不同载体在枯草芽孢杆菌菌剂中的作用研究.pdf

213中国土壤与肥料2023（7）doi：10.11838/sfsc.1673-6257.22365不同载体在枯草芽孢杆菌菌剂中的作用研究李慧芬1，方安然2，冯海霞1，赵明珠3，周波3*（1青岛尚德生物技术有限公司，山东青岛266111；2青岛红樱桃生物技术有限公司，山东青岛266111；3山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018）摘要：载体的选择对微生物菌剂作用的发挥至关重要，考察了不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 的稳定性、土壤增殖能力、植物促生能力和抑菌抗病能力的影响。结果表明，在氨基酸微量元素型（AA-TE）液体肥料中，额外添加乳酸钠载体，可极显著提升枯草芽孢杆菌 GY801 的 6 个月留存率至 87.07%，相比于只含菌对照组 46.39%的留存率提升了 87.7%（P0.01）；本研究还在合适的土壤增殖条件下，比较了不同载体对该菌土壤增殖能力的影响，确定海藻精载体可显著提高 GY801 在土中的增殖能力，对照组 7、15 和 30d 的土壤增殖倍数分别为 110、57 和51 倍，额外添加海藻精组可分别提升至 154、94 和 79 倍，增幅分别为 40.0%、64.9%和 54.9%；尖椒苗促生试验表明，海藻精载体显著增强了 GY801 的促生作用，与不加载体只含菌的对照组相比，显著增加了壮苗指数、根冠比、全株干重、根干重等指标，增幅分别为 7.7%、8.3%、10.1%、16.7%（P93%；复合肥 NPK 养分54%时，菌量留存率在前 9 个月下降 29.9%，达显著差异（P97%，各跟踪时间点菌量留存率无显著差异（P0.05）；枯草芽孢杆菌与含氨基酸微量元素型菌剂共存时，菌量持续下降，各跟踪时间点之表1枯草芽孢杆菌 GY801 与不同复合肥养分共存时的菌量与留存率不同保存时间（月）NPK（12-12-12）NPK（15-15-15）NPK（18-18-18）NPK（12-12-12）NPK（15-15-15）NPK（18-18-18）菌量（108CFU/g）留存率（%）初始10.200.061a10.100.043a10.100.041a100.00.58a100.00.61a100.00.65a110.200.060a10.080.041a 8.950.031a100.00.63a 99.80.43a 88.60.31b310.180.055a10.050.039a 8.190.032b 99.80.54a 99.50.41a 81.10.28c610.160.040a10.010.042a 7.610.016c 99.60.43a 99.10.39a 75.30.16d910.010.035b 9.730.025b 7.080.022d 98.10.37b 96.30.26b 70.10.15e12 9.720.020c 9.410.015c 7.050.011d 95.30.21c 93.20.15c 69.80.13e注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）。下同。表 2枯草芽孢杆菌 GY801 在不同液体肥料环境中的菌量与留存率不同保存时间（月）腐殖酸大量元素型含氨基酸微量元素型中量元素型腐殖酸大量元素型含氨基酸微量元素型中量元素型菌量（108CFU/g）相比于初始的留存率（%）初始10.510.088a10.490.083A10.530.091a110.510.092a 8.820.061B10.490.075a100.00.85a84.10.56A99.60.73a310.480.081a 6.850.032C10.350.065a 99.70.78a65.30.24B98.30.61a610.440.073a 4.880.015D10.260.085a 99.30.67a46.50.13C97.40.82a注：大写字母不同表示差异极显著（P0.01）。下同。2.1.3不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 在液体菌剂中菌量稳定性的影响不同载体对液体菌剂中枯草芽孢杆菌 GY801稳定性的影响结果显示如表 3，结果显示，不加载体仅加 GY801 的对照组，1 个月留存率为 83.9%，除硫酸钾和硝酸铵钙外，其他载体均能显著增加该菌的 1 个月留存率。相比于其他载体，额外添加乳酸钠载体时，GY801 留存率为 98.5%，显著高于硫酸锰等各种促产孢载体（P0.05），高于苯甲酸钠、双乙酸钠等抑芽孢萌发载体（P0.05），显著高于所有高盐载体组（P0.05）。