白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其诱导凋亡作用的实验研究.pdf

866中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.2023Vol.30No.5白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其诱导凋亡作用的实验研究汪丽娜，任若瑜，何富乐？（1永康市中医院药剂科浙江永康32 130 0；浙江中医药大学第一临床医学院浙江杭州310 0 53）摘要目的：探究白皮杉醇对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及相关的作用机制。方法：采用CCK8法检测不同浓度的白皮杉醇对SKOV-3细胞增殖能力的影响;采用细胞划痕实验检测不同浓度的白皮杉醇对SKOV-3细胞迁移能力的影响;采用Transwell 侵袭实验检测不同浓度的白皮杉醇对SKOV-3细胞侵袭能力的影响；采用DAPI染色法检测不同浓度白皮杉醇对SKOV-3细胞凋亡的影响；采用Westermblot实验检测SKOV-3细胞核增殖抗原（Ki67）、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、BCL-2相关X蛋白(Bax)和活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase-3)的表达水平。结果：白皮杉醇能够明显抑制SKOV-3细胞的增殖能力，明显降低SKOV-3细胞的迁移能力和侵袭能力；明显提高SKOV-3细胞的凋亡水平；白皮杉醇干预后,SKOV-3细胞Ki67和Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax和 Cleaved caspase-3蛋白表达显著升高。结论：白皮杉醇能够有效抑制SKOV-3细胞的增殖、迁移和侵袭,并能够诱导SKOV-3细胞凋亡。关键词卵巢癌SKOV-3细胞;白皮杉醇;增殖；迁移;侵袭；凋亡;体外实验Experimental Study on Effects of Piceatannol on Proliferation,Migration and Invasion ofOvarian Cancer Cells and Its Inducing Apoptosis EffectWANG Lina,REN Ruoyu,HE Fule?(Department of Pharmacy,Yongkang Hospital of Chinese Medicine,Yongkang,Zhejiang 321300;2 First Clinical Medical Cllege,Zhejiang Chinese Medicine University,Hangzhou,Zhejiang 310053)ABSTRACT Objective:To investigate the effects of Piceatannol on proliferation,migration,and invasion ofhuman ovarian cancer SKOV-3 cells and its inducing apoptosis and the related mechanisms.Methods:CCK8assay was used to detect the effect of different concentrations of Picerlitol on the proliferation of SKOV-3 cells,cell scratch assay was used to detect the effect of different concentrations of Picerlitol on the migration ability ofSKOV-3 cells,transwell invasion assay was used to detect the effect of different concentrations of Piceatannol onthe invasion ability of SKOV-3 cells,DAPI staining was used to detect the effect of different concentrations ofPicerlitol on apoptosis of SKOV-3 cell.The expression levels of Ki67,Bcl-2,Bax and Cleaved caspase-3 inSKOV-3 cells were detected by