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2023 年10 月 第 44 卷 第 5 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Oct.2023Vol.44 No.5基金项目:北京市卫生健康委员会北京市研究型病房示范建设项目(BCRW202109),首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院“优青人才”计划专项经费资助项目(YQRC201804)。This study was supported by Beijing Municipal Health Commission,Demonstration Construction Project of Clinical Research Ward(BCRW202109),Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University,Beijing Maternal and Child Health Care Hospital Excellent Youth Plan Special Funds(YQRC201804).Corresponding author,E-mail:fcyydym 网络出版时间:2023-10-24 1357 网络出版地址:https:/ FAM95B1 调控胰岛素样生长因子 2 的表达对宫腔粘连发生的影响巫剑红 田玉翠 蒋子雯 唐世倩 刘朝晖 代荫梅(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇科,北京 100026)【摘要】目的 探究 lncRNA FAM95B1 及蛋白编码基因胰岛素样生长因子 2(insulin-like growth factor 2,IGF2)对宫腔粘连发生的作用,为宫腔粘连的防治提供新的分子靶点。方法在宫腔粘连组织中采用反转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测 lncRNA FAM95B1 的 mRNA 表达水平,采用 Western blotting方法检测 IGF2 及纤维化标志物-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)、I 型胶原蛋白(collagen type I alpha 1 chain protein,COL1A1)的蛋白表达水平。在经过转化生长因子-1(transforming growth factor-1,TGF-1)处理的子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)中,采用 RT-qPCR 方法检测 lncRNA FAM95B1、IGF2、纤维化标志物(-SMA、COL1A1、Snail)及上皮标志蛋白 E-cadherin 的 mRNA 表达水平。在 ESCs 中,分别下调 lncRNA FAM95B1 和 IGF2 基因,验证二者的调控关系;免疫共沉淀实验检测 lncRNA FAM95B1 与 IGF2 的结合关系。然后,si-FAM95B1 转染入 ESCs 中并经过 TGF-1 处理,进一步探究lncRNA FAM95B1 及 IGF2 在 ESCs 向成纤维细胞分化的上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用。结果 宫腔粘连组织中 lncRNA FAM95B1、IGF2 及纤维化标志物-SMA、COL1A1 的表达水平上调;经过 TGF-1 处理的 ESCs 中lncRNA FAM95B1、IGF2、纤维化标志物(-SMA、COL1A1、Snail)的表达水平上调,上皮标志蛋白 E-cadherin 的表达水平下调。IGF2 随 lncRNA FAM95B1 的变化而变化,而下调 IGF2 后,lncRNA FAM95B1 的表达无明显变化,lncRNA FAM95B1 正向调节IGF2;lncRNA FAM95B1 与 IGF2 在 TGF-1 处理的 ESCs 中结合。si-FAM95B1 在 ESCs 向成纤维细胞分化的 EMT 过程中抑制IGF2 的表达,发挥抗纤维化作用。结论 si-FAM95B1 可通过下调 IGF2 的表达抑制宫腔粘连的发生,lncRNA FAM95B1/IGF2 轴可能为宫腔粘连的靶向治疗提供新的分子靶点。【关键词】宫腔粘连;lncRNA FAM95B1;胰岛素样生长因子 2;上皮-间质转化【中图分类号】R711.74 【文献标识码】AThe effect of lncRNA FAM95B1 on the pathogenesis of intrauterine adhesion by regulating insulin-like growth factor 2Wu Jianhong,Tian Yucui,Jiang Ziwen,Tang Shiqian,Liu Zhaohui,Dai Yinmei(Department of Gynecology,Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University;Beijing Maternal and Child Health Care Hospital,Beijing 100026,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding RNA(lncRNA)family with sequence similarity 95 member B1(FAM95B1)and insulin-like growth factor 2(IGF2)on the pathogenesis of intrauterine adhesion.MethodsReverse transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)was used to determine the mRNA expression levels of lncRNA FAM95B1,Western blotting was used to determine the protein expression levels of IGF2,-smooth muscle actin(-SMA)and collagen type I alpha 1 chain protein(COL1A1)in samples of intrauterine adhesion(IUA)tissue.RT-qPCR