2.1.4两种载体在不同时间点对液体菌剂中枯草芽孢杆菌 GY801 菌量稳定性的影响由表 4 可知，两种载体在不同时间点下，显著提升了枯草芽孢杆 GY801 在 AA-TE 液体菌剂中的稳定性，与对照组相比，额外分别添加乳酸钠和硫酸锰载体的处理组 30保存 6 个月后，留存率分别为 87.07%和 84.51%，极显著高于对照组的 46.39%，相比于对照分别提升了 87.7 和 82.2%（P0.05）。结合芽孢率结果分析，在 6 个月内，对照组的芽孢率从 1 个月后的 74.07%持续下降至 6 个月的60.66%，说明残余的菌中，有 39.34%是萌发后不耐受 7520min 加热处理的营养体。而额外分别添加乳酸钠和硫酸锰载体的两个处理组，芽孢率从 1 个月后的 98.75%与 97.53%分别下降至 6 个月的 90.17%与 88.41%，芽孢率仍显著高于仅加GY801 的对照组，说明残余的菌中，营养体的比例 11.59%。pH 结果显示，6 个月存放过程中，pH均呈上升趋势，其中分别添加乳酸钠和硫酸锰载体的处理组组 pH 显著高于仅加菌对照组（P0.05）。这些数据也显示，芽孢占比、pH 变化与枯草芽孢杆菌 GY801 在液体菌剂中的留存率是存在较大关联的。间菌量留存率显著降低，达极显著差异（P0.01）。AA-TE 肥料环境下，枯草芽孢杆菌 GY801 液体菌剂 30存放 6 个月，菌量仅留存 46.5%。217中国土壤与肥料2023（7）表 3不同载体对液体菌剂中枯草芽孢杆菌 GY801 稳定性的影响处理组初始菌量（108CFU/g）30存放 1 个月后菌量（108CFU/g）1 个月留存率（%）对照-GY80110.528.830.26de83.92.47de对照+抑萌发载体乳酸钠10.5210.360.31a98.52.95a双乙酸钠10.529.430.28c89.62.66c苯甲酸钠10.529.650.29bc91.72.76bc对照+促产孢载体硫酸锰10.5210.110.31ab 96.12.95ab硫酸钙10.5210.090.30ab95.92.85ab碳酸钙10.529.510.29c90.42.76c对照+高盐载体硝酸钾10.529.530.28c90.62.66c硫酸钾10.528.620.26e81.92.47e硝酸铵钙10.529.170.23cd87.22.19cd表 4两种载体在不同时间点对液体菌剂中枯草芽孢杆菌 GY801 稳定性的影响处理组初始1 个月菌量（108CFU/g）pH菌量（108CFU/g）加热后菌量（108CFU/g）芽孢率（%）留存率（%）pH对照10.525.63 8.830.27b 6.540.19B74.072.22b83.942.52b5.800.23b对照+乳酸钠10.525.6310.360.32a10.230.29A98.752.69a98.482.54a6.810.26a对照+硫酸锰10.525.6310.110.31a 9.860.20A97.532.86a96.102.56a6.620.25a处理组3 个月6 个月菌量（108CFU/g）加热后菌量（108CFU/g）芽孢率（%）留存率（%）pH菌量（108CFU/g）加热后菌量（108CFU/g）芽孢率（%）留存率（%）pH对照6.850.21B4.720.14B68.912.07B 65.111.82B 5.850.23b4.880.15B2.960.09B60.661.72B 46.391.38B 5.910.24b对照+乳酸钠 9.690.29A9.110.27A94.012.46A 92.112.71A 6.950.27a9.160.27A8.260.23A 90.172.52A 87.072.57A 7.030.27a对照+硫酸锰 9.480.28A8.650.27A91.242.41A 90.112.65A 6.780.26a8.890.27A7.860.24A 88.412.51A 84.512.61A 6.870.26a2.2不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 土中增殖能力的影响2.2.1不同条件对枯草芽孢杆菌 GY801 土中增殖能力的影响表 5 表明，较低接种菌浓度，有利于枯草芽孢杆菌 GY801 在土壤中的增殖，在 5105CFU/g 土壤接种浓度下，GY801 在土壤中可增殖 61 倍，土中增殖倍数极显著高于其他接种浓度（P0.01）。