RNA干扰Twist基因对人膀胱癌T24细胞化疗敏感性的影响.doc

RNA 干扰 Twist 基因对人膀胱癌 T24 细胞化
疗敏感性的影响

作者：沈彬 管旌旌 胡敬海 王春喜

【摘要】目的 构建转录因子 Twist 基因的短发卡状 RNA ( shRNA)

质粒，转染人膀胱癌 T24 细胞株后检测 T24 细胞对羟基喜树碱（HCPT）

的敏感性。方法 体外构建 Twist 基因 shRNA 的表达质粒，脂质体法介

导将其转染入 T24 细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特

异性转染组。采用 RT PCR 法和 Western 印迹法检测转染后 Twist

mRNA 及蛋白的表达。 使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)及流式细胞术 FCM) （

测定 Twist shRNA 转染 T24 细胞后细胞对 HCPT 敏感性的改变。结果

Twist shRNA 转染组细胞 Twist mRNA 和蛋白的表达与其他两组相比明

显下调(P＜0.05)；HCPT 敏感性与正常对照组相比明显提高 (P＜

0.05)。 结论 靶向 Twist 基因的序列特异性 shRNA 可增强 T24 细胞对

HCPT 的敏感性。

【关键词】 RNA 干扰;羟基喜树碱;短发卡样 RNA;Twist 基因

膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤,高发年龄为 50～70 岁， 发 复

率高是其显著特点,因此绝大多数患者在进行肿瘤切除手术后需进行

膀胱灌注化疗。羟基喜树碱(HCPT)是从珙桐科植物喜树中提取的微量

生物碱， 腔内灌注治疗膀胱癌的常用药,取得了一定的治疗和预防 作为

1

效果。随着基因治疗技术研究的逐步深入，大家逐渐认识其存在着局

限性。为了弥补基因治疗的不足，本实验用 Twist 基因联合 HCPT 对

人膀胱癌 T24 细胞的体外杀伤作用进行比较,为基因治疗联合化疗药

物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Twist 短发卡状 RNA(shRNA)已由本实验室构建成功并

证实可下调 T24 细胞中 Twist 基因 mRNA 和蛋白的表达〔1〕 脂质体转 。

染试剂(Lipofectami 2000)购于 Invitrogen 公司。 膀胱癌 T24 细胞

株购自中科院上海细胞研究所细胞库， 胎牛血清和 IMDM 细胞培养基购

自天津 TBD 公司。HCPT 针剂由湖北黄石飞云制药有限公司出品。细胞

凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Twist shRNA 质粒构建和筛选〔1〕 Twist shRNA 干扰序

列 ： GCTGAGCAAGATTCAGACCCT 。 Twist 基 因 引 物 : 上 游 5 ′

GGGAGTCCGCAGTCTTACGA 3′，下游 5′ CCAGACCGAGAAGGCGTAGC

3′，表达长度 277 bp。人内参 GAPDH 基因引物序列:上游 5′

AGCCACATCGCTCAGACAC 3′，下游 5′ GAGGCATTGCTGATGATCTTG

3′。

2

1.2.2 MTT 法测定细胞对 HCPT 的药物敏感性 实验分为正常细胞

组、转染阴性对照质粒细胞组和转染 Twist shRNA 细胞组。取对数生

长期细胞接种于 96 孔板(1×104cells/孔)， 160 ml 培养液 37 ℃ 加

培养 24 h 后加入终浓度为 0.01、0.1、1、5、10、50、100 mg/L HCPT，

每个浓度设 6 个复孔;继续培养 48 h 后加入 20 ml(5 g/L)MTT。再培

养 4 h 后尽量吸干培养液,加入 200 ml 二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解

10～15 min。上酶联免疫分析仪测每孔吸光度值(A 值)，波长 490 nm，

计算 HCPT 半数抑制浓度(IC50),实验重复 3 次。抑制率=〔(阴性对照

A 值-实验组 A 值)/阴性对照 A 值〕×100%。以药物浓度数值为横轴,

抑制率为纵轴绘制浓度效应曲线。

1.2.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况 收集 0.1 mg/L HCPT

处理的不同组膀胱癌细胞,PBS 洗涤 2 次，按照试剂盒说明书依次加入

Annexin V 和碘化丙碇(PI)溶液,避光作用 15 min。上 COULTER EPICS

XL 型流式细胞分析仪检测细胞凋亡,其中每次至少计数 10 000 个细胞,

每个样品分别做 2 次,采用 Multicycle 分析软件分析。

1.3 统计学分析 采用 SPSS11.5 统计软件进行统计分析，计量

资料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析。

2结果

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