超高效液相色谱-串联质谱法测定现制茶饮中7种食品添加剂.pdf

专题论著JiangsuJPrevMed,Vol.34,No.5521江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期超高效液相色谱-串联质谱法测定现制茶饮中7 种食品添加剂王春蕾，戴丽，李冰冰，黄珍珍，王坤盐城市疾病预防控制中心，江苏盐城2 2 40 0 0摘要：目的建立测定现制茶饮中安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、日落黄、亮蓝、赤藓红7 种食品添加剂的超高效液相色谱-串联质谱法。方法样品经40%甲醇-水提取，加人适量沉淀剂，采用BEHCi8（2.1m m 10 0 m m，1.7 m）色谱柱分离，以5mmol/L乙酸铵-乙为流动相，梯度洗脱，用多反应监测模式（MRM）进行检测，外标法定量。结果经优化质谱、色谱条件，选择负离子模式（ESI），样品采用5mmol/L乙酸铵+10 mmol/L乙酸铵+2 0 mmol/L乙酸铵-乙体系梯度洗脱，40%甲醇作为提取溶剂，选择0.1mL亚铁氰化钾+0.1mL乙酸锌溶液作为沉淀剂，7 种食品添加剂在超高效液相色谱-串联质谱法所测质量浓度范围内线性良好，相关系数r均 0.995；低、中、高3个水平加标回收率为8 2.0%118.7%，相对标准偏差（RSD）为1.6%7.2%；方法检出限为0.0 2 4 0.0 6 0 mg/kg，定量限为0.0 8 0.2 0 mg/kg。结论该方法前处理简单快速，准确可靠，适用于现制茶饮中7 种食品添加剂含量测定。关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；现制茶饮；食品添加剂中图分类号：R113文献标识码：A文章编号：10 0 6-90 7 0(2 0 2 3)0 5-0 52 1-0 4Development of an ultra-performance liquid chromatography-tandemmass spectrometry for determination of 7 types of food additivesin ready-made tea drinksWANG Chun-lei,DAI Li,LI Bing-bing,HUANG Zhen-zhen,WANG KunYancheng Municipal Center for Disease Control and Prevention,Yancheng,Jiangsu 224000,ChinaAbstract:Objective To develop an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)fordetermination of 7 types of food additives in ready-made tea drinks,including acesulfame,sodium cyclohexyl sulfamate,sodium saccha-rine,aspartame,sunset yellow,brilliant blue and erythrosine.Methods Drink samples were subjected for 40%methanol-water extrac-tion,added with precipitants and separated on BEH Cis columns(2.1 mmx100 mm,1.7m).The 5 mmol/L ammonium acetate-aceto-nitrile buffer was employed as mobile phase,and UPLC-MS/MS was performed with the multiple reactions surveillance(MRM)modefollowing gradient elution.In addition,a quantitative analysis was performed using the external standard method.ResultsFollowing op-timization of mass spectrometric andchromatographic conditions,UPLC-MS/MS was performed with the negative electrospray ionizationmode.Drink samples were separated with the 5 mmol/L ammonium acetate,10 mmol/L ammonium acetate and 20 mmol/L ammoniumacetate-acetonitrile system,with 40%methanol as the extraction solvent and 0.1 mL potassium ferrocyanide and 0.1 mL zinc acetate so-lution as precipitants.The UPLC-MS/MS assay showed a good linear relationship at the assigned