基因免疫构成和机理.doc

基因免疫构成和机理
(Genetic Immunity)

基因免疫，又称基因疫苗免疫或核酸免疫；是应用基因重组技术将编码的目的抗原蛋白基因插入细菌质粒内，构建成重组体，将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统，表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生特异性体液免疫及以CTL为代表的细胞免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。这种能诱导动物机体产生免疫应答的重组体，就是核酸疫苗，或称基因疫苗(genetic vaccine)、裸DNA疫苗(DNA vaccine)等，系该章讨论的重点内容。
基因直接导入法最初用于基因治疗试验。人们发现将基因直接在体内转染细胞，目的基因亦可在机体内表达。1990年Wolff等总结了前人的成果，并对此进行了较深入的研究。他们将氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、虫荧光素酶基因(Luc)及β—半乳糖苷酶基因(LacZ)分别直接注射到小鼠的骨骼肌内，结果表明在肌肉组织可分别检测到三种基因产物，它们的表达量可与在体外最佳条件下转染成纤维细胞的表达量相当，两个月以后，肌肉内还可检测到虫荧光素酶。据此，他们认为向机体直接导入基因以表达抗原蛋白，可以作为一种免疫接种法。1992年Tang等将人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠表皮细胞，几周后，88%(30／34)的小鼠产生了抗人生长激素的抗体。此后，许多学者先后将不同病原的保护性抗原基因直接导入到不同的动物体内，均引起了特异性的免疫应答，不仅诱导细胞免疫，也刺激产生体液免疫。目前，基因疫苗已成为继减毒疫苗及基因工程疫苗之后，正在兴起研究的第三代疫苗，巴斯德研究所的Whalen博士在Internet网上建立了有关基因疫苗研究的网址，每周发布2～3次新闻，内容主要包括:最新消息，会议讯息，研究进展，最新文献，有关基因疫苗研究试剂与器材的供求信息等。
一、 基因疫苗的构成
基因疫苗由病原的保护性抗原基因及载体质粒两部分构成。保护性抗原基因可以是单
个基因，也可以是具有协同保护功能的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列。对载体质粒的一般要求是：①在大肠杆菌中可以高拷贝地扩增；②在动物细胞内高效表达，但不能复制，也不能含有促进整合入宿主细胞染色体基因组的序列。载体质粒一般以pUC质粒为基本骨架，带有细菌复制子(ORI)，真核生物的启动子，有的还含有增强子和多聚A加尾信号。启动子多数来源于病毒基因组，如CMV，RSV和LTR等，具有较高的转录活性。在所有研究过的启动子中，以CMV的转录活性最高，其中又以带intron A的转录活性为高，intron A内部含有某些转录因子的加尾信号，可能是其促进转录的原因。
二、 基因免疫的机理
目前，人们对基因的免疫机理尚不十分清楚。给动物肌肉接种基因疫苗后，外源基因
在肌纤维细胞内表达，所表达的外源蛋白在细胞内加工成多肽抗原，然后与宿主的MHC-Ⅰ类或MHC-Ⅱ类分子结合，再将其结合物递呈给ICC，从而引发特异性免疫应答。目前，人们对这一抗原递呈过程所知甚少，一般认为树突状细胞(DC)在该过程中起重要作用，因为，在肌肉中发现存在有DC，但这并没有直接的抗原递呈实验证据。Raz等(1994)将基因含流感病毒NP的质粒皮下接种小鼠，接种后分别在第3、10和30天用免疫组化法染色接种部位，发现阳性细胞有：角质化细胞，成纤维细胞，树突状细胞。说明这些细胞在动物接种基因疫苗后的免疫应答中起作用。
