不同地域犬小孢子菌转录间隔区遗传特性分析.pdf

遗传育种与繁殖812023.100 引言随着社会的发展，伴侣动物在人类活动中扮演着重要的角色，然而不规范的饲养和管理方式使得伴侣动物真菌性皮肤病已成为不可忽视的问题。犬小孢子菌是引起伴侣动物真菌性皮肤病的主要病原。其可引起犬、猫及多种家畜和人体浅表皮肤真菌病1-2。因此，犬小孢子菌的防治对于公共卫生具有重要意义。核糖体基因簇在真菌系统学研究中具有非常重要的意义3，内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）ITS1和ITS2在核糖体RNA的加工过程中常被剪切，其因在真菌进化过程中受到的自然选择压力小，进化速度快，序列多态性广泛的特点被用于种间分类4。同样，ITS也作为检测犬小孢子菌PCR的方法的目标基因，用于多重PCR方法的建立5。鉴于此，本研究通过NCBI数据库检索不同国家收稿日期：2023-08-08基金项目：2023年新疆草食动物新药研究与创制重点实验室项目作者简介：胡嘉莘（1997-），男，汉族，辽宁辽阳人，硕士，研究方向：小动物临床。*通信作者简介：郭庆勇（1973-），男，汉族，山东菏泽人，博士，教授，研究方向：临床兽医学研究，新疆农业大学动医学院党委副书记、院长。胡嘉莘，李建龙，王美玲，等不同地域犬小孢子菌转录间隔区遗传特性分析J现代畜牧科技，2023，101（10）：81-84doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.10.022HU Jiashen，LI Jianlong，WANG Meiling，et alAnalysis of Genetic Characteristics of Internal Transcription Spacer Region of Microsporidium Canis from Different RegionsJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，101（10）：81-84不同地域犬小孢子菌转录间隔区遗传特性分析胡嘉莘，李建龙，王美玲，李才善，杨昭然，郭庆勇*（新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）摘要：为探究不同国家地区犬小孢子菌遗传特点及系统进化关系，对7个不同国家地区11条犬小孢子菌“ITS1-5.8S-ITS2”基因序列进行同源比对，单倍型分析及系统进化分析。结果显示，来自7个不同国家的11条犬小孢子菌有5个多态性位点，分别为86、87、89、487、650，单倍型（h）分析将其分为3个单倍型（h），其中h1和h3各含有1条基因序列，剩余序列均属于h2。同源性分析发现，11条犬小孢子菌同源性为99.75%。系统进化结果显示，中国、埃及和伊拉克3个地区的犬小孢子菌亲缘关系较近，新疆地区的犬小孢子菌呈现单独分支，表明其与其他地区的犬小孢子菌亲缘关系较远。该研究7个不同国家地区的犬小孢子菌遗传特点和系统进化进行分析，旨在为后续的相关研究提供理论参考。关键词：犬小孢子菌；内转录间隔区；单倍型；系统进化中图分类号：S852.723文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.10.022Analysis of Genetic Characteristics of Internal Transcription Spacer Region of Microsporidium Canis from Different RegionsHU Jiashen，LI Jianlong，WANG Meiling，LI Caishan，YANG Zhaoran，GUO Qingyong*（College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi Xinjiang 830052，China）Abstract：In order to explore the genetic characteristics and phylogenetic relationship of Microsporum canis in different countries，the gene sequences of“ITS1-5.8S-ITS2”in 11 M.canis were homologous comparison，haplotype analysis and phylogenetic analysis in 7 different countriesThe results showed that 11 M.canis from 7 different countries had 5 polymorphic loci，86，87，89，487，650，which were divided into 3 haplotypes（h）by haplotype（h）analysis，of which h1 and h3 each contained 1 gene sequence，and the remaining sequences belonged to h2The homology analysis found that the homology of 11 M.canis was 99.75%The phylogenetic results showed that M.canis was closely related in China，Egypt and Iraq，and a separate branch in Xinjiang，indicating that it was closely related to M.canis in other regionsIn this study，the genetic characteristics and phylogeny of M.canis were analyzed in seven different countries and regions，aiming to provide theoretical reference for subsequent related researchKeywords：Microsporum canis，internal transcriptional spacer，haplotypes，phylogenetic analysis遗传育种与繁殖82 2023.10地区犬小孢子菌核糖体基因序列以完整的“ITS1-5.8SITS2”基因序列进行不同国家地区犬小孢子菌的系统进化及遗传多样性分析，旨在为犬小孢子菌的进化和以ITS基因为靶标的分子诊断方法的建立提供理论参考。