Westermn blot assay.Results:Piceatannol could significantly inhibit the proli-feration of SKOV-3 cells,inhibit the migration and invasion of SKOV-3 cells,increase the apoptosis of SKOV-3 cells.After Piceatannol intervention,the protein expressions of Ki67 and Bcl-2 in SKOV-3 cells weresignificantly decreased,while the protein expressions of Bax and Cleaved caspase3 were significantly increased.Conclusion:Piceatannol could effectively inhibit the proliferation,migration and invasion of SKOV-3 cells,andinduce the apoptosis of SKOV-3 cells.Key words human ovarian cancer SKOV-3 cells;Piceatannol;proliferation;migration;invasion;apoptosis;in vitro白皮杉醇是一种多酚类化合物,其结构与白藜芦醇相似，广泛存在于甘蔗、葡萄、大戟、桂皮以及基金项目：浙江省基础公益研究计划项目（LGF20H270010)通讯作者：何富乐,E-mail:白茶树等植物11。白皮杉醇具有多种药理活性,例如抗氧化、抗炎、抑菌、抗衰老、抗白血病、调节免疫功能等 2-4;此外,越来越多的研究表明,白皮杉醇对乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病等多种肿瘤细胞均有明显的抑制作用 5-7 ,表明其具有一定中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.2023Vol30No.5的抗肿瘤能力。目前关于白皮杉醇在卵巢癌中的作用及相关的机制仍未见报道，本研究以卵巢癌细胞株 SKOV-3为研究对象,旨在探讨白皮杉醇对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其诱导凋亡作用和相关机制,为白皮杉醇的临床应用提供实验室依据。1实验材料1.1实验细胞包人卵巢癌细胞SKOV-3：上海赛百公司。1.2药物与试剂白皮杉醇：成都德思特生物技术有限公司，批号：DST190812-023。DMEM高糖培养基：美国Hyclone公司;胎牛血清：浙江天杭生物科技公司；CCK8试剂盒：美国MCE公司，批号：#2 136 8；结晶紫：上海强顺化学试剂公司；DAPI染料：上海碧云天公司；BCA蛋白测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；Ki67Antibod-y、Be l -2 A n t i b o d y、Ba x A n t i b o d y,Cl e a v e d Ca s p a s e -3Antibody，G A PD H A n t i b o d y：美国Affinity公司，批号:34e1264,65k2435、43k 2 132、48 k 359 1。1.3仪器CMaxPlus 型酶标仪:美国Molecular De-vices公司；Micro17R型低温高速离心机：美国Ther-mo公司；BB150型细胞培养箱：美国Thermo公司；AE2000型光学显微镜：中国Motic公司;Ts2-FC型倒置荧光显微镜：日本尼康公司；EPS300型电泳仪：上海天能生命科学有限公司；6 10 0 2 0-9 Q型化学发光仪：上海勤翔科学仪器有限公司。2实验方法2.1细胞培养人卵巢癌SKOV-3细胞解冻复苏后,制成细胞悬液,接种于培养基中（10%胎牛血清、10 0 U/mL青霉素、10 0 g/L链霉素），常规培养于37,5%CO,细胞培养箱,1 2 d换液1次，显微镜下观察，待细胞长至对数生长期时用0.2 5%胰蛋白酶（含0.0 2%EDTA)消化后传代。2.2CCK8检测细胞活性取对数生长期细胞接种于9 6 孔板内,随机分为空白对照组（0 mol/L）、白皮杉醇低剂量组（2 0 mol/L）、白皮杉醇中剂量组(40 mol/L)和白皮杉醇高剂量组（8 0 mol/L)。待细胞贴壁后，分别加人相应浓度的药物，继续培养2 4h和48 h后，每孔加人10 LCCK-8溶液，在培养箱内孵育。用酶标仪测定450 nm处的吸光度，计算细胞活性。