关于肌细胞在基因疫苗免疫机理中的作用，目前有以下三种观点：①肌细胞直接参与目的基因DNA的摄入和表达，并递呈给免疫系统，产生免疫应答，骨骼肌组织中可能存在尚未被发现的抗原递呈细胞，其作用类似于皮肤组织中的朗格罕细胞；②肌细胞不直接参与免疫应答，蛋白质抗原从肌细胞分泌出来后，被巨噬细胞和／或树突状细胞吞噬、处理、递呈，分别与MHC-Ⅰ类和-Ⅱ类分子结合，诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)前体、B细胞和特异性Th细胞活化，产生细胞免疫和体液免疫应答；③基因疫苗免疫时，肌细胞和抗原递呈细胞均被转染，引起CD4＋T细胞和CD8＋T细胞亚群同时活化，产生特异性免疫应答。
三、 基因免疫的特点
用于传染病预防的常规疫苗主要有：灭活疫苗和弱毒疫苗两类。弱毒疫苗诱导的免疫应答与病原自然感染机体后产生的相似，均包括细胞免疫和体液免疫，因此，反应强而全面，且持续时间较久，但它有毒力回升、返祖的危险。灭活疫苗在灭活过程中常造成重要抗原表位的丢失，接种动物后难以产生全面的免疫。重组活疫苗是基因工程技术出现后产生的新一代疫苗，虽然与弱毒疫苗一样可以诱导产生细胞免疫和体液免疫，但因其病毒载体具有免疫原性，重复使用可引起机体对载体本身的免疫应答，因此，不能反复使用。与以上这些疫苗相比较，基因疫苗有以下特点：①基因疫苗接种后，保护性抗原基因在宿主细胞内表达抗原蛋白后，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似，同时，两者的抗原递呈过程亦相同，因而，可以与自然感染病原微生物一样，诱导接种动物既产生细胞免疫又产生体液免疫，这是灭活苗和亚单位苗所不能比拟的；②免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，它可以持续地给免疫系统提供刺激，因此，微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答；③基因疫苗具有共同的理化特性，可以将含不同病原基因的质粒混合起来进行联合免疫，或是将不同病原的保护性抗原位点一同组装入一个质粒，构建成多价疫苗；④质粒载体不存在免疫原性，因此，可以反复使用，这避免了重组活疫苗的弊病；⑤质粒DNA性质稳定，保存和运输方便，可以大大降低这两方面的费用，也可避免因保存和运输不当而造成的免疫失败，这一特点是一切传统疫苗所不具备的；⑥直接接种目的基因DNA，避免了疫苗制备所需的繁琐过程，也有利于控制和保证质量；⑦作为一种重组质粒，基因疫苗能在工程菌内快速增殖，且提纯方法简便，可大大降低疫苗的成本；⑧对危险病原，如Ebola病毒等，基因疫苗是制备免疫原的最安全的方法；⑨基因疫苗没有常规疫苗和灭活疫苗可能因毒力返祖或残留强毒力病毒颗粒而引发疫病的危险。
四、 基因免疫的主要生物学特征
（一） 基因免疫的动力学 基因免疫产生抗体的动力学与蛋白抗原免疫不同，其潜伏期较长，接种后一般要2～3周才有抗体产生，而抗体产生后却可在比较长的时间内维持较高的水平，在小鼠甚至可持续终生。但也有例外，如以HIV Env疫苗质粒免疫动物后，免疫反应较短，在高峰期间只能维持2～4周; 而蛋白抗原免疫的潜伏期一般为数天，抗体水平到达高峰后下降速度较快。
