱、多糖、菲等化学成分 。现代药理学研究表明，淫羊藿具有免疫调节、防治骨质疏松、促进生殖内分泌功能、抗炎、抗肿瘤以及抗老年痴呆等功效 。目前 中华人民共和国药典（简称 中国药典）日本药局方 和我国香港地区 香港中药材标准 均收载淫羊藿药材。中国药典 和 香港中药材标准规定了含量测定项，前者以淫羊藿苷为参照物采用一标多测法（，）测定淫羊藿苷、朝藿定 、朝藿定和朝藿定等 个黄酮醇苷的含量，后者采用外标法（）测定淫羊藿苷含量。另还有文献报道通过多个指标成分进行淫羊藿药材的质量评价 ，但是有的分析时间较长，有的分离效果不好。本研究采用 法在 内实现了朝藿定 、朝藿定 、朝藿定 、淫羊藿苷 个化合物的完全基线分离，采用 对淫羊藿药材进行淫羊藿苷、朝藿定、朝藿定和朝藿定 个黄酮醇苷含量测定，以期能够更好地控制淫羊藿药材质量。材料 超高效液相色谱仪（包括四元泵溶剂系统、自动进样系统和 检测器，美国赛默飞公司），型 百电子天平、型 万电子天平和 型 万电子天平（科学仪器有限公司）；磷酸（优级纯，公司），乙腈（色谱纯，瑞典 公司）；去离子水（美国 公司），其他试剂均为分析纯。朝藿定 （，纯度 ），朝藿定 （，纯度 ），朝藿定（，纯度 ），淫羊藿苷（，纯度 ），均购自成都曼思特生物科技有限公司。本实验收集甘肃省的淫羊藿药材共 份，批号为 。经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为小檗科植物淫 羊 藿 的干燥叶。方法与结果 色谱条件 色谱柱（，）；流动相 磷酸溶液（）乙腈（）梯度洗脱（，；，），流速 ，柱温 ，检测波长 ，进样量 。混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图。对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加 甲醇制成每 含 的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品叶片，粉碎过三号筛，取约 ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 乙醇 ，称定重量，加热回流 ，放冷，再称定重量，用 乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定方法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 ，注入液相色谱仪，测定。以淫羊藿苷对照品为参照，以其相应的峰为 峰，计算朝藿定 、朝藿定 、朝藿定 峰的相对保留时间（，），其 应在规定值的 范围之内。及校正因子（，）见表 。标准曲线的制备取朝藿定 对照品 （纯度：），精密称定，置 量瓶中，加 甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得储备液 。取朝藿定 对照品 （纯度：），精密称定，置 量瓶中，加 甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得储备液 。取 朝 藿 定 对 照 品 （纯 度：），精密称定，置 量瓶中，加 甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得储备液 。取淫羊藿苷对照品 （纯度：），精密称定，置 量瓶中，加 甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得储备液 。分别精密吸取储备液 、，置 量瓶中，储备液 、，置 量瓶中，加 甲醇稀释并定容，分别制成 种不同浓度的对照品溶液。按“”项下色谱条件进样测定，以中 国 药 品 标 准 ，（）峰面积（）为纵坐标，浓度（，）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 。朝藿定 （）朝藿定 （）朝藿定 （）淫羊藿苷（）图 混合对照品溶液（）和淫羊藿供试品溶液（）的 色谱图 （）（）表 相对保留时间及校正因子 化合物（）朝藿定（）朝藿定（）朝藿定（）淫羊藿苷（）精密度试验 日内精密度取同一供试品溶液，按“”项下色谱条件连续进样 次，测得供试品中朝藿定、朝藿定 、朝藿定 、淫羊藿苷峰面积的 分别为 、，均小于 ，表明仪器精密度良好。日间精密度取样品（批号：），按“”项下方法平行制备 份供试品溶液，以“”项下色谱条件进行测定，得朝藿定 、朝藿定 、朝藿定 、淫羊藿苷平均质量分数分别为 、，分 别 为 、，进一步表明仪器精密度良好。表 指标成分线性关系考察 ，化合物（）回归方程（）相关系数（）线性范围（）朝藿定（）朝藿定（）朝藿定（）淫羊藿苷（）稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，分别于 、进行测定，得朝藿定 、朝藿定 、朝藿定、淫羊藿苷峰面积的 分别为 、，表明样品在 内稳定性良好。重复性试验取样品（批号：），按“”项下方法平行制备 份供试品溶液，以“”项下色谱条件进行测定，得朝藿定 、朝藿定 、朝藿定 、淫羊藿苷平均 质 量 分 数 分 别 为 、中 国 药 品 标 准 ，（），分 别 为 、，表明重复性良好。