表 6 表明，温度较低不利于枯草芽孢杆菌 GY801的增殖，随着温度升高，其在土中增殖倍数极显著提高（P0.01），确定 30是比较该菌的土壤中培养温度条件，该条件下枯草芽孢杆菌 GY801 能在土壤中增殖 110 倍。综合上述结果，后续试验中，将枯草芽孢杆菌 GY801 在土壤中的增殖试验的初始接种浓度确定为 5105CFU/g 土，将土壤增殖试验培养温度设定为 30。表 5初始接种菌浓度对枯草芽孢杆菌菌剂 GY801 在土壤中增殖倍数的影响初始接种菌浓度（108CFU/g）增殖后目标菌菌量（108CFU/g）枯草芽孢杆菌 GY801在土壤中的增殖倍数0.0050.310.012612.42A0.050.550.021110.39B0.51.500.042 30.11C 218中国土壤与肥料2023（7）表 6土壤培养温度对枯草芽孢杆菌菌剂 GY801 在土壤中增殖倍数的影响土壤培养温度（）初始接种菌浓度（105CFU/g）增殖后目标菌菌量（107CFU/g）枯草芽孢杆菌 GY801在土壤中的增殖倍数450.10.004d 20.08D1552.80.104c 562.13C2553.90.152b 782.73B3055.50.226a1104.36A2.2.2不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 土中增殖能力的影响不同载体的对比结果显示如表 7，大部分载体可显著促进枯草芽孢杆菌 GY801 在土壤中的增殖，与不加载体相比，促进增殖的效果是显著的（P0.05）。在高档载体海藻精存在时，GY801 在土壤中的增殖倍数达 154 倍，与不加载体的对照相比，土中增殖倍数提升了 40%，达显著差异（P0.05）；高档载体如豆粕粉载体可使 GY801 在土壤中的增殖倍数达 132 倍，与不加载体的对照相比，土中增殖倍数提升了 20%，也达显著差异（P0.05）。低档载体如发酵鸡粪、中档载体如糖渣，也能促进枯草芽孢杆菌 GY801 在土中的增殖，但这些载体对产品品质、粘性等有所影响，所以被排除了。表 7不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 土中 增殖能力的影响不同载体初始接种菌浓度（105CFU/g）增殖后目标菌菌量（107CFU/g）枯草芽孢杆菌 GY801在土壤中的增殖倍数对照55.500.19e1103.85e对照+低档发酵鸡粪56.200.12c1243.72c浮石粉55.900.21cd1184.13cd对照+中档木薯渣55.500.19e1103.85e糖渣56.100.12c1222.44c糠醛渣55.450.19e1093.82e红薯渣55.350.19e1073.75e蘑菇渣55.700.20de1143.99de对照+高档豆粕粉56.600.23b1324.62b海藻精57.700.27a1545.39a2.2.3两种载体在不同时间点对枯草芽孢杆菌GY801 土中增殖能力的影响笔者跟测了枯草芽孢杆菌 GY801 在不同时间点的增殖菌量、增殖倍数、75条件下 20min 加热后菌量和芽孢率，结果如表 8，对照组、海藻精组和豆粕粉组在 7d 时的增殖菌量、增殖倍数较高，但芽孢率均最低，分别为 49.45%、55.97%和 50.52%，其中海藻精组的芽孢率显著高于其他两组（P0.05），相比于对照组升幅达 13.2%（P0.05）。该结果还显示，海藻精载体可显著提高枯草芽孢杆菌 GY801 在土中的增殖能力，对照组 7、15 和 30d 的土壤增殖倍数分别为 110、57 和 51 倍，海藻精组可提升该指标分别至 154、94 和 79 倍，升幅分别为 40.0%、64.9%和 54.9%（P0.05），豆粕粉组仅可显著提升 7d 时的增殖倍数（P0.05）。2.3不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 促生能力的影响由表 9 的各项生长指标发现，枯草芽孢杆菌GY801 可促进尖椒苗的生长，与对照组相比，显著增加了壮苗指数、根冠比、全株干重、根干重等指标，增幅分别为 12.3%、12.5%、12.0%、23.5%（P0.05）。载体的加入促进了枯草芽孢杆菌 GY801 促生作用的发挥，不同载体的促生效果略有差异。与豆粕粉相比，海藻精是更为合适的促生载体，显著增强了枯草芽孢杆菌 GY801 针对尖椒苗促生作用的发挥。与只用菌相比，额外添加海藻精载体组显著增加了壮苗指数、根冠比、全株干重、根干重等指标，增幅分别为7.7%、8.3%、10.1%、16.7%（P0.05）。