（二） 基因免疫诱导的应答水平 非毒性蛋白的基因疫苗免疫应答水平与其表达水平成正比，而毒性蛋白的表达水平却不能太高，否则免疫应答水平可能反而下降。在小鼠，免疫应答水平与其年龄成负相关，其原因之一是年龄越大，疫苗质粒接种后的表达水平越低。 （三） 基因免疫诱导的免疫应答类型与接种途径的关系 基因疫苗肌肉接种免疫反应以Th1型反应为主，所产生的抗体主要是IgG2a，而基因枪接种以皮内Th2型反应为主，所产生的抗体主要是IgG1。
（四） 基因免疫抑制特异性IgE的产生 Raz(1996)等以pCMV-lacZ免疫小鼠，发现质粒免疫可抑制动物产生IgE。他们先给小鼠免疫纯化的β-gal，结果可诱发IgE的产生。然后，以pCMV-LacZ进行第二次免疫，结果IgE的水平降低66%～75%，这种抑制作用具有特异性。因为以pCMV-OVA替代pCMV-lacZ进行第二次免疫，并不出现这种抑制作用。因此，作者认为以编码过敏原的表达质粒进行免疫有可能用于过敏性疾病的治疗。
（五） 基因免疫可使无反应性动物产生免疫应答 如以HBsAg表达质粒免疫HBsAg转基因鼠，亦可诱导动物产生特异性免疫应答，而在一般情况下，HBsAg 转基因鼠对HBsAg是不产生免疫应答的。
（六） 基因疫苗与一些细胞因子的表达质粒共同免疫，可使免疫应答类型发生改变 如与IL-12和IFN-γ表达质粒共同免疫，基因疫苗的免疫应答类型主要是Th1，而Th2反应受到抑制。相反，IL-4表达质粒可显著增强Th2反应， 而Th1反应受到抑制。另外，基因疫苗接种新生动物可诱导出较强的免疫应答，不受或较少受母源抗体的影响。基因疫苗质粒既是抗原信息的携带者，同时又具有佐剂作用。
五、 影响基因疫苗免疫效果的因素
（一） 保护性抗原基因的选择 应选择病原体的主要保护性抗原基因，也可以将具有协同功能的基因共同组装入载体质粒。同时，还应注意尽可能选择对多数毒株都有保护作用的抗原基因。另外，保护性抗原基因编码的抗原结构，对DNA疫苗的免疫应答水平也能产生一定影响，如信号肽序列的有无，密码子的使用情况，抗原蛋白的稳定性，抗原蛋白是膜结合型，还是分泌型等，制苗时都应予以充分考虑。
（二） 载体质粒的选择 除上述载体的启动子和终止子等是影响基因疫苗免疫应答水平的重要元件外，还有载体内部其它一些序列和载体质粒的状态亦影响基因疫苗的应答水平。
Montgomcry等比较了两种含流感病毒神经氨酸酶(NP)基因的质粒V1和VJ1在小鼠体内的表达效果。V1的骨架来自pBR322，而VJ1的骨架为pUC19。结果表明VJ1的表达水平明显高于V1的水平。两者的启动子，增强子，加尾信号等均相同，所不同者，除质粒骨架有异外，还在VJ1的启动子CMV内去掉了一段500bp的序列，而V1的启动子未作任何改造。实验表明：这段序列含有基因表达的负调控区，可抑制基因在COS1细胞和CHO细胞中的表达。Danko等发现，共价闭环(CCC)型质粒pRSCLDNA的表达效果远高于线性化质粒pRSVLDNA。但Sakaguchi等在对新城疫基因疫苗的研究中却发现线性化的质粒优于闭环质粒。
（三） 免疫刺激序列的作用 人们发现6核苷酸链：5′RRGCYY 3′(R=A或G、Y=C或T)具有较强的非特异性免疫增强作用，该序列被称为免疫刺激序列(ISS)，他可诱导机体产生IFN-γ、IL-6、IL-12、TNF，以及促进B细胞的增殖，从而增强免疫应答强度。Sato等(1996)证实：天然含有ISS的核酸疫苗所诱导的免疫应答水平较不含ISS的要高20余倍。ISS在基因疫苗中的作用已受到学者们的广泛关注。
