布鲁氏菌抗体镧系高敏荧光快速检测试剂盒的研制.pdf

202308期 总第401期试验研究布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏杆菌引起的以生殖器官和黏膜发炎，流产、不育和多种组织局部病灶为特征的人畜共患慢性接触性传染病。在家畜中牛羊最常发生，猪次之，而且可传染其他家畜和人，严重危害人类健康，同时给养殖业造成巨大的经济损失1-2。疫苗免疫是控制动物布病的有效方法，目前常用的疫苗有猪型2号苗，羊型5号苗、A19号苗。疫苗免疫后的抗体监测，是控制和净化布病的主要措施之一。目前国内主要采用虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、ELISA、胶体金技术等检测布病，这些方法各有优缺点，普遍适用于实验室检测。为了实现在基层和养殖场的快速即时检测，本试验应用镧系元素作荧光标记物研制了一种布鲁氏菌抗体高敏荧光免疫层析快速检测试剂盒（Bru-LFICA）。1材料与方法1.1材料布鲁氏菌脂多糖抗原（LPS）、布鲁氏菌脂多糖抗原（LPS）单克隆抗体，镧系荧光纳米微球和WellrayWR-1608高敏荧光分析仪；兔抗鸡IgY抗体、鸡IgY抗体；吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀亚胺，切条机和点膜喷金膜机，其他试剂均为国产分析纯。牛、羊O型、A型口蹄疫阳性血清，布鲁氏杆菌阳性血清及阴性血清均购自青岛立见诊断发展中心，临床血清样品由笔者单位收集保存。制备包被膜、脂多糖LPS抗原标记微球、免疫竞争法建立等均参照说明书或按照相关要求操作3-4。布鲁氏菌抗体镧系高敏荧光布鲁氏菌抗体镧系高敏荧光快速检测试剂盒的研制快速检测试剂盒的研制章健1，侯巍2，张朝辉3，曲伍4，李劲3，尹杰1，郇敏5，王泽洲1，2*（1.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731；2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；3.四川省甘孜州动物疫病预防控制中心，四川 康定 626000；4.四川省凉山州动物疫病预防控制中心，四川 西昌 615000；5.浙江省桐庐县农业农村局，浙江 桐庐 311500）中图分类号：S854.43文献标识码：B文章编号：1001-8964（2023）08-0022-04收稿日期：2022-12-16作者简介：章健（1968-），男，安徽人，工学博士，研究员，从事动物疫病快速诊断检测方法和设备的研究及推广。*通信作者：王泽洲（1961-），男，四川仁寿县人，理学博士，研究员，从事动物疫病防控技术研究和推广工作。摘要：本试验选用镧系元素铕（Eu）为荧光物质标记布鲁氏菌脂多糖抗原（LPS），建立了布鲁氏菌抗体高敏荧光免疫层析快速检测试剂盒（Bru-LFICA）。经相关试验验证，得出该试剂盒特异性强，敏感性高，重复性好，符合率高，且兼具操作方便，检测快速（15min），价廉，不需特殊设备和专业技术人员等优点，特别适合于基层兽医站、养殖场的即时快速检测。关键词：布鲁氏菌；镧系荧光免疫层析检测法；抗体；试剂盒22202308期 总第401期试验研究1.2荧光免疫层析试纸条的组装在湿度小于30%，温度2025的环境下，把吸水纸、标记物垫和样品垫按顺序粘贴在聚氯乙烯底板上形成微反应体系，然后将其切割成0.5cm宽，即成试纸条（图1），将试纸条装入卡壳中制成检测卡，装入铝箔袋封存备用。PVC底板样品垫标记物垫膜检测线质控线吸水垫丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁丁图1镧系荧光免疫层析法结构示意图1.3特异性试验试验选用牛、羊O型、A型口蹄疫阳性血清进行布病抗体高敏荧光免疫层析检测，同时设牛、羊布病阳性、阴性对照，以确定该试验方法是否发生交叉反应。1.4敏感性试验将布病强阳性血清按1 10、1 20、1 40、1 80、1 160、1 320、1 640、1 1 280、1 2 560倍比稀释，每个稀释度平行做4个重复，用建立的Bru-LFICA检测，同时进行虎红平板凝集试验，判断其抗体效价。1.5重复性试验1.5.1批内重复性试验在相同条件下选取12份布病抗体水平不同的血清，每份血清样本平行做8个重复，用组装的Bru-LFICA试剂盒检测（批号为20170912），然后对检测结果进行统计学分析。