超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牙膏中三七皂苷和人参皂苷.pdf

第三十三卷第五册 年 月口 腔 护 理 用 品 工 业 超高效液相色谱 串联质谱法同时测定牙膏中三七皂苷和人参皂苷税钿夏泽敏聂明霞廖娜陈彦君梁文耀李鑫宇谭建华席绍峰（广州质量监督检测研究院，国家化妆品质量监督检验中心（广州），广州 ）摘要：采用超高效液相色谱 串联质谱（）技术，建立了同时测定牙膏中三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 及人参皂苷 的分析方法。样品经 甲醇水溶液超声提取，经 （，）色谱柱分离，进行 分析，外标法定量。结果表明，人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 和三七皂苷 在各自范围内呈良好的线性关系，相关系数（）均大于 ，方法检出限为 ，方法定量限为 。平均加标回收率为 ，相对标准偏差（，）为 ，该方法精密度好，准确度高，可满足相关检测需求。关键词：牙膏；三七皂苷；人参皂苷；高效液相色谱 串联质谱法中图分类号：文献标识码：文章编号：（）三七为五加科多年生草本植物，是我国传统名贵中药材，具有活血化瘀，消肿止痛等功效。三七提取物作为中国特色植物原料，被广泛用于功效型牙膏，对口腔溃疡、牙菌斑、牙龈炎和牙龈出血等有显著的疗效 ，。但部分产品虚假宣称，实则不含所标示的三七提取物，也达不到所宣称的功效，甚至一些不法厂家通过添加违禁药物来达到所宣称的消肿、抗炎等功效。这些情况不仅影响行业秩序，更严重损害消费者的权益和健康。三七的有效成分为三七总皂苷，其中三七皂苷 是三七总皂苷的特征化合物，人参皂苷 和人参皂苷 是总皂苷中含量最多的两种成分 。通过检测三七皂苷几种特产品的牙膏配方、产品执行标准、质量检验报告、功效验证报告等备案资料进行整理；准备好相关牙膏产品的包装升级改版；做好本企业的已使用牙膏原料目录，梳理好相关的质量安全信息资料。建立产品备案工作机制建立完整的企业产品备案工作组织系统，从管理层到相关部门、相关人员，使各项工作得到具体落实，并定期检查执行情况。扎实开展关于新法规的宣讲和学习对 牙膏监督管理办法、化妆品监督管理条例 及二级法规的进行理论性学习培训，对化妆品备案、化妆品原料注册备案、牙膏安全性评价、牙膏功效检测等相关知识进行操作性学习培训。专项工作 对所有牙膏名称进行梳理针对本企业牙膏产品商标和通用名可能存在的问题，特别是涉及医疗用语和绝对化词语等，及时做出调整。对所有牙膏功效重新进行规划按照新法规相关二级文件的要求，重新整理本企业的牙膏功效，再对照检查相关的功效验证报告和产品配方，作为下一步修改包装设计图稿的依据。对儿童牙膏包装设计进行升级按照新法规相关二级文件的要求，对本企业的儿童牙膏，从原料使用、功效宣称、安全性评价等方面重新审查，及时整改所发现的问题，并进行相应的包装设计升级。参考文献（略）（收稿日期：年 月 日）税钿，等：超高效液相色谱 串联质谱法同时测定牙膏中三七皂苷和人参皂苷 年第 期征物质的含量可表征是否含有三七提取物，为牙膏功效宣称提供技术支撑。另外考虑到人参提取物液被应用在功效型牙膏中，其特征组分与三七较为相似，主要为人参皂苷 、人参皂苷 和人参皂苷 。为提高方法的适用范围，本方法拟建立三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 及人参皂苷 等四种组分的分析方法。通过国内外相关标准和文献资料检索，近年来在三七和人参提取物有效成分的检测方面，检测方法主要有薄层扫描法 ，、高效液相色谱法 、液相色谱 串联质谱法 等。而针对牙膏产品，主要有薄层色谱法 和高效液相色谱法 。