（四） 免疫调节因子在DNA疫苗中的作用 为提高DNA疫苗的免疫应答水平，许多研究者将免疫调节因子的基因克隆到DNA疫苗质粒中，使之与病原的保护性抗原基因共同表达， 以促进基因疫苗的免疫应答水平。如Larsent等将人的IL-6基因与马流感病毒的血凝素(HA)基因共同构建成疫苗质粒，以其接种小鼠，小鼠可以抵抗马流感病毒的攻击，而接种仅含HA基因的质粒的小鼠却只能减轻病毒攻击后的感染。Kim等将IL-12和GM-CSF基因分别与HIV-1的疫苗质粒共同免疫小鼠。结果IL-12抑制特异性抗体的产生，但却使免疫应答的类型由Th2转向Th1，并显著促进特异性CTL反应。已被用于这一目的免疫调节因子种类很多，除上述提到的外，还有IL-1、IL-4 、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18、TNF-α、TNF-β、IFN-γ等细胞因子 和CD28、CD86(B7-2)、CD80(B7-1)等共同刺激因子。
（五） 基因疫苗质粒的纯化 基因转移对质粒的质量要求非常高。质粒应该主要以超螺旋形式存在，无蛋白，脂多糖(LPS)含量低。由于基因疫苗所需质粒数量较大，因此，提取质粒的回收率应该较高才能满足要求。早期主要用CsCl密度梯度离心法获得高质量的质粒，但该方法成本高，回收率低。目前，多数用商品化的层析柱，其中Qiagen公司的AX层析柱是其中较为优异的一种，也是在实际工作中应用最多的。但即使如此，AX层析柱提取的质粒的LPS含量仍不低，回收率也不高。LPS是大肠杆菌细胞壁的一种成份，与DNA一样带负电荷，分子量不均一，因此，较难从质粒中除去。所幸LPS对基因免疫有双重作用，一方面LPS影响基因的转移，降低其表达水平，另一方面LPS是一种有丝分裂原，具有疫苗佐剂的作用。有实验表明，质粒中低水平的LPS具有促进基因免疫的作用。但该实验所用动物是小鼠，小鼠对LPS的耐受性较大，该实验结果是否适用于其它动物，是否具有普遍意义，有待进一步的试验。Wicks发明了一种提取质粒的方法，所提质粒LPS含量与二次CsCl密度梯度离心所提质粒的相当，但质粒的回收率是CsCl密度梯度离心纯化法和商品化层析试剂盒纯化法的5～10倍。
（六） 免疫途径 Fynan等详细研究过基因疫苗不同注射途径的免疫效果，结果免疫动物的阳性率分别为：肌注(i.m.)95%，静脉注射(i.v.) 83%，鼻内接种(i.n.) 76%，皮内(i.d.) 75%，皮下(s.c.) 67%，腹腔接种(i.p.)0%。但这一结果无严格的可比性，因他们所使用的剂量在各种途径不完全一致，如i.m.为200ug，i.d.为50ug，其余均是100ug。相反，有的实验结果表明皮内注射的免疫应答效率却较肌肉注射的高4倍，Fynan在同一实验中发现将DNA吸附在金粉颗粒上，然后用基因枪将金粉颗粒导入皮内，结果发现达到同样免疫效果所需的DNA量低于其它方法的250～2500倍。这说明基因枪是一种十分高效的接种方法。一般认为，免疫效果与体内的转染率(DNA摄取能力和基因表达水平)和转染细胞递呈抗原蛋白给免疫系统的效率两个因素有关。目前人们认为横纹肌是唯一能高效摄取并高效表达外源基因的组织，其效率是其它组织的100～1 000倍；但肌肉内免疫活性细胞(ICC)却很少，肌肉细胞所表达的外源蛋白递呈给淋巴细胞的效率低，因此，通过肌肉接种的免疫效果在理论上并不较其它组织好，这是须要今后继续探讨的问题。皮肤是机体防御病原的第一道屏障之一，其中存在有多种ICC，如淋巴细胞，巨噬细胞，树突状细胞。皮肤内的角质化细胞可以产生IL-1和TNF-β，进而活化ICC。皮肤内的Langerhans氏细胞在接触抗原后也能有效激活T淋巴细胞。并且，巨噬细胞和树突状细胞也可摄取抗原并引发免疫应答。因此，有理由认为皮内接种可为抗原递呈提供十分有效的途径。与皮肤一样，粘膜内亦含有十分丰富的ICC，它在抵抗感染过程中起到很重要的作用，Fynan的实验表明鼻内粘膜接种确可产生较好的免疫效果，但由于解剖位置的限制，接种不方便，这方面的研究还很少。