1.5.2批间重复性试验在相同条件下选取12份布病抗体水平不同的血清，分别用 4 批 Bru-LFICA 试 剂 盒 检 测（批 号 分 别 为 20170426、20170616、20171123、201780119），然后对检测结果进行统计学分析。1.6试剂盒的组装及稳定性试验Bru-LFICA试剂盒由荧光检测仪、检测卡、连接线组成。试剂盒置4保存，分别于保存后60、120、180、240、300、360、420、480、540 d对布病阳性和阴性参考血清进行检测，并对结果进行统计学分析。1.7比对试验选用221份牛血清样本进行试管凝集试验，选用203份牛血清样本进行虎红平板凝集试验，选用31份阴、阳性牛血清和31份阴、阳性羊血清样本进行布病间接ELISA试验，选用100份阴、阳性牛血清样本进行美国ELISA检测，同时用Bru-LFICA试剂盒检测，比较其敏感性、特异性和符合率。1.8应用试验用本次研制的Bru-LFICA试剂盒检测各地市送检的布病样本1 736份，了解布病血清抗体阳性率。2结果2.1测定条件的选择按照镧系荧光免疫层析法的操作步骤，选择标记比例为1 25的免疫微球；选择样本稀释倍数为10倍的加样量；选择检测时间为加样后15min。2.2检测结果的判读加样后，由于层析作用液体向前移动，先后与包被在T线和C线上的抗体形成复合物，这时试纸条经荧光检测设备扫描显示出2条荧光带（图2）。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中抗体浓度的增加而降低。相应的检测结果以浓度为横坐标，阻断率（1T/T0）为纵坐标，经数据线性回归处理后，拟合得出标准曲线（图3）。当样本为阴性时，布鲁氏菌抗体浓度很低，T线荧光值很高；当样本为阳性时，布鲁氏菌抗体浓度越高，T线荧光值越低，甚至检测不出信号。无论是阳性还是阴性结果，C线总能显示荧光，如果C线没有荧光显现，无论T线有无，结果均判为无效。020406080100120140160180051010-61520图2荧光微球免疫层析技术检测布鲁氏菌抗体的扫描图谱2.3特异性试验本试验用牛、羊O型、A型口蹄疫阳性血清，经Bru-LFICA检测，结果得出阻断率（1T/T0）值均低于10%（表1），呈阴性反应；对牛、羊布鲁氏菌阳性血清都呈阳性反应；对牛、羊布鲁氏菌阴性血清都呈阴性反应。表明该方法与牛、羊O型、A型口蹄疫阳性血清不发生交叉反应，显示出很好的特异性。23202308期 总第401期试验研究2.4敏感性试验当布病强阳性血清稀释至1 640时，高敏荧光检测仍为阳性，而虎红平板凝集试验只能检测到1 80倍稀释（表2）。证明该方法敏感性很好。强阳血清稀释比例1 101 201 401 801 1601 3201 6401 12801 2560高敏荧光（Bru-LFICA）T/C0.09010.14370.23690.31740.45410.62640.85931.00141.273判定结果-虎红平板-表2敏感性试验结果2.5重复性试验批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%。表明该方法具有良好的重复性。2.6试剂盒稳定性试验如表 3 所示，Bru-LFICA试剂盒保存540d后用于检测阳性血清、阴性血清，其变异系数均小于10%，说明该诊断试剂盒保存18个月仍然稳定有效，进一步的稳定性试验还在进行中。2.7比对试验2.7.1高敏荧光与虎红平板、试管凝集试验的比较选用203份牛血清同时进行高敏荧光和虎红平板凝集试验，结果表明其敏感性为100.00%，特异性为80.80%，符合率为88.18%。且高敏荧光方法的敏感性更高，能够检出虎红平板漏检的阳性样本。选用221份牛血清同时进行高敏荧光和试管凝集试验，结果表明其敏感性为100.00%，特异性为88.97%，符合率为93.21%。且高敏荧光方法能检出试管凝集试验漏检的阳性样本。2.7.2高敏荧光与中监所ELISA方法的比较选用31份牛血清同时用中监所牛布病间接ELISA与高敏荧光法检测，结果表明其敏感性为100.00%，特异性为 93.75%，符合率为 96.77%。选用 31 份羊血清同时用中监所羊布病间接ELISA与高敏荧光法检测，结果表明其敏感性、特异性和符合率均为100.00%。2.7.3高敏荧光与美国ELISA方法的比较试验选用100份牛血清，同时用美国产ELISA与高敏荧光法进行检测，结果表明其敏感性为79.59%，特异性为94.12%，符合率为87.00%。