219中国土壤与肥料2023（7）表 8两种载体在不同时间点对枯草芽孢杆菌 GY801 土中增殖能力的影响处理组初始接种菌浓度（108CFU/g）7d增殖后菌量（108CFU/g）增殖倍数加热后菌量（108CFU/g）芽孢率（%）对照0.0050.5500.019c1103.84c0.2720.008c49.451.46b对照+海藻精0.0050.7700.027a1545.41a0.4310.013a55.971.69a对照+豆粕粉0.0050.6600.023b1324.61b0.3330.009b50.521.36b处理组15d30d增殖后菌量（108CFU/g）增殖倍数加热后菌量（108CFU/g）芽孢率（%）增殖后菌量（108CFU/g）增殖倍数加热后菌量（108CFU/g）芽孢率（%）对照0.2850.009b571.80b0.2610.008b91.582.28a0.2530.007b511.40b0.2240.006b 88.542.48a对照+海藻精0.4690.014a942.80a0.4380.013a93.392.17a0.3940.012a792.40a0.3530.011a89.592.69a对照+豆粕粉0.2890.009b581.80b0.2640.007b91.352.23a0.2630.005b531.00b0.2350.004b 89.352.43a表 9不同载体添加时枯草芽孢杆菌 GY801 对尖椒苗生长指标的影响处理组茎粗（mm）株高（cm）全株干重（g）地上干重（g）根干重（g）根冠比壮苗指数CK对照组3.810.03d17.870.02c1.420.02d1.080.02c0.340.01d0.320.009c0.03020.0006dT1枯草 GY8014.020.01c18.810.06b1.590.01c1.170.02b0.420.01c0.360.013b0.03390.0002cT2枯草 GY801+海藻精4.260.02a20.460.11a1.750.01a1.260.02a0.490.01b0.390.008a0.03650.0004aT3枯草 GY801+豆粕粉4.140.02b20.500.11a1.720.01b1.260.03a0.460.01a0.370.010b0.03470.0003b表 10不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 针对尖 孢镰刀菌抑制率的影响处理组靶标菌直径（mm）抑制率（%）不加菌对照88.21.75aGY80170.31.41b22.31.8dGY801+海藻精29.90.62d72.70.8bGY801+豆粕粉18.20.36e87.30.4aGY801+发酵鸡粪38.20.67c62.30.8cGY801+糖渣69.51.39b23.31.7d2.4.2两种载体在不同时间点对枯草芽孢杆菌GY801 抑菌防病能力的影响表 11 显示了两种载体在不同时间点对枯草芽孢杆菌 GY801 抑菌防病能力的影响。结果显示，在 10d 时，仅接种枯草芽孢杆菌 GY801 的处理组针对根腐病的防治效果较弱，为 24.6%，而在接种枯草芽孢杆菌 GY801 之外额外分别添加海藻精和豆粕粉的处理组，针对根腐病的防治效果较强，分别为 74.9%和 79.3%，极显著强于仅接菌对照组（P0.05）。在 30d 时，各组针对根腐病的防治效果均略有衰减，但相比于仅接种 GY801 组的 13.2%，额外分别添加海藻精和豆粕粉的处理组仍有较强的根腐病防治效果，分别为 65.0%和 66.8%，极显著强于仅接菌对照组（P0.05）。该试验结果表明，即使已经施用 30d，额外添加豆粕粉或海藻精载体的处理组，仍能 65%以上防治串珠镰刀菌引起的根腐病害，载体的添加显著增强了枯草芽孢杆菌 GY801 针对根腐病的防治效果，延长了对作物的保护期。220中国土壤与肥料2023（7）图 1不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801 针对尖孢镰刀菌抑制率的影响 表 11两种载体在不同时间点对枯草芽孢杆菌 GY801 抑菌防病能力的影响（%）处理组10d20d30d病情指数防治效果病情指数防治效果病情指数防治效果CK仅接病原菌对照20.30.51a42.11.06a64.21.86aT1病原菌+GY80115.10.38b24.60.62B33.50.72b20.40.72B55.70.95b13.20.39BT2病原菌+GY801+海藻精 5.10.15c74.92.28A12.50.41c70.31.63A22.50.73c65.01.82AT3病原菌+GY801+豆粕粉 4.20.13d79.32.51A11.30.28d73.21.81A21.30.66c66.82.03A3讨论生物复合肥料多由活性菌与复配载体组成，载体的存在，对复合产品的菌量稳定性、土中增殖能力、对植物的促生作用和对病原真菌的抑制作用是否有影响，是非常值得关注的问题。