加样回收率取已知含量样品（批号：，朝藿定 平均质量分数为 、朝藿定 平均质量分数为 、朝藿定 平均质量分数为 、淫羊藿苷平均质量分数为 ）粉末约 ，共 份，精密称定，份按 的量各加入朝藿定 、朝藿定、朝藿定 、淫羊藿苷对照品，份按 的量各加入朝藿定 、朝藿定 、朝藿定 、淫羊藿苷对照品，最后 份按 的量各加入朝藿定 、朝藿定、朝藿定 、淫羊藿苷对照品，按“”项下方法制备供试品溶液，按“”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果，朝藿定 回收率为 ，朝藿定 回收率为 ，朝藿定 回收率为 ，淫羊藿苷回收率为 ，分别为 、，均小于 ，表明方法的准确度符合要求。结果见表 。表 淫羊藿药材中 个化合物的加样回收率 化合物（）称样量（）样品中量（）加入量（）测得总量（）回收率（）平均回收率（）朝藿定 （）朝藿定 （）朝藿定 （）淫羊藿苷 （）中 国 药 品 标 准 ，（）校正因子的测定一定范围内（线性范围）成分的量（质量或浓度）与检测器响应成正比，即：（）。测定时，以淫羊藿苷为内标，建立该成分与其他几种黄酮醇苷之间的校正因子 （）（式中 为内标物峰面积，为内标物浓度，为其他组分 峰面积，为其他组分 浓度）。一标多测法是基于 种浓度对照品溶液的校正因子。进行了三次实验，并根据每次实验所得的校正因子计算出平均值。结果表明，朝藿定 的校正 因 子 为 ，朝 藿 定 的 校 正 因 子 为 ，朝藿定 的校正因子为 。分别为 、，均 小 于 ，表明校正因子在不同浓度对照品溶液中稳定性良好。的测定配制 种浓度的对照品溶液，分别采用 根不同批次色谱柱（色谱柱，）以“”项下色谱条件进行测定，并根据每次实验所得的 计算出平均值。结果表明，朝藿定 的 为 ，朝藿定 的 为 ，朝藿定 的 为 。分别为 、，表明 在不同色谱柱中稳定性良好。校正因子和 耐用性考察通过 种浓度的对照品溶液，考察了朝藿定 、朝藿定 和朝藿定 与不同仪器和色谱柱的 和 的耐用性。结果见表 。结果表明，不同仪器和不同批次色谱柱（型号：，）的 和 值较稳定，均小于 。表 和 耐用性考察结果（）仪器（）色谱柱（）朝藿定（）朝藿定（）朝藿定（）朝藿定（）朝藿定（）朝藿定（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）色谱柱（）平均值（）检测方法耐用性考察考察了缓冲液酸性（磷酸，磷酸和 磷酸溶液）、检测波长（、）、流速（、）、柱温（、）等因素对 和 值的影响。结果，各因素对 、影响不大，值均小于 。样品测定取 批淫羊藿样品，按“”项下方法制备供试品溶液，分别按照 和 法对样品进行测定，经比较同一样品用两种方法测定结果基本一致，小于 。结果见表 和图 。讨论取朝藿定 、朝藿定 、朝藿定 和淫羊藿苷对照品溶液，分别在 波长范围内进行扫描，结果四种对照品溶液均在 波长处有最大吸收，故选定 为检测波长。对样品的提取方法（超声、加热回流）、提取溶剂（不同体积分数的乙醇和水）、提取时间（、）等进行了考察，最终采用稀乙醇回流提取 作为样品前处理方法。对不同流动相系统（乙腈 磷酸，乙腈 磷酸和乙腈 磷酸溶液）、不同柱温（、）以及不同流速（、中 国 药 品 标 准 ，（）等 色谱条件进行了优选。最终确定采用 （，）为色谱柱，以乙腈 磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为 。表 一标多测法和外标法测定淫羊藿中 个黄酮醇苷总含量结果（）样品编号（）批号（）外标法总量（）替代法总量（）替代法朝藿定（）替代法朝藿定（）替代法朝藿定（）淫羊藿苷（）平均值（）图 淫羊藿含量均值柱状分析图 该研究以淫羊藿苷对照品为内参物，法测得朝藿定 、朝藿定 和朝藿定 个化合物的校正因子分别为 、和 ，与 中国药典 年版一部“淫羊藿”标准 法规定的 个化合物校正因子（分别为 、和 ）略有差异，分析其原因可能是由于二者采用的分析方法或标准品纯度不同所致。本文以淫羊藿苷为内标物，建立 个黄酮醇苷的一标多测含量测定方法，结果显示所测得含量与 所得结果基本一致。而且试验采用 法大大缩短了检测时间，该方法在 内就完成了 个化合物的检测。说明所建立的 可以作为一种经济、快捷、准确的方法应用淫羊藿质量的控制。中 国 药 品 标 准 ，（）参考文献 中华人民共和国药典 年版 一部 ：杨茹 淫羊藿总黄酮提取、纯化工艺优化及其肠溶粘附胶囊制剂成型的初步研究 南京：南京中医药大学，：，马文娟，姚广哲，贾琪，等 法定性分析淫羊藿中的化学成分 中药材，（）：，（）：侯莹莹 淫羊藿化学成分分析及提取物生物活性评价 长春：吉林农业大学，：，黄楚燕，梁宏宇 淫羊藿化学成分的分离与鉴定 世界中医药，（）：，（）：沈自尹，吴志军，于立华，等 淫羊藿总黄酮对皮质酮诱导免疫功能低下大鼠的保护作用及配伍研究 中国药理学通报，（）：，（）：吕明波，陈克明，葛宝丰 淫羊藿苷对小鼠破骨细胞 、表达的影响 中国骨质疏松杂志，（）：，（）：刘忠平，李质馨，田洪艳，等 淫羊藿苷对酒精致雄性小鼠生殖损伤的影响 中国男科学杂志，（）：，（）：马婷，王丽娜，李子坚，等 淫羊藿苷抗肿瘤作用的研究进展 现代肿瘤医学，（）：，（）：王晗 淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响及相关机制探讨 广州：广东药科大学：马越，李德坤，叶正良，等 基于一测多评法测定淫羊藿中种黄酮类化合物的含量 中药材，（）：，（）：张龙，李珊珊，白雪，等 基于一测多评法的淫羊藿质量评价方法研究及验证 中国中药杂志，（）：，（）：徐文芬，杨雯，何顺志，等 一测多评法测定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定 、中草药，（）：，（）：王贞媛 一测多评法测定瘪桃干药材中 个酚酸类成分 中国药品标准，（）：，（）：（收稿日期：）