2.8应用试验2.8.1采集同一养羊场的血清，同时进行虎红平板试验、试管凝集试验和高敏荧光法检测，结果得出：虎红平板试验的阳性检出率为53.72%，试管凝集试验的阳性检出率达到77.98%，高敏荧光法的阳性检出率达到92.44%（表4）。2.8.2应用本次研制的Bru-LFICA试剂盒检测图3荧光微球免疫层析技术检测布鲁氏菌抗体的标准曲线0020406080100120100200300400500浓度阻断率（1T/T0）项目D阻断率/%牛-O8.17.0羊-O7.17.4牛-A6.15.5羊-A6.47.3牛10099.9羊9089.3牛-7.26.9羊-5.26.1表1特异性试验结果检测方法共计样本检出阳性检出阴性阳性检出率高敏荧光（Bru-LFICA）119110992.44%试管凝集（SAT）109852477.98%虎红平板（RBPT）121655653.72%三种方法检测布鲁氏菌阳性血清的检出率比较表4项目阴性阳性保存期（d）609.865.61209.665.31809.559.62409.458.53009.158.23609.056.8表3稳定性试验结果项目阴性阳性保存期（d）4208.556.34808.356.55408.254.4平均值（X）9.159.0标准差（S）0.5823.941变异系数（CV）6.43%6.68%24202308期 总第401期试验研究各地市送检的1 736份样本，检出血清抗体阳性134份，阳性率为7.72%。3讨论3.1试管凝集试验是我国法定的布病检测方法，但操作繁琐、费时、不适于大批量抗体检测，也受人为主观因素的影响5。ELISA是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，具有敏感性高、特异性强、人为因素影响相对较小，检查微量、无辐射、高通量等优点，但需要比较完备的实验设备，操作人员得具有一定的专业技术水平和经验，检测一批样品的流程至少需要24h，在基层兽医站和养殖场的推广应用受到了一定的限制6。PCR 方法通常用作抗原检测，需要专门的实验室、仪器设备和专业技术人员，且成本较高。3.2镧系高敏荧光免疫层析方法（LFICA）是结合了时间分辨荧光免疫分析法和层析技术而建立起来的一种超微量快速免疫检测技术，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、无污染，且测定范围宽，试剂盒寿命长，操作简单和无放射性等优点。本研究建立的Bru-LFICA，既具有胶体金免疫层析法（GICA）简单、方便、快捷、适于基层等优点，又具有ELISA敏感、特异、微量等优点，通过专用设备检查克服主观臆断，采用镧系元素作荧光标记克服了产品质量不稳定的缺陷，检测时间从24h缩短到1520min，检测不需要专业技术人员，检测设备小巧便于携带，尤其适用于基层兽医部门、养殖场和技术服务人员。参考文献：1 王泽洲，余勇.最新猪繁殖障碍性疾病与防治M.成都：四川科学技术出版社，2007.2 杜红霞，家畜布鲁氏杆菌病的危害及防治 J.当代畜禽养殖业，2013，9：243 王泽洲，王琴，赵启祖，等.猪瘟抗体镧系荧光免疫层析法的建立 J.四川畜牧兽医，2018，45（6）：26-32.4 王泽洲，吴俊清，章健，等.禽流感高敏荧光免疫分析快检试剂盒的研制与应用 J.四川畜牧兽医，2019，46（8）：25-28.5 张佳，杨坚，李正浦，等.免疫金标试纸检测与PCR试验对昆明地区猫布鲁氏杆菌病感染状况调查的对比 J.上海畜牧兽医通讯，2013（5）：22-23.6 龚德林，欧海敏，曾衍虎，等.奶牛布病流行病学调查与防控建议 J.畜禽业，2012（8）：66-67.境、饲养管理等因素均可影响不同年龄段羊肠道寄生虫病的感染率。高嘉淇等8报道陕西奶山羊以35月龄羔羊的球虫平均感染强度最高，OPG值为2442；陶立等9报道广西圈养山羊以6月龄羊的球虫卵囊感染强度最大，OPG值范围在7001 000。本次调查发现球虫卵囊感染强度与羊的年龄相关，以36月龄大耳羊的平均OPG值最高（1227.94），与上述调查结果相符，提示应加强对幼龄羊球虫的监测和驱虫工作。参考文献：1 汪明.兽医寄生虫学 M.3版.北京：中国农业出版社，2003.2 黄涛.紫云县山羊肠道寄生虫感染状况初探 D.贵阳：贵州大学，2020.3 唐莉，符布银，汪凯，等.安徽及周边地区羊肠道寄生虫感染情况调查 J.安徽农业大学学报，2018，45（6）：1021-1027.4 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