现有标准中，功效型牙膏（）附录中规定了液相色谱紫外检测法测定牙膏中人参皂苷 、人参皂苷 及三七皂苷 三种组分的检测方法，但该方法前处理较复杂，耗费时间长；由于几种皂苷均为四环三萜类结构，结构相似，方法的色谱分离时间长，严重影响检测效率；人参皂苷类化合物在紫外区的吸收较弱，容易受到样品基质的干扰。此外，当采用液相色谱法对牙膏中四种皂苷类物质进行测定时，三七皂苷 、人参皂苷 在色谱柱上分离度差，目前有文献报道使用二维柱切换高效液相色谱法 来对四种皂苷进行分析，但三七皂苷 、人参皂苷 的分离度仍不理想。而且，牙膏中提取物添加量一般比较低，液相色谱法难以满足检测要求。鉴于液相色谱 质谱联用法具有很好的分辨率和灵敏度，本方法拟采用高效液相色谱 串联质谱法测定牙膏中三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 及人参皂苷 ，为广大日化行业的检测机构和企业用户提供一种快捷简便、准确高效的测定方法。实验部分 仪器与试剂岛津超高效液相色谱仪 三重四极杆质谱仪（美国赛默飞公司）；超纯水器（美国 公司）；涡旋振荡器（德国 公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；电子天平（德国赛多利斯公司）。三七皂苷 （号 ）、人参皂苷 （号 ）、人参皂苷 （号 ）及人参皂苷 （号 ），纯度均大于 ，美国 公司；甲醇，色谱纯，德国 公司；乙腈，色谱纯，德国 公司；甲酸，分析纯，上海安谱科学仪器有限公司；醋酸铵，分析纯，广州化学试剂厂；石英砂，分析纯，广州化学试剂厂，超纯水，电阻率为 。甲醇水溶液（，体积分数）：准确移取 甲醇置于适量水中，再加水稀释至 ，混匀。醋酸铵水溶液（，含 甲酸）：准确称取 醋酸铵，于烧杯中用 纯水溶解，准确量取 甲酸至烧杯中，混匀。标准溶液的配制分别准确称取三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 及人参皂苷 的标准品 （精确至 ）于 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度约为 的标准储备液。使用时，稀释至所需要的质量浓度的标准工作溶液。样品处理将牙膏试样挤出约 后，准确称取试样 （精确到 ）于 具塞比色管中，加入约 石英砂，混匀，再准确加入 甲醇水 ，涡旋混匀后超声提取 ，放置冷却后经 滤膜过滤后待测。仪器条件色谱条件：色谱柱：（，）；流动相：醋酸铵水溶液（含 甲酸），：乙腈；梯度洗脱程序（，；，；，；，；，；，）；流速：；柱温：；进样体积：。质谱条件：离子源为电喷雾离子源，负离子模式；喷雾电压：；干燥气压力：；气帘气压力：；碰撞气压力：；离子源温度：；扫描模式：多反应监测（）模式（）。四种皂苷的母离子、子离子、碰撞能量见表 。年第 期税钿，等：超高效液相色谱 串联质谱法同时测定牙膏中三七皂苷和人参皂苷表 四种皂苷的质谱参数序号化合物名称 母离子（）子离子（）碰撞电压（）去簇电压（）三七皂苷 人参皂苷 人参皂苷 人参皂苷 结果与讨论 提取方式及溶解的选择根据三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 的结构以及理化性质，对提取溶剂和提取方法进行考察，筛选合理的提取方法。通过查询资料可知，三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 的 值在 之间，具有一定的脂溶性，在有机溶剂中溶解性较好。同时，考虑到牙膏产品在水中分散效果较好，本方法采用有机溶剂 水体系作为提取溶剂。考察了不同比例的甲醇水溶液（，）对牙膏样品中三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 的提取效果。随着有机相比例增加，样液变澄清，样液变得容易经滤膜过滤，当有机相比例超过 ，样品容易成团，不易分散。