was used to determine the mRNA expression levels of lncRNA FAM95B1,IGF2,fibrotic markers(-SMA,COL1A1,Snail)and epithelial marker E-cadherin in endometrial stromal cells(ESCs)that had been treated with transforming growth factor-1(TGF-1).Then,lncRNA FAM95B1 and IGF2 genes were down-regulated respectively to verify the regulatory relationship between lncRNA FAM95B1 and IGF2;Co-immunoprecipitation assay was performed to measure the binding relationship between lncRNA FAM95B1 and IGF2.Next,ESCs were transfected with si-FAM95B1 and 首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷then were treated with TGF-1 to investigate the effect of lncRNA FAM95B1 and IGF2 on the transdifferentiation of ESCs into myofibroblasts.Results The expression levels of lncRNA FAM95B1,IGF2,-SMA and COL1A1 was upregulated in IUA tissues.The mRNA expression levels of lncRNA FAM95B1,IGF2,-SMA,COL1A1 and Snail were upregulated and the mRNA level of E-cadherin was downregulated in ESCs that had been treated with TGF-1.IGF2 was positively regulated by lncRNA FAM95B1.LncRNA FAM95B1 and IGF2 were directly bound in TGF-1-treated ESCs.During the epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)of ESCs transdifferentiating into myofibroblasts,si-FAM95B1 exerted antifibrotic effect by down-regulating IGF2.Conclusionssi-FAM95B1 inhibits the pathogenesis of IUA by down-regulating IGF2.LncRNA FAM95B1/IGF2 axis may provide novel molecular target for the prevention and treatment of IUA.【Key words】intrauterine adhesions;LncRNA FAM95B1;insulin-like growth factor 2;epithelial-to-mesenchymal transition 宫腔粘连是由于子宫内膜损伤导致宫腔闭塞的一种疾病,其形成是纤维化发生的过程,在此过程中子宫内膜基质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)向成纤维细胞转化,即发生了上皮-间质转化(epithe-lial-to-mesenchymal transition,EMT)的过程1。转化生长因子-(transforming growth factor-beta,TGF-)对纤维化的形成具有重要启动作用,被认为是最强的促纤维化细胞因子。研究2表明,TGF-可诱导ESCs 向成纤维细胞转化从而构建宫腔粘连的细胞模型。LncRNA 是长度大于 200 bp 的非编码 RNA。近年来,lncRNA 参与器官纤维化的发生发展过程日益成为研究热点,为临床靶向治疗脏器纤维化提供了可能性3-4。本课题组前期通过 RNA 高通量测序发现,lncRNA FAM95B1 和蛋白编码基因胰岛素样生长因子 2(insulin-like growth factor 2,IGF2)在宫腔粘连组织中均高表达;生物信息学分析显示,IGF2 是 ln-cRNA FAM95B1 反式作用的蛋白编码靶基因。那么,lncRNA FAM95B1 是否通过调节 IGF2 的表达在宫腔粘连的发生中发挥作用呢?笔者未检索到相关报道。本研究旨在探讨 lncRNA FAM95B1 在宫腔粘连中的表达、功能及作用机制,从而为宫腔粘连的防治提供新的思路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 临床标本 选择 2021 年 1 月至 2021 年 12 月首都医科大学附属北京妇产医院妇科因有生育要求行宫腔镜下宫腔粘连松解术的宫腔粘连患者 20 例和因不孕行宫腹联合手术可提供正常子宫内膜组织的患者 20 例。所有患者采集标本时均处于月经周期的增殖早期,年龄40 岁。宫腔粘连严重程度采用美国生殖协会评分标准5,所有患者均为中-重度。经首都医科大学附属北京妇产医院伦理委员会的审查同意(审批号:2022-KY-056-01),根据赫尔辛基宣言,向患者知情告知,征得其同意并签署书面知情同意后入组。合并有结缔组织病、子宫内膜病变、内分泌疾病的患者均予以排除。1.1.2 细胞标本 ESCs 购自北纳生物技术有限公司。1.1.3 主要试剂与仪器HiScript Q Select RT SuperMix、SYBR Green Master Mix Kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司;TGF-1 购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;小干扰FAM95B1(small interfering FAM95B1,si-FAM95B1)、小干扰 IGF2(small interfering IGF2,si-IGF2)、siControl 购自广州锐博生物有限公司;抗-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)抗体、抗 I 型胶原蛋白(collagen type I al-pha 1 chain protein,COL1A1)抗体、抗IGF2 抗体、抗Snail抗体、抗 E-cadherin 抗体、抗 Western blotting 二抗抗体、IgG 抗体均购自英国Abcam 公司;实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems,7500 Real Time PCR System)购自上海 Thermo Fisher 科技有限公司。