相对细胞活性=（实验组OD值/空白组 OD 值)10 0%。2.3细胞划痕实验检测细胞迁移能力按照“2.2中方法分组，用记号笔在6 孔板背后均匀划867横线且横穿过孔，每孔至少穿过3条线。取对数期的SKOV-3细胞进行铺板，细胞密度为每孔510个,过夜后细胞覆盖整板。第2 天用1mL枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，划痕后用PBS洗细胞3次,除去划下的细胞,再加人无血清培养基，根据分组情况加入相应浓度的药物，继续培养2 4h后观察划痕实验结果并取样拍照。利用ImageJ软件测量每孔多个点划痕间距,取均值,0 h和2 4h时划痕的宽度分别记为A和B,迁移率=(A-B)/A。2.4Transwell检测细胞侵裂能力按照“2.2 中方法分组,用无血清DMEM高糖培养液稀释Matri-gel,稀释比例为3:1,取30 L稀释后的Matrigel包被Transwell小室，置于4孵育过夜;取对数期SK-OV3细胞按上述分组情况用相应浓度的药物处理24h后，将Transwell小室放入2 4孔培养板，上室加人SKOV3细胞，置培养箱中继续培养2 4h，棉签擦掉基质胶和上室底层细胞，4%多聚甲醛固定10min,PBS洗3次，0.1%结晶紫染液染色30 min后拍照并计数侵袭至下室中的细胞数量。2.5DAPI染色法检测细胞凋亡按照“2.2”中方法分组，取对数期的SKOV-3细胞传代于2 4孔板中,再以6 0%7 0%细胞密度种板,细胞贴壁后按分组给予相应浓度的白皮杉醇，药物作用结束弃去培养液后用多聚甲醛固定细胞10 min,PBS清洗2次，然后DAPI核染（1 mg/LDAPI作用2 min）；再次PBS液洗2 次后无菌水洗1次。在载玻片上滴甘油，载玻片上小心黏附盖玻片，在荧光显微镜下观察细胞并拍照。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数。2.6 Westerm blot 检测 Ki67、Bc l -2、Ba x、Cl e a v e dCaspase-3蛋白表达按照“2.2”中方法分组,取对数期SKOV-3细胞传代于6 cm培养血,按分组情况用相应的浓度的药物处理后，提取蛋白。配制浓度为10%的SDSPA G E胶，蛋白上样量为30g,在6 0 V恒压下进行电泳至分离胶处，再以110V电泳6 0 min左右。以30 0 mA恒流湿转2 h，室温状态下用浓度为5%脱脂牛奶进封闭1h，一抗4孵育过夜。次日，用TBST清洗3次，清洗后在室温下孵育二抗,孵育1 h,再次用TBST清洗,清洗3次，每次5min,用ECL显色液孵育3min，使用凝胶成像系统成像。采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。2.7统计学方法采用SPSS19.0统计软件分析，868所有数据以均值标准差（xs)表示，方差齐性多组间用Onew a y A NO A Y单因素方差分析，组间比较采用SNK分析；方差不齐采用Kruskal-WallisH检验。P0.05为差异有统计学意义。3结果3.1白皮杉醇对 SKOV-3 细胞增殖的影响见表1。表1干预2 4h、48 h 各组SKOV3细胞活性检测结果(xs,%）组别空白对照组白皮杉醇低剂量组白皮杉醇中剂量组白皮杉醇高剂量组注：与空白对照组比较，*P0.05，*P 0.0 13.2白皮杉醇对SKOV-3细胞迁移能力的影响见表2,图1。中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.2023Vol.30No.5空白对照组白皮杉醇低剂量组白皮杉醇中剂量组白皮杉醇高剂量组注：与空白对照组比较，*P0.05，*P 0.0 13.3白皮杉醇对 SKOV-3细胞侵袭能力的影响见图2,表3。24 h48 h5100.00 10.61586.63 7.02*579.97 5.32*566.22 5.71*表2 各组SKOV3细胞迁移率比较(%8,%）组别迁移率365.90 6.37352.00 5.16*346.78 4.79*339.35 3.63*3.4白皮杉醇对 SKOV-3细胞凋亡的影响表100.00 8.31 4,见图3。DAPI染色法检测白皮杉醇对SKOV-382.24 6.44*细胞凋亡的影响。由图3可知,与空白对照组比较，73.03 7.65*61.54 4.71*白皮杉醇低、中、高剂量组中的凋亡细胞数量明显增多；由表4可知,与空白对照组比较,白皮杉醇低、中、高剂量组中的细胞凋亡率逐渐升高,差异具有统计学意义(P0.01)。0h24 h空白对照组白皮杉醇低剂量组图1各组SKOV3细胞迁移能力（40）白皮杉醇中剂量组白皮杉醇高剂量组空白对照组表3各组SKOV3细胞侵袭能力比较(xs，个）组别空白对照组白皮杉醇低剂量组白皮杉醇中剂量组白皮杉醇高剂量组注：与空白对照组比较，*P0.05，*P 0.0 13.5白皮杉醇对SKOV-3细胞凋亡相关蛋白表达的影响见图4 图5。