对实际样品添加浓度 的人参皂苷 、三七皂苷 和浓度为 的人参皂苷 、人参皂苷 ，并对样液进行测定。结果显示，在甲醇水溶剂体系中，不同比例有机溶剂对人参皂苷 、三七皂苷 和人参皂苷 的提取率相似，但人参皂苷 的提取率随甲醇比例增加而有所提高。因此选择 甲醇水作为三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 的提取溶剂。另外，为了提高牙膏在提取溶剂中的分散效果，本方法选择加入适量石英砂对牙膏试样进行辅助分散。色谱柱的选择考察 了 （，）、（，）、（，）、（，）等不同品牌的 色谱柱对三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 等四种组分和样品基质的分离效果。结果显示，在优化的流动相条件下，各 色谱柱上四种组分的峰型都尖锐对称，虽然四种组分保留时间比较接近，但不影响质谱分析结果，且 色谱柱通用性好。综合考虑，本方法采用 色谱柱作为分离色谱柱。流动相的选择比较了甲醇 甲酸水、乙腈 甲酸水、乙腈 甲酸水和乙腈 醋酸铵水溶液（甲酸）几种流动相体系对目标物保留时间和峰型的影响。结果表明当乙腈作为有机相时，化合物峰型更对称，且随着甲酸浓度增加，化合物响应有所增强，在乙腈 醋酸铵水溶液（甲酸）作为流动相时，醋酸铵大大提高了化合物离子化效率，四种皂苷的响应最高。比较 、的添加 甲酸的醋酸铵溶液作为水相的分析结果发现，随着醋酸铵浓度的增加，四种化合物的响应都增加，增加到 后，信号增加不明显，且盐浓度过高可能会析出后磨损液相柱塞杆或在质谱离子源口结晶。因此，选用乙腈 醋酸铵水溶液（甲酸）作为流动相。图 四种皂苷混合标准溶液的总离子色谱图（）图 阳性样品总离子色谱图 税钿，等：超高效液相色谱 串联质谱法同时测定牙膏中三七皂苷和人参皂苷 年第 期 质谱参数的选择比较了正负两种电离模式下四种皂苷的响应强度。在正离子模式下，出现 、准分子离子峰，负离子模式下有 、准分子离子峰。当选择 峰作为母离子时，化合物信号响应强度最高。四种皂苷的分子结构都含相同的皂苷苷元和不同的糖基，通过对 峰产生的离子碎片进行分析发现，在质谱裂解过程中有相似的规律。通过调节碰撞能，四种准分子离子首先断裂失去甲酸根，形成 的子离子，人参皂苷 和人参皂苷 再进一步失去 个葡萄糖基，分别形成 为 和 的特征离子；人参皂苷 失去一个葡萄糖基和鼠李糖基，形成 为 的特征离子；三七皂苷 则失去一个葡萄糖基和阿拉伯糖基形成 也为 的特征离子。从而确定 种皂苷的质谱参数（见表 ）。离子源温度的选择比较 、个离子源温度对皂苷信号响应强度的影响。实验结果显示，随着温度升高，四种化合物的响应均成下降趋势，当温度超过 时，响应下降更为明显。离子源温度过低，会降低气化和雾化效率，因此，本方法选择 作为离子源温度。线性方程和检出限在 仪器条件下对系列标准工作溶液进行测定。以各目标物质量浓度（）为横坐标，对应峰面积（）为纵坐标，分别绘制标准工作曲线。对阴性样品添加适量 种皂苷混合标准溶液，按照试样前处理方法和仪器条件进行测定，以信噪比 确定方法检出限，以信噪比 确定方法定量限。线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表 。表 四种目标物的线性方程、线性范围、相关系数、方法检出限和定量限化合物线性方程线性范围（）相关系数方法检出限（）方法定量限（）三七皂苷 人参皂苷 人参皂苷 人参皂苷 由表 可知，人参皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 和三七皂苷 的质量浓度在各自范围内与相应色谱峰面积呈良好的线性关系，人参皂苷 和人参皂苷 的方法检出限为 ，方法定量限为 ；人参皂苷 和三七皂苷 的方法检出限为 ，方法定量限为 。