3.1不同载体对枯草芽孢杆菌稳定性的影响本文探讨了载体对菌量稳定性的影响。前期大量研究表明，芽孢杆菌处于芽孢状态，是其发挥耐热、耐酸、耐胆盐并能长期保存的前提，一旦其芽孢被破坏，营养体状态的菌非常脆弱，其菌量稳定性则会受到较大影响27。本研究考察了枯草芽孢杆菌 GY801 在固体和液体两种剂型下的稳定性，发现其在 AA-TE 液体肥料环境时，稳定性较差，6个月后菌量留存率仅 46.5%。李素等28研究发现，乳酸钠等可以抑制芽孢萌发，抑制率 90%以上。本研究发现，额外添加乳酸钠载体，极显著提升了GY801 在 AA-TE 液体菌剂中的稳定性，与对照相比，可提升 6 个月留存率至 87.07%，提升幅度达87.7%，其芽孢率为 90.17%，极显著高于对照组的60.66%（P0.01）。本研究与李素等28的研究基本一致，也再次验证了芽孢的稳定对于菌量稳定的重要作用。在存放过程中，仅加菌的对照组，pH 由5.63，在 1、3 和 6 个月后分别提升至 5.80、5.85 和5.90，而添加乳酸钠的试验组，pH 在 1、3 和 6 个月后分别达 6.81、6.95、7.03，而郭夏丽等29、李忠等30研究发现，pH7 7.5 是较为合适的枯草芽孢杆菌产孢条件。综合文献研究与本试验结果均能证明，pH 影响了孢子的形成，继而影响了枯草芽孢杆菌菌剂的稳定性。3.2不同载体对枯草芽孢杆菌在土中增殖与促生能力的影响本文探讨了载体对目标菌的土中增殖与促生能力的影响。近年来，功能菌剂菌株在土壤的定殖已是国内外研究的热点31。将功能微生物菌剂菌株引入新的生态系统之后，其能否适应周围环境、存活并成功萌发和定殖，并对植物产生促生长、抗病害等作用，都是亟待研究的课题32。海藻精可为农作物提供各种营养元素与生长因子，其复配微生物形成的菌剂、菌肥等，对土壤的改良以及农 221中国土壤与肥料2023（7）作物的生长也有着良好的效果。陈保宇33的研究表明，海藻精微生物菌剂拌肥施用具有较高的肥效，易于水稻的吸收，使得茎蘖数得以增长，提高了水稻的分蘖能力、促进了干物质累积等，使得水稻增产，增幅可达 10%。本研究筛选了能促进GY801 土中增殖的两种载体海藻精与豆粕粉，并详细考察了加与不加这两种载体对菌在土壤增殖的影响。结果显示，海藻精可显著促进其在土壤中的增殖，增幅达 40%，还可显著促进尖椒苗的生长，与只用菌相比，额外添加海藻精载体组显著增加了壮苗指数、根冠比、全株干重、根干重等指标，增幅分别为 7.7%、8.3%、10.1%、16.7%（P0.05）。本试验研究结果证明，海藻精可促进枯草芽孢杆菌在土壤中的增殖，并能促进其针对植物的促生作用的发挥。3.3不同载体对枯草芽孢杆菌抑菌防病能力的影响本文探讨了载体对目标菌抑菌防病能力的影响。李欣34研究表明，豆粕酶解物可提升目标菌菌量、产酶并促进抑菌物质产生。陈洁梅等35研究证明解淀粉芽孢杆菌 KN-BL-1 的发酵豆粕浸提液对多种革兰氏阳性菌均有明显的抑菌效果，主要成分为多肽类物质。张灿辉36的研究表明，解淀粉芽孢杆菌的液态和固态豆粕发酵浸提液均对多种革兰氏阳性菌有明显的抑菌效果。本研究发现，相比于仅接种枯草芽孢杆菌 GY801 组 13.2%的防治效果，额外添加豆粕粉载体的处理组，30d 后针对根腐病防治效果为 66.8%，相比于对照组提升了4.06 倍。4结论载体的选择对保障微生物菌剂功能和效果至关重要。枯草芽孢杆菌菌剂是目前主流的 PGPR 菌剂，本研究考察了不同载体对枯草芽孢杆菌 GY801的稳定性、土壤增殖能力、植物促生能力和抑菌抗病能力的影响，结果表明，乳酸钠是比较合适的液体菌剂稳定性载体，海藻精是比较合适的土壤增殖和促生载体，而豆粕粉是相对比较合适的抑菌防病载体。参考文献：1 李元芳微生物肥料及其在蔬菜上的应用J 中国蔬菜，2001（5）：1-32 葛诚我国微生物肥料的发展现状和正确使用J 中国农业信息，2005（3）：6-73 郑茗月，李海梅，赵金山，等微生物肥料的研究现状及发展趋势J 江西农业学报，2018，30（11）：52-564 靳亚忠，何淑平，廉华，等微生物肥料及有机肥对菜心可食部分产量及品质的影响J 北方园艺，2011（1）：46-485 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subtilisLIHui-fen1，FANGAn-ran2，FENGHai-xia1，ZHAOMing-zhu3，ZHOUBo3*（1QingdaoShangdeBiotechnologyCo.