mass concentrations of seven types offood additives(all r values 0.995),and the spiked recovery rates were 82.0%to 118.7%at low-,moderate-and high-levels,withrelative standard deviations of 1.6%to 7.2%.The UPLC-MS/MS assay showed 0.024 to 0.060 mg/kg limits of detection,and 0.08 to 0.20 mg/kg limits of quantification.Conclusions The developed UPLC-MS/MS assay is simple and rapid in pretreatment,accurate andreliable,which is feasible for determination of 7 types of food additive in ready-made tea drinks.Keywords:Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Ready-made tea drinks;Food additive为改善食品风味、保证营养价值和延长贮藏运输时间等生产工艺需要，食品添加剂已成为食品工艺中重要组成部分1-2 ，但过量摄人会对健康造成一定损害3-。近些年来,奶茶、果茶等现制茶饮在生活中随处可见，尤其受到青少年群体的喜爱6-7 。茶饮中各种添加剂的检出或超标屡见不鲜，存在一定的安全隐D0I;10.13668/j.issn.1006-9070.2023.05.003作者简介：王春蕾（1990 一），女，江苏盐城人，主管技师，主要从事理化检验工作通信作者：王坤，主任技师，E-mail：10 59452 18 1 q q.c o m522Jiangsu JPrevMed,SerVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9月第34卷第5期患。国标食品添加剂使用标准（GB27602014）规定了食品添加剂的种类和限值，制定了多种食品添加剂的检测方法，但现有国标方法并不能同时测定现制茶饮中多种添加剂，建立快速、高效的检测方法具有实际意义(8-10 1。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法，建立同时检测现制茶饮中4种甜味剂（安赛蜜、糖精钠、甜蜜素和阿斯巴甜）和3种着色剂（赤藓红、日落黄和亮蓝）的检测方法。1材料与方法1.1仪器与试剂仪器：WatersTQD液质联用仪（Wa t e r s 公司）,BEHCis色谱柱（2.1mm100mm，1.7m，Wa t e r s 公司），振荡器（HeidolphMulti Reax），纯水仪（赛默飞GenPurePro），超声仪（昆山超声仪器有限公司），高速冷冻离心机（赛默飞ST16R）。试剂：乙腈、甲醇（色谱纯，安徽天地公司），乙酸铵、亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯，国药集团）。标准品：安赛蜜（批号2 2 0 6 0 36 1）、糖精钠（批号2 10 7 0 349）、甜蜜素（批号4032005）、阿斯巴甜（批号3352 0 0 4）、赤藓红（批号0892004）、日落黄（批号7 16 2 0 0 3）、亮蓝（批号21040580）购自坛墨质检。购置2 0 份奶茶和果茶。1.2样品前处理准确称取均质后茶饮样品5.0 g（准确至0.0 1g）于50 mL塑料离心管中，加人8 mL40%甲醇-水溶液，超声提取2 0 min，加入0.1mL亚铁氰化钾（92 g/L）和0.1mL乙酸锌溶液（18 0 g/L）混匀振荡1min,8000r/min离心5min,离心半径9.5cm，上层清液转移至50 mL塑料离心管中，残渣加入5mL40%甲醇-水溶液超声复提5min，离心后合并上清液，用40%甲醇-水溶液定容至2 0 mL，取上清液0.5mL，加人0.5mL乙酸铵-水溶液（5mmol/L）稀释混匀，过0.22m聚四氟乙烯滤膜后上机测定。1.3?色谱条件色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHCis柱(2.1 mmx100mm,1.7m);柱温:35;流速:0.3mL/min;进样体积：10 L;流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙睛溶液，梯度洗脱程序见表1。表1仓色谱洗脱程序时间(min)流速(mL/min)A(%)B(%)0.00.395.05.00.50.395.05.05.20.35.095.07.50.35.095.07.60.395.05.010.00.395.05.01.4质谱条件电喷雾电离负离子模式（ESI），采用多反应监测模式（MRM），毛细管电压3.0 kv，离子源温度：150，脱溶剂气温度：6 0 0，脱溶剂气流量：10 0 0 L/h，锥孔反吹气流量：50 L/h，目标化合物质谱参数见表2。