（七） 接种剂量、次数及容积 许多研究表明，免疫应答及保护率与接种剂量(1～100ug)和次数均呈一定程度的正相关。但不同的实验之间差异较大，且低剂量时(50ug以下)所得结果差异较大。如Yankanchas等在实验中发现给小鼠接种2μg的DNA，有的可产生很高水平的免疫应答，但有的则没有。Raz等用皮内接种的方法研究剂量与免疫应答的关系时发现，这种相关性只在接种的初期明显，他们用3～100μg的含NP的质粒皮内接种小鼠，发现接种初期，剂量越大，免疫应答越强，且出现越早，但3～4周以后，所有接种动物的抗NP抗体滴度几乎相同。
接种物的容积也很重要，Davis等用同样量的DNA溶于10μl和50μl的溶液中，然后i.m接种小鼠，结果表明50μl的表达水平高，且结果比较一致，而10μl的表达水平低，结果相差较大。
（八） 接种部位组织的预处理 Davis等(1993)用高渗(25%)蔗糖溶液在接种前15～30分钟预先注入接种部位，然后接种质粒DNA，结果发现，基因的表达水平较不作预先处理者提高，且结果比较一致。Davis等(1994) 在另一次实验中发现，在实验小鼠的接种部位预先注射心肌毒素，然后免疫，其抗体水平较对照组(预先用25%蔗糖处理者)高10倍以上。Danko等报道，免疫前，于接种部位的肌肉组织用蛇毒或局麻药处理，可使外源基因的表达提高40倍以上。Vitadello等的实验结果表明，丁派卡因预处理可使肌肉接种的CAT基因表达量提高80倍， 但丁派卡因对HSV基因免疫的促进作用很小甚至没有。Kriesal等发现维生素D3 亦能促进基因疫苗的免疫应答水平。
六、 基因疫苗的抗原基因和实验动物
根据接种对象，基因疫苗可大致分为3类：预防传染病(包括寄生虫病)的基因疫苗、治疗癌症的基因疫苗和抗过敏的基因疫苗等。而以用于预防传染病的基因疫苗的研究为多，目前，已报道的预防传染病的基因疫苗有50多种，而研究最多的是以下几种疾病：艾滋病、乙型肝炎、狂犬病、流感等。许多基因疫苗的技术环节均是通过研究这3种疾病的基因疫苗而获得的。现将研制预防传染病DNA疫苗所用保护性抗原基因及实验动物列表1141:

表1141DNA疫苗所用的抗原基因及实验动物

病毒[]保护性抗原基因[]实验动物

人,马,禽流感病毒[]血凝素(HA)、M蛋白、核蛋白(NP)[]小鼠，雪貉，非洲绿猴,鸡

[BHDW]新城疫病毒[]融合蛋白(F)、血凝素－神经氨酸酶(HN)[]鸡

[BH]狂犬病毒[]糖蛋白(gP)[]小鼠
[BH]Ebola病毒[]糖蛋白(gP)[]豚鼠
[HJ]
续表
病毒[]保护性抗原基因[]实验动物
牛疱疹病毒[]糖蛋白(gIV)、糖蛋白D(gD)[]小鼠，犊牛
[BHDW]鼠巨细胞病毒[]长区段蛋白(PPUL89)[]小鼠
[BH]口蹄疫病毒[]全基因组[]豚鼠
[BH]伪狂犬病病毒[]糖蛋白D(gD)[]仔猪
[BH]鸡马立克氏病病毒[]糖蛋白B(gB)[]鸡
[BH]鸡传染性喉气管炎病毒[]糖蛋白B(gB)[]鸡
[BH]鸭乙型肝炎病毒[]前S/S和S蛋白[]鸭
[BH]猫免疫缺陷病病毒[]全基因组[]猫
[BH]猴免疫缺陷病病毒[]囊膜蛋白(Env)、核心蛋白（Gag）[]猴
[BH]传染性造血器官坏死病病毒[]核蛋白、糖蛋白[]虹鳟鱼
[BH]日本乙型脑炎病毒[]核蛋白、糖蛋白[]豚鼠
[BH]猪瘟病毒[]糖蛋白E2(gP55)[]小鼠，家兔
[BH]牛腹泻粘膜病病毒[]糖蛋白E2(gP53)[]小鼠
[BH]轮状病毒[]衣壳蛋白VP4、VP6、VP7[]小鼠
[BH]猴多瘤病毒SV40[]肿瘤抗原[]小鼠