，Ltd.，QingdaoShandong266111；2QingdaoRedCherryBiotechnologyCo.，Ltd.，QingdaoShandong266111；3CollegeofLifeSciences，ShandongAgriculturalUniversity，TaianShandong271018）Abstract：TheeffectsofdifferentcarriersonthestabilityofBacillus subtilisGY801，theabilityofsoilmultiplication，theabilityofplantgrowthpromotion，theabilityofbacteriostasisanddiseaseresistancewereinvestigated.Theresultsshowedthattheadditionofsodiumlactatetotheaminoacidtraceelements（AA-TE）liquidfertilizersignificantlyincreasedthe6-monthretentionrateofbacillussubtilisGY801to87.07%.TheadditionofsodiumlactatetotheAA-TEliquidfertilizersignificantlyincreasedtheretentionrateofbacillussubtilisGY801to87.07%，comparedwith46.39%ofthecontrolgroup，theretentionrateofthebacteriaincreasedby87.7%（P0.01），andtheeffectsofdifferentcarriersonthemultiplicationabilityofthebacteriawerecomparedunderthesuitableconditionsofsoilmultiplication，theresultsshowedthatthemultiplicationofGY801insoilcouldbesignificantlyincreasedbyaddingseaweedconcentrate.ThemultiplicationofGY801insoilwas110，57and51timesinthecontrolgroupat7，15and30days，respectively，andincreasedto154，94and79timeswiththeadditionofseaweedconcentrate，respectively.Thegrowth-promotingeffectofGY801wassignificantlyenhancedbyseaweedcarriercomparedwiththecontrolgroupwithoutcarrier，andthegrowth-promotingeffectofGY801wasincreasedby40.0%，64.9%and54.9%，respectively.Theindexesofhealthyseedlingindex，root-shootratio，dryweightofwholeplantanddryweightofrootwereincreasedby7.7%，8.3%，10.1%and16.7%，respectively（P0.05）.Comparedwiththecontrolgroup，thecontroleffectofsoybeanmealonrootrotwas66.8%after30days，whichwas4.06timeshigherthanthatofthecontrolgroup.Theresultsshowedthatsodiumlactatewasthemostsuitablecarrierforliquidbacterialagent，seaweedextractwasthemostsuitablecarrierforsoilproliferationandgrowthpromotion，andsoybeanmealwasarelativelysuitablecarrierforbacteriostasisanddiseaseprevention.Key words：stability；soilproliferation；growthpromotion；bacteriostasisanddiseaseprevention