表2目标化合物质谱参数扫描母离子子离子锥孔电压碰撞电压化合物模式(m/z)(m/z)(V)(V)安赛蜜ESI161.978.0282482.0*14甜蜜素ESI178.080.0*502295.922糖精钠ESI-181.942.04820105.9*10阿斯巴甜ESI293.0200.03214261.1*10日落黄ESI406.9206.9*5630327.022亮蓝ESI747.0170.1*9264561.144赤藓红ESI834.5536.87434662.7*30注：*为定量离子。1.5基质标准工作溶液配制称取安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、赤藓红、日落黄、亮蓝各50.0 mg于50mL容量瓶中,用纯水定容至刻度，得各标准储备溶液（质量浓度1mg/mL）；取各标准储备溶液1mL于100mL容量瓶中,用纯水定容到刻度，得混合标准中间溶液（质量浓度10 g/mL）；再取混合标准中间溶液2.5、5.0、10、2 5、50、10 0 L，加人空白基质提取溶液50 0 L，用95%5mmol/L乙酸铵-水溶液稀释定容至1mL，配制成质量浓度为0.0 2 5、0.0 5、0.1、0.2 5、0.5、1.0 g/mL基质标准系列工作溶液。2结果2.1质谱条件优化首先采用infusion模式对7 种目标物单独扫描，根据化合物分子式，在正、负离子监测模式下进行一级质谱分析，选择响应值最高和最稳定母离子峰，调整毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂温度等条件，优化一级质谱条件，打开碰撞气体，采用多反应监测模式（MRM），进行二级质谱扫描，选择2 个响应较高的碎片离子作为该化合物的子离子，调整碰撞电压，优化子离子。结果显示,7 种添加剂中除阿斯巴甜均带有Na离子,在正离子模式中,特征母离子不明显,阿斯巴甜在正离子模式下具有较高响应值，比在负离子模式下高12个数量级。为满足同时检测目的，选择负离子模式（E SI），优化后的质谱条件见表2。2.2色色谱条件优化乙酸铵-乙/甲醇体系是常用的分离流动相。本研究考察了5mmol/L乙酸铵、10mmol/L乙酸铵、2 0 mmol/L乙酸铵-乙腈体系分离效果和响应值。对同一浓度水平混合标准溶液进行分析，3种流动相均可达到较好分离效果。比较5mmol/L乙酸铵-乙腈、5mmol/L乙酸铵-甲醇体系梯度洗脱分离效果，5mmol/L乙酸铵-乙睛体系峰形更好，响应值较高。选择后者为本次研究的流动相体JiangsuJPrevMedV01.34No.5523江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期系。调整流动相比例，达到最佳的分离效果和峰形2.3前处理条件优化2.3.1提取条件7种目标物均为极性化合物，易溶于水。考察了水、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、6 0%甲醇的提取效率,发现大部分目标物在40%甲醇提取时具有较高响应值，见图1。本研究采用40%甲醇作为提取溶剂。2.3.2基质效应比较分别用初始流动相和空白基质提取溶液配制相同浓度的混合标准溶液，通过公式计算基质效应（ME）：M E=（A/B-1）10 0%。A 为空白基质配制标准溶液响应值,B为初始流动相配制相同浓度标准溶液响应值。ME0为基质增强,ME0为基质抑制，ME绝对值 0.1mL时,阿斯巴甜、日落黄、赤藓红基质抑制作用显著；加人0.1mL亚铁氰化钾+0.1mL乙酸锌溶液作为沉淀剂,除了安赛蜜,其余6 种添加剂ME绝对值均 0.995。以3倍S/N为检出限，10 倍S/N为定量限，7 种添加剂检出限在0.0 2 4 0.0 6 0 mg/kg，定量限在0.0 8 0.2 0 mg/kg。见表3。在空白样品基质分别加人低、中、高3个水平质量浓度的加标溶液，重复测定6 次，结果显示，7 种添加剂加标回收率为8 2.0%118.7%，相对标准偏差(RSD)为1.6%7.2%。见表4。表3方法学参数相关结果相关系数检出限定量限化合物线性方程()(mg/kg)(mg/kg)安赛蜜y=30.769 1 x+512.043 00.995 80.0360.12甜蜜素y=13.840 1 x+63.667 40.999.50.0240.08糖精钠y=2.7324 8 x+56.060 40.998 20.0480.16阿斯巴甜y=12.075 9 x-57.546 80.999 20.0240.08日落黄y=0.93210 x-22.78770.996 60.0600.20亮蓝y=11.357 7 x-106.655 00.999 10.0240.08赤藓红y=15.6175x-64.751 50.99700.0240.08表4加标回收率及精密度结果低(0.2 mg/kg)中(1.6 mg/kg)高(4.0 mg/kg)保留时间化合物回收率RSD回收率RSD回收率RSD(min)(%）(%)(%)(%）(%）(%）安赛蜜1.4384.65.9114.52.9112.02.1甜蜜素2.1186.45.6100.33.598.12.2糖精钠1.9282.04.6102.73.2102.12.6阿斯巴甜2.5686.23.593.92.091.93.8日落黄2.13118.77.295.55.789.34.4亮蓝2.7395.04.5101.31.6100.22.8赤藓红2.9693.95.289.62.487.85.72.5样品检测检测市场上2 0 份现制茶饮，结果检出安赛蜜6 份（0.6 5 12.0 0 mg/kg），甜蜜素5份（2.90 12.0 0 mg/k g），阿斯巴甜4份（0.51 2.30mg/kg），日落黄2 份（0.2 9 0.34mg/kg），其余均未检出。