[BH]棉尾兔乳头状瘤病毒[]主要衣壳蛋白L1[]棉尾兔
[BH]淋巴细胞性脉络丛病毒[]糖蛋白、核蛋白[]小鼠
[BH]朊病毒[]细胞PrP(PRNP)[]小鼠(prp0/0)
[BH]犬细小病毒[]VP1[]犬
[BH]传染性支气管炎病毒[]核蛋白[]鸡
[BH]圣路易脑炎病毒[]膜蛋白和囊膜糖蛋白(prM/E)[]小鼠
[BH]森林脑炎病毒[]非结构蛋白(NS)[]小鼠
[BH]俄罗斯春夏脑炎病毒[]膜蛋白和囊膜糖蛋白(prM/E)[]小鼠
[BH]EpsteinBarr病毒[]糖蛋白(gP350)[]小鼠
[BH]结核杆菌[]hsp65、Ag85[]小鼠
[BH]牛布鲁氏菌[]L7/L12[]小鼠
[BH]肺炎链球菌[]肺炎球菌表面蛋白A(PspA)[]小鼠
[BH]破伤风毒素[]C片段[]小鼠
[BH]疏螺旋体(莱姆病)[]OspA[]小鼠
[BH]肺炎支原体[]基因组表达文库、A71和A81抗原[]小鼠
[BH]日本血吸虫[]副肌球蛋白[]小鼠
[BH]羊绦虫[]45抗原[]绵羊
[BH]弓形虫[]p30蛋白[]小鼠
[BH]泰勒氏焦虫[]主要裂殖子表面抗原[]小鼠

七、 基因疫苗免疫的安全性问题
人们对这一问题考虑得最多的有两方面: 一是动物在接种DNA疫苗后，外源基因是否可能整合入宿主细胞的染色体，然后导致细胞转化，发生癌变；二是DNA疫苗是否会诱发产生抗DNA抗体并导致动物发生自身免疫性疾病。
Nichols对外源基因进入细胞后是否与宿主细胞的染色体基因组发生整合进行了大量的研究，但并未发现有整合的证据。笔者认为外源基因进入细胞后，存在整合入染色体基因组的可能性，但不同性质的基因整合后发生的生物学效应差异很大，有的容易导致转化如逆转录病毒，DNA肿瘤病毒，有的则不易发生转化。作为基因疫苗，DNA分子中有表达高免疫原性蛋白的外源基因。如果被整合入细胞染色体基因组并导致细胞转化，则这样的细胞不可能长期存活下去，因为转化细胞带有可被ICC识别的抗原，而被宿主的免疫系统消灭。肿瘤之所以存在，其中一个重要因素是肿瘤细胞的抗原性弱，不易被ICC所识别，因此，从这方面讲，DNA疫苗应该是安全的。
至今，绝大多数研究表明DNA疫苗不可能诱发抗DNA抗体。因为疫苗质粒是双链DNA， 而双链DNA一般不会诱导抗自身抗体产生，即使人们有目的诱导动物产生抗双链DNA抗体也是一件不容易的事。Mor 等的研究表明，在接种DNA疫苗后，小鼠体内分泌抗DNA自身抗体B
细胞数量增多3倍，而血清中的抗DNA自身抗体滴度只短暂升高，但这与自身免疫性疾病无关。他们用易患狼疮(一种自身免疫性疾病)的NZB×NZW杂交小鼠所作的研究表明，接种DNA疫苗并不能激发小鼠的这种疾病，亦不会改变该病的发病过程。 因此，Mor等认为DNA疫苗既不会引发也不会加重全身性自身免疫性疾病的发生。
八、 基因疫苗免疫的发展前景
基因疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗，世界上许多国家的科学家对此进行了大量的研究。自20世纪90年代以来，每年有关这方面的研究报告直线上升。1994年5 月，WHO召开了基因疫苗国际会议，会议充分肯定了核酸疫苗的应用前景。2000年3月，科学家报道了HIV基因疫苗的人体试验，9个HIV感染无症状者接受了免疫接种，试验前他们没有或只有很低的抗HIV免疫应答，免疫后均产生HIV特异性CTL应答。同年4月Stephen等(自Internet)进行了疟疾基因疫苗的I期临床试验，该试验的目的是评价疟疾基因疫苗的安全性和诱导产生免疫应答的水平，实验结果良好。Stephen等准备作II期临床试验，以确定疟疾基因疫苗诱导的保护性免疫应答。动物接种基因疫苗后产生免疫应答是肯定的，对其应用的忧虑主要是安全性问题，但迄今，并未在实验中发现存在安全性问题的证据，尤其是当应用于动物，可较少考虑这方面的问题。实际应用之前，还应解决的一个问题是基因疫苗免疫程序的规范化。目前，尚没有行之有效的关于基因疫苗的接种剂量、接种次数、接种途径以及预处理等方面的实验资料。由于基因疫苗接种剂量少，而受各种因素的影响大，因此，不同研究者的研究结果差异较大，这无疑是实际应用之前必须要解决的问题。