由图4、图5可知,与空白对白皮杉醇低剂量组图2 各组SKOV3细胞侵袭能力（2 0 0）SKOV3细胞侵袭数组别335.00 3.61327.33 3.06*320.00 2.00*39.00 1.00*白皮杉醇中剂量组表4各组SKOV3细胞凋亡率比较(xs,%）凋亡率空白对照组3白皮杉醇低剂量组3白皮杉醇中剂量组3白皮杉醇高剂量组3注：与空白对照组比较，*P0.05，*P 0.0 1照组比较,白皮杉醇低、中、高剂量组中的Ki67和Bcl-2 蛋白的表达水平均显著降低(P0.05 或 P白皮杉醇高剂量组2.73 0.655.60 0.72*9.44 0.70*13.03 0.80*中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.2023Vol30No.5 869空白对照组0.01）,Ba x 和 Cleaved caspase-3蛋白的表达水平均显著升高(P0.05或P0.01)。CKi67Bcl-2BaxCleaved caspase3GAPDHA空白对照组;B.白皮杉醇低剂量组;C.白皮杉醇中剂量组；D.白皮杉醇高剂量组图4各组SKOV-3细胞Ki67、Bc l-2、Ba x、C le a v e d c a s p a s e 3蛋白表达的Westermhlot检测结果151空白对照组白皮杉醇低剂量组白皮杉醇中剂量组10网白皮杉醇高剂量组506白皮杉醇低剂量组图3各组SKOV3细胞调亡情况（2 0 0）ABBax白皮杉醇中剂量组杉醇具有抑制前列腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤细胞的增殖和诱导调亡的作用，具有一定的抗肿D瘤活性 。本研究探讨白皮杉醇对人卵巢癌 SK-OV-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力等影响及调亡的诱导作用，并初步探讨其作用机制。CCK8实验结果显示,SKOV-3细胞经白皮杉醇干预后存活率明显降低，且降低程度与用药时间和浓度呈正相关,初步证实白皮杉醇对卵巢癌细胞的增殖活性具有一定的抑制作用。细胞划痕实验研究表明,白皮杉醇能够有效抑制卵巢癌细胞的迁移能力。Transwell 侵袭实验结果表明，白皮衫醇能够有效抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式,是细胞在发育过程中通过调控细胞内基因及其产物而发生的一种死亡过程 12 1,研究细胞凋亡对探究抗肿瘤机制具有重要意义。DAPI染色结果表明,白皮杉醇干预后 SKOV-3细胞凋亡数量明显增加,细胞凋亡水平与药物剂量呈正相关。Caspase家族蛋白质是凋亡相关蛋白的重要组成部分，与细胞凋亡的发生和发展息息相关 13;另外,由Bax 等促凋亡蛋白以白皮杉醇高剂量组及Bcl-2等抗凋亡蛋白组成的Bcl-2家族蛋白也是凋亡过程中的重要调节因子。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白在正常生理环境下维持在一种平衡的状与空白对照组比较，*P0.05，*P 0.0 1(x s,n=3)图5各组SKOV-3细胞Ki67、Bc l-2、b a x和Cleaved caspase-3蛋白表达的比较4讨论卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有2 0 万名女性被确诊为卵巢癌，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位 8 。卵巢癌起病隐匿，早期症状不典型，大多数患者确诊时已至晚期 。因此,探讨卵巢癌的增殖以及侵袭转移机制，寻找新的治疗策略，对改善预后,延长患者生存期具有重要的临床意义。白皮杉醇具有与白藜芦醇相似的生物活性,其抗氧化活性强于白藜芦醇，而且白皮杉醇具有相对较低的毒副作用 10 1。大量体外研究结果表明,白皮态，这种平衡状态一旦被打破，将导致细胞凋亡 14-15。Westem blot 结果显示白皮杉醇干预后,Bcl-2 蛋白的表达下调,Bax蛋白和 cleaved Caspase-3蛋白表达明显上调,同时细胞增殖相关蛋白Ki67表达显著下调。进一步从蛋白水平证实白皮杉醇能够诱导SKOV-3细胞凋亡,抑制SKOV-3细胞增殖。综上所述,白皮衫醇能够显著抑制SKOV-3细胞的增殖、迁移及侵袭，并能够有效诱导SKOV-3细胞凋亡。参考文献1王风仙,叶诗华,赵卓佳,等.白皮杉醇对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468抗肿瘤作用及机制 J.