按GB27602014规定饮料中限值（安赛蜜0.3g/kg，甜蜜素0.6 5g/kg，阿斯巴甜0.6 g/kg，日落黄0.0 5g/kg），检出含量均未超标。（下转第6 2 1页）编辑：张熳上接第52 3页）编辑：张煜JiangsuJ PrevMed,Vol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期621生存时间无统计学关联,与董贤雅 、刘梅艳 7 等调查结果不同,可能与本样本量偏小、老年病例占比较低有关。未进行ART患者死亡风险是已进行ART的11.6 2 倍(95%CI:5.6723.85）,有研究表明,规范的抗病毒治疗能够明显抑制HIV/AIDS患者的病毒载量，保护机体免疫功能，减少发生机会性感染和肿瘤，从而延长患者寿命 18 。今后应加强HIV/AIDS患者随访管理,特别是首次CD4值较低者,持续开展艾滋病健康教育,改善患者对疾病的认知,提高检测、治疗依从性,切实降低 HIV/AIDS患者死亡率，延长生存时间，提高生存质量。参考文献1Christopher JLM,Katrina FO,Caterina G,et al.Global,regional,andnational incidence and mortality for HIV,tuberculosis,and malaria during19902013:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study2013J.Lancet,2014,384(9947):1005-1070.2杨荣荣,严月康,龚雪梅，等.赣州市2 0 0 6 2 0 18 年艾滋病抗病毒治疗患者生存及影响因素研究 J.江苏预防医学,2 0 2 0,31(2)：12 2-12 4.3庄梅珠，许爱玲.无锡市梁溪区艾滋病患者生存时间与影响因素 J.江苏预防医学,2 0 2 0,31(4)：359-36 2.4伍芳辰.黔南州19 9 7 2 0 15年HIV/AIDS病人死亡因素分析 J.中国艾滋病性病,2 0 17,2 3(3):2 6 4-2 6 6.5刘继旭，张虞，田道珍，等.2 0 0 7 2 0 19 年大竹县艾滋病患者生存状况及其影响因素分析 J.预防医学情报杂志,2 0 2 1,37(5)：6 51-6 56.6董贤雅，胡安艳，李正旭，等.云南省保山市19 9 0 2 0 2 0 年HIV/AIDS病例生存分析 J.中国热带医学,2 0 2 1,2 1(11)：10 7 5-10 8 0.7刘梅艳，张宏，陈传刚.19 8 7 2 0 2 0 年福州市HIV/AIDS病例生存分析3讨论本研究优化了测定茶饮中食品添加剂的质谱条件和色谱条件，采用负离子模式，MRM监测，用5mmol/L乙酸铵-乙睛体系梯度洗脱；优化了前处理过程，选择40%甲醇作为提取剂，加人0.1mL亚铁氰化钾+0.1mL乙酸锌溶液作为沉淀剂；同时采用空白基质标准曲线定量，改善基质效应。为了减少溶剂效应，初始流动相稀释1倍后进样。结果显示，建立的超高液相色谱-串联质谱法测定现制茶饮中多种食品添加剂，7 种目标物可以达到较好的分离度、准确度、精密度；方法的线性良好，操作简单，快速准确，适用于日常检测。实验中发现，相对于奶茶而言，成分比较简单的现制纯果茶或纯茶制品等饮品，可用标准溶液定量（安赛蜜除外），基质干扰不显著；对添加了珍珠、红豆和芋圆等茶饮，实验前要充分均质处理，测定的结果才能更加真实准确。参考文献1王常柱，武杰，高晓宇.食品添加剂的基本属性、主要功能与三大J.预防医学论坛,2 0 2 1,2 7(11):8 31-8 34.8李洋，王娟，贺淑芳，等.19 9 52 0 15年北京市HIV/AIDS患者HIV阳性诊断后的生存时间及相关因素研究 J.中国艾滋病性病，2 0 17,2 3(2):102-106.9徐园园，李小杉，吴苏姝，等.南京市2 0 0 42 0 16 年接受抗病毒治疗HIV/AIDS患者生存分析 J.中国公共卫生,2 0 18,34(4)：47 3-47 8.10】蔡衍珊，罗叶飞,陈希，等.2 0 17 2 0 19 年现住广州的新确证HIV/AIDS病例生存情况分析 J.中国预防控制杂志,2 0 2 1,2 2(5：38 4-38 9.11】王子培，朱有霞，高登风.19 9 2 0 2 1年南京江北新区艾滋病病例生存状况及影响因素 J.江苏预防医学,2 0 2 2,33(5：519-52 3.【12】赵立华,靳峰,张蕴慧，等.2 0 0 6 2 0 18 年宁夏成人艾滋病患者抗病毒治疗后生存及其影响因素 J.宁夏医科大学学报，2 0 2 1,43（7)：725-728.13解瑞青，柯贤洲，钱足庶.湖北省黄石市2 0 0 32 0 18 年艾滋病抗病毒治疗患者生存分析 J.中国热带医学,2 0 2 0,2 0(2)：142-147.14 Huang P,Tan JG,Ma WZ,et al.Outcomes of 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