（一） 今后研制基因疫苗的主要对象 据报道，以下四方面应是研制基因疫苗的重点：
1. 不能或难于培养的病原 如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人乳头瘤病毒(HPV)、麻风杆菌、EB病毒(EBV)、血吸虫、结核分枝杆菌、兔出血症病毒、鸡马立克病毒、鸡传染性贫血病毒等。
2. 有潜在致癌性或有免疫病理作用的病原 前者如I型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、EBV、HPV、马传染性贫血病毒等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV)、登革热病毒(GDV)、阿留申病病毒(ADV)和猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)。 3. 易变异的病原 流感病毒、轮状病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等。
4. 可能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗。
（二） 基因疫苗在其他方面的应用
1. 制备高免抗血清 Sundaramp等将表达β半乳糖苷酶(β-gal)的质粒pCMV-LacZ和棉尾兔多型瘤病毒L1衣壳蛋白的质粒pCMV-CRL1分别包被在金粉颗粒上，然后用基因枪皮内免疫兔，免疫剂量为30ug质粒，免疫方法为分30点免疫，每点1ug质粒，共免疫3次。结果，第一次免疫后，血清用ELISA检测，其特异性的抗体效价即可达1：24 000～1：120 000。加强免疫后抗体效价略微上升到1：8 000～1：120 000。这说明将表达质粒用基因枪的方法接种动物是一种非常有效的制备高免血清的方法，并且这样制备的血清特异性好，成本低，尤其对难于纯化的抗原或来源有限的抗原，该法更有其优越性。
2. 制备单克隆抗体 Barry 等以人生长激素(hGH)的表达质粒免疫BALB/c小鼠3次后，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合，结果获得了34个稳定分泌hGH特异性抗体的阳性杂交瘤克隆。
3. 研究病原的保护性抗原 以往研究某一病原的保护性抗原的方法，一般是先分离纯化该病原的各种抗原，然后将获得的抗原免疫动物，观察是否可诱导动物获得保护性免疫反应。另外一种研究方法是先制备获得具有中和活性的McAb，然后用这种McAb分析病原的各种抗原。这两种方法均费时、费力，并且可能筛选不到所有的保护性抗原。基因疫苗出现后，这一工作将变得较为容易。方法是先构建病原的基因组表达文库，然后，用该文库免疫动物，并从文库中筛选能获得可诱导产生免疫保护反应的抗原基因。由于构建病原的基因组表达文库相对较纯化抗原和制备McAb容易得多，并且可获得病原的所有抗原信息，因此，该方法的优越性是显而易见的。

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