中870国实验方剂学杂志，2 0 2 1,2 7（7）：42-48.2 Unnati S,Ripal S,Sanjeev A,et al.Novel anticancer a-gents from plant sourcesJ.Chin J Nat Med,2013,11(1):16-23.3 Rimando AM,Kalt W,Magee JB,et al.Resveratrol,pterostilbene,and piceatannol in vaccinium beries J.JAgr Food Chem,2004,52(15):4713-4719.4Cao Y,Smith W,Yan L,et al.Overview of cellularmechanisms and signaling pathways of piceatannol J.Curr Stem Cell Res Ther,2020,15(1):4-10.5王风仙，陈慧茹，解伟，等.白皮杉醇抗肿瘤作用研究进展 J.天然产物研究与开发，2 0 2 0,32（5）：8 9 3-8 9 9.6李章春,李珀,邓超男,等.白皮杉醇抑制前列腺癌细胞株增殖、迁移与侵袭 J.中国病理生理杂志,2 0 17，33(6):1130 1133.7段传新.白皮杉醇增强顺铂杀伤喉癌Hep-2细胞的作用及其机制 J.肿瘤防治研究,2 0 18,45(6)：36 7-37 0.8陈金东.中国各类癌症的发病率和死亡率现状及发展趋势 J.遵义医学院学报，2 0 18,41(6)：6 53-6 6 2.9叶旭,李力.miRNA在卵巢癌早期诊断和预后中作用响应面法优化中药复合防晒乳液的制备工艺中国中医药科技2 0 2 3年9 月第30 卷第5期Sep.2023Vol.30No.5的研究进展 J.中国肿瘤生物治疗杂志,2 0 19,2 6(6):715-719.10刘芝兰,曾春娇,吴梅青,等.白藜芦醇与白皮杉醇及赤松素研究进展 J.医药导报，2 0 13,32（8）：10 43-1049.11孙嘉良,刘璐,海鑫.白皮杉醇增强5氟尿嘧啶对肝癌的抑制作用J哈尔滨医科大学学报，2 0 19，53(4);357-362.【12 胡艳红，张凡，张楚峻，等.程序性细胞死亡形式研究进展J.辽宁中医药大学学报，2 0 18,2 0（12）：8 5-89.13杨涛,费振海,钟兴明.Caspase 家族与细胞凋亡的研究进展 J.浙江医学,2 0 18,40(18)：2 0 8 3-2 0 8 7,2 0 9 1.14潘政军.Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复免关节软骨损伤的实验研究 D.合肥：安徽医科大学,2 0 19.15李鑫芳，郑伟，叶昂直汉黄芩苷通过调控AKT信号通路促进肝癌细胞HepG2凋亡的研究 J浙江临床医学,2 0 2 2,2 4(8):1111-1113.(收稿日期:2 0 2 2-10-15)李梦雪，李玉姗，霍金海，王伟明（黑龙江省中医药科学院黑龙江哈尔滨150 0 36）摘要目的：采用响应面分析法优化中药复合防晒乳液的制备工艺。方法：采用单因素变量法考察优化处方组成和制备工艺，通过响应面分析法研究油相添加量、乳化剂添加量、乳化温度与离心乳层保留率之间的交互作用，确定最优配方，并对防晒乳液进行质量评价和功效评价。结果：经响应面法得到的最佳方案为油相添加量为18%，乳化剂添加量为2%，乳化温度为8 0。乳液pH平均值为（5.430.2)。保湿性能良好，耐热耐寒性强，稳定性强，无皮肤刺激性，具备中等紫外线防护效果。结论：通过响应面分析法获得防晒乳液的+最佳工艺参数，该方法准确、简便、具有实践意义，为后期防晒乳剂的规模化生产提供了参考依据。关键词中药防晒乳剂；单因素分析法；响应面分析法；质量评价随着生活水平的提高,天然来源的活性物质成为人们关注的焦点。以天然中药提取物作为防晒成分，具有安全、低毒等特点，逐渐成为天然护肤的首选。经研究发现,降香和密蒙花提取物在 UVB区和UVA区均具有较强紫外吸收,具有全波段防晒效果 2 ;刺五加叶提取物对OH具有清除能力,具有良好的抗氧化效果 3，可以在防晒乳液中作为抗基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（LH2020H109）通讯作者：王伟明,E-mail;氧化成分，对抗光老化现象。近年来，将计算机与实践相结合的响应面分析法，相比较传统的正交实验法数据更加准确，更具有实践意义。它通过合理的试验设计获得最优的方案，再以获得的试验数据,拟合成多元二次回归方程，得到影响因素与响应值之间的函数关系，最终分析二次回归方程确定最佳工艺参数,达到优化试验的目的 4-6 。01实验材料1.1实验药物和试剂复合中药脂质体冻干粉：实验室自制。鲸蜡硬脂醇聚醚2 0：山东优索化工科