1 材料与方法1.1 目标序列获取在NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库以犬小孢子菌拉丁名“Microsporum canis ITS1 and ITS2”为关键词检索具有完整犬小孢子菌内转录间隔区序列信息。以具有完整ITS区域为模板序列进行在线BLAST，从BLAST结果中按照不同地区、不同来源为条件进行目标基因序列选筛选，新疆地区的序列通过直接检索获得。1.2 遗传多样性分析1.2.1 多态性及单倍型分析单倍型分析中以不同国家和地区犬小孢子菌“ITS1-5.8SITS2”基因区域通过DNAsp 6.12.03和Network10.2进行不同国家地区犬小孢子菌多态性及单倍型分析。1.2.2 系统进化分析系统进化分析以石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum，登录号：AJ970141）为外群，通过MEGA X软件对所有序列进行比对，修剪后，通过Tamura 3-parameter模型，系统进化检验Bootstrap=1 000构建ML（Maximum Likelihood）进化树，可视化通过iTOL进行。2 结果2.1 多态性及单倍型分析通过DNAsp 6.12.03软件对来自7个不同国家的11条犬小孢子菌“ITS1-5.8SITS2”基因序列进行多态性分析发现86、87、89、487、650，共5个位点为多态性位点，见图1。单倍型（h）分析发现11条序列可被分为3个单倍型，其中h1和h3各含有一条基因序列，h2最多，含有9条基因序列，其中新疆地区的犬小孢子菌单独为h3。具体结果见表1、图2。图1 多态性位点分析结果遗传育种与繁殖832023.10表1 不同国家地区犬小孢子菌单倍型分析具体信息单倍型（h）所含基因序列h1AJ000626h2KC311348、MT633048.1、MT423727、MT487795、MT487799、MT632638、MT787286、MW683015、ON181993h3AB663213图2 不同国家地区犬小孢子菌单倍型分析结果2.2 系统进化分析对最终选取的来自不同国家地区的11条犬小孢子菌“ITS1-5.8SITS2”区域进行同源比对，发现其同源性为99.75%，见图3。系统进化分析发现11条来自7个不同国家的犬小孢子菌，聚为一大支，与外群石膏样小孢子菌（登录号：AJ970141）分支不同。其中，中国、埃及和伊拉克3个地区的犬小孢子菌表现出了较近的亲缘关系，来自新疆地区的犬小孢子菌与其他国家地区的犬小孢子菌亲缘关系较远，呈现单独分支，具体结果见图4。3 讨论真菌性皮肤病是临床上最为常见的皮肤疾病之一，其中犬小孢子菌作为导致犬、猫皮肤病的主要致病菌6-7严重危害犬、猫及畜主的健康。真菌性皮肤病不仅导致动物本身的生活质量严重下降，影响其身体健康，且携带该病的动物与人接触后直接传染，也可通过携带真菌孢子的物品及环境间接传染。每年因该病就诊的患者占总病例的25%。根据宿主的不同可分为亲人性真菌、亲土性真菌和亲动物性真菌8，该菌在1843年首次发现，是一种非常重要的条件性致病菌，免疫力下降、机体疲劳、菌群紊乱都可导致皮肤感染。该病呈现出四季均发图3 不同国家地区犬小孢子菌“ITS1-5.8SITS2”区域同源性结果图4 不同国家地区犬小孢子菌系统进化分析结果遗传育种与繁殖84 2023.10生的特点，尤其在炎热潮湿的条件下发病率高，寒冷干燥地区发病率低，同时病原菌在干燥的环境下也具有很强的适应力，在烈日下可生存数月之久9。由该菌引起的真菌性皮肤病在世界范围内广泛存在，是中国大部分地区最常见的真菌病原体之一10，对动物及人类健康造成严重危害，通常以多灶性脱发、皮肤瘙痒、红斑、脓肿、疤痕、脱屑和圆形病变为特征。ITS被作为PCR鉴定和基因比对的关键基因4，以及基因序列分析。例如，李锋等11发现来自从格力犬体表分离的真菌与犬小孢子菌ITS序列（登录号：FJ 385030.1）相似性为99%。然而，目前对于ITS基因序列的主要应用是在PCR方法的建立以及很少部分的系统进化分析中，对于不同国家地区犬小孢子菌的系统进化及遗传特点的研究鲜有闻。鉴于此，本研究采取了与Grser Y等12在研究裸囊菌科时相似的策略，对来自不同国家地区的犬小孢子菌进行单倍型及系统进化分析。本次研究对来自7个不同国家的犬小孢子菌进行基于“ITS1-5.8S-ITS2”基因序列的遗传特点和系统进化分析。结果显示，来自11个国家的犬小孢子菌可被分为3个单倍型，其中h1和h3各占1个基因序列，h2拥有9个基因序列，多态性位点有5个，分别是86、87、89、487、650。在进化分析之前，比较来自不同国家地区犬小孢子菌的种内同源性，结果显示其同源性高达99.75%，说明来自不同国家地区的犬小孢子菌亲缘关系非常近，随后的系统进化分析得到了与单倍型分析类似的结果。具体来说，来自7个不同国家的犬小孢子菌，聚为一大支，来自新疆地区的犬小孢子菌和模板序列（AJ000626）与其他国家地区的犬小孢子菌亲缘关系较远。以上结果为ITS作为犬小孢子菌分子诊断目标基因提供了理论依据。现如今，中药已被用于治疗或抑制犬小孢子菌。例如李曼等13进行了中药体外抑菌活性研究，研究表明射干、五倍子、姜黄、栀子对M.canis等株皮肤癣菌致病真菌均具有较好的体外抗菌活性；陈章宝等14采用了苦参提取物与白鲜皮提取物的联合药敏试验，研究表明对M.canis等3株皮肤癣菌致病真菌的抑制效果具有相加作用；庄素琪等1研究表明，香鳞毛蕨有效部位对12株M.canis呈现出了剂量依赖性的抑菌和杀菌作用。梁沂等15研究表明，中药组方药浴具有副作用小、效果好、不含激素等特点，在临床治疗犬小孢子菌感染方面具有显著辅助效果。本次研究的结果表明，不同国家地区犬小孢子菌具有高度同源性。因此，推断这些中药可能对不同国家地区的犬小孢子菌具有一定的抑制作用，甚至不同国家地区的犬小孢子菌中编码丝氨酸水解酶的潜在治病因子FSH116-17同样具有高度同源性，这些信息或许有助于以FSH1编码的丝氨酸水解酶为靶标进行天然产物抑制剂的筛选，这将有助于中草药及其成分在抑制犬小孢子菌中进一步发挥作用。参考文献1庄素琪，张莉莉，唐春萍，等香鳞毛蕨有效部位乳膏对犬小孢子菌的影响J中成药，2020，42（5）：1 174-1 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