精密度试验及加标回收试验选用二氧化硅基质、碳酸钙基质和磷酸氢钙基质 种空白牙膏样品为加标基质，按 方法进行处理，分别加入低、中、高 个加标水平的皂苷标准溶液（其中人参皂苷 和人参皂苷 添加 、三个浓度水平，人参皂苷 和三七皂苷 添加 、三个浓度水平），在 仪器条件下平行测定 次，测定结果见表 。由表 可知，三七皂苷 的平均回收率在 之间，相对标准偏差（，）在 之间；人参皂苷 的平均回收率在 ，相对标准偏差（，）在 之间；人参皂苷 的平均回收率在 之间，相对标准偏差（，）在 之间；人参皂苷 的平均回收率在 之间，相对标准偏差（，）在 之间。结果表明，本方法具有良好的准确度和精密度，满足分析要求。实际样品的分析采用本方法对市售的 批次牙膏样品（其中 批次二氧化硅基质牙膏，批次碳酸钙基质牙膏，批次磷酸氢钙基质牙膏）进行四种皂苷的测定。结果显示，有 支牙膏 种皂苷均有检出，另外有 支牙膏检出人参皂苷 和人参皂苷 。人 年第 期税钿，等：超高效液相色谱 串联质谱法同时测定牙膏中三七皂苷和人参皂苷 参皂苷 的检出量为 ，人参皂苷 添加量为 ，人参皂苷 添加量为 ，三七皂苷 添加量为 。所有阳性样品在成分表中均标示添加了三七提取物或者粉末，但同时存在有产品标示添加了三七提取物但未检出相关成分的情况。表 精密度试验和加标回收试验结果待测物添加水平（）二氧化硅基质回收率（）（）碳酸钙基质回收率（）（）磷酸氢钙基质回收率（）（）三七皂苷 人参皂苷 人参皂苷 人参皂苷 结论本研究采用高效液相色谱 串联质谱技术建立了牙膏中三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 及人参皂苷 的检测方法。对提取条件、色谱条件和质谱条件等进行了优化，并将该方法应用于不同基质牙膏的检测。结果表明，该方法能对三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 及人参皂苷 进行准确测定，且方法精密度好，满足相关检测需求，可为牙膏产品的质量监控提供有力的技术支撑。参考文献 徐馨，徐春生 三七提取物在口腔产品中的应用 口腔护理用品工业 ，（）：申崇光，田嘉松，陈妍 田七总皂甙在牙膏中的应用 口腔护理用品工业 ，（）：国家药典委员会中华人民共和国药典，一部 北京：中国医药科技出版社，：陈玉玲 牙膏中三七皂苷 定性检测法的改进 口腔护理用品工业 ，（）：杨唯，黄思成，朱志坤，等 昭通产三七不同部位总皂苷含量比较研究 ，中国医药导刊 ，（）：熊梅，周云波 法测定气血康口服液中人参皂苷 ，人参皂苷 和三七皂苷 ，中草药，（）：唐光明，柯立坚 法测定田七药物牙膏中三七总皂苷含量 首都医药 ，（）：钟名诚，何金凤，王文丽，等 中药牙膏中三七皂苷 、人参皂苷 及 的检测方法研究 口腔护理用品工业 ，（）：张岩，马晓斐，吕品，等 在线二维柱切换高效液相色谱法同时测定牙膏中三七皂苷 、人参皂苷 、和 分析化学 ，（）：刘厚权，林飞英，肖忠训，等 法测定血平片中三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 的含量研究 特产研究 ，（）：陈肇娜，吴丽荣，李丝红 超声提取法测定三七片中三七皂苷 、人参皂苷 和人参皂苷 的含量 海峡药学 ，（）：周跃，李春莉，王冲，等 蒸发光散射检测法测定铁皮石斛西洋参颗粒中人参皂苷 和人参皂苷 的含量 哈尔滨医科大学学报 ，（）：陈菲，林晓兰，席海为，等 同时测定中药活血益气方中三七皂苷 、人参皂苷 、人参皂苷 的含量 中国实验方剂学杂志 （）：李莹，葛盟，王安琪，等 法同时测定人参不同部位中 种皂苷含量及差异性分析研究 特产研究 ，（）：陈丽华，杨秀伟，白雪媛，等 超快速液相色谱 质谱法测定鲜人参晶及林下山参中的 个人参皂苷成分 中国现代中药 ，（）：（收稿日期：年 月 日）