1.2 方法1.2.1 样品采集及处理方法(1)宫腔粘连组织的采集:在宫腔粘连松解术中,利用宫腔镜操作剪冷刀剪取大约 0.5 cm3宫腔粘连组织。(2)正常子宫内膜组织的采集:宫腔镜术中,小刮匙刮取大约 0.5 cm3正常子宫内膜。所有标本离体后放入冻存管中,于 30 min 内放入-80 冰箱中保存。1.2.2 RNA 提取和反转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)按照 Trizol Regent 试剂盒说明书方法提取细胞总RNA,紫外分光光度仪测定 RNA 纯度及浓度。利用HiScript Q Select RT SuperMix 反转录试剂盒合成 cD-NA,保存于-80 冰箱备用。RT-qPCR 引物由北京微旋基因技术有限公司合成,各引物序列详见表 1。反应液按 SYBR Green I 10 L、Primer F(10 mol/L)228第 5 期巫剑红等:LncRNA FAM95B1 调控胰岛素样生长因子 2 的表达对宫腔粘连发生的影响1 L、primer R(10 mol/L)1 L、ddH2O 8 L 反应体系进行配制。PCR 扩增反应条件:95 预变性2 min,然后 95 变性30 s,58 退火30 s,72 延伸30 s,进行 40 个循环。扩增结束后通过查看溶解曲线和扩增曲线确定结果的准确性。以GAPDH 为内参,用2-ct的方法计算 RNA 表达量。表 1 RT-qPCR 的引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequence Primer SequenceFAM95B1F:5-AACGTAGGCACCGCAGAC-3R:5-CCTCCCAGAACATGACACG-3IGF2F:5-GGCTCTGGGCTCTGTAAGG-3R:5-CTCTTGCTCTGGGCTTCAAC-3-SMAF:5-GGCTCTGGGCTCTGTAAGG-3R:5-CTCTTGCTCTGGGCTTCAAC-3COL1A1F:5-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3 R:5-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3SnailF:5-CCACTGCAACCGTGCTTTT-3 R:5-CACATCCGAGTGGGTTTGG-3E-cadherinF:5-GACCGAGAGAGTTACCCT-3 R:5 CTTGACCCTGATACGTGC-3GAPDHF:5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3R:5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 RT-qPCR:reverse transcription-quantitative polymerase chain reac-tion;F:forward;R:reverse;IGF2:insulin-like growth factor 2;-SMA:-smooth muscle actin;COL1A1:collagen type 1 alpha 1.1.2.3 细胞培养及 TGF-1 处理购买的 hESCs 经过细胞复苏后,加入含 10%(体积分数)胎牛血清、1%(质量分数)的双抗溶液的DMEM 培养基并放置入 37 、5%(体积分数)CO2、95%湿度的培养箱中进行细胞培养。显微镜下观察当细胞融合达 80%90%时,可进行细胞传代,按照12 或 1 3 比例传代培养。取第 3 代 第 6 代的ESCs 采用梯度降温冻存原则进行细胞冻存。ESCs在 TGF-1 处理前先进行24 h 饥饿处理,去除原培养基(牛血清培养基),加入无血清培养基。而后 ESCs种植在 6 孔培养板上,每个孔的细胞密度为 2105个/L,以 10 ng/mL 的 TGF-1 处理 hESCs 48 h。1.2.4 免疫共沉淀实验 根据 RNA 免疫共沉淀试剂盒说明书的操作方法检测 TGF-1 处理的 ESCs 中能与 IGF2 蛋白结合的 lncRNA FAM95B1。以 IgG 为对照,在反应管中加入 IGF2 抗体 5 g。然后按照 1.2.2 中的方法检测抗 IGF2 和 IgG 沉淀中 lncRNA FAM95B1,IgG 组的 lncRNA FAM95B1 作为对照。1.2.5 构建 si-FAM95B1、si-IGF2 与细胞转染 根据 siRNA 设计原则,设计针对目标基因的 siR-NA 序列,构建了3 条si-FAM95B1 和3 条si-IGF2。这些小干扰 RNA 由广州锐博生物有限公司合成。按照Lipofectamine3000 转染试剂说明书进行转染,转染后的细胞置于 37 细胞培养箱中培养 4 h 后,更换完全培养基,培养 48 h 后,收细胞用于实验。1.2.6Western blotting 方法检测 IGF2、-SMA、COL1A1、Snail、E-cadherin 的蛋白表达水平收集生长状态良好的经 TGF-1 处理的 ESCs,经裂解离心后取上清,用 BCA 试剂盒进行蛋白定量,加上样缓冲液后金属浴 10 min,用 SDS-PAGE 分离,转膜后用 50 g/L 脱脂奶粉封闭;加入一抗后 4 孵育过夜,次日于室温下加入山羊抗兔 IgG(稀释比 12 000)孵育 2 h,然后用增强化学发光法检测。采用 Image J软件对蛋白条带的灰度值进行分析,以-actin 为内参,以 IGF2 蛋白、COL1A1 蛋白、-SMA 蛋白、Snail 蛋白、E-cadherin 蛋白条带灰度值与-actin 蛋白条带灰度值的比值来分别表示 IGF2 蛋白、COL1A1 蛋白、-SMA 蛋白、Snail 蛋白、E-cadherin 蛋白的相对表达量。1.3 统计学方法采用 SPSS 19.0 软件进行统计学处理,所有定量数据检测均重复 3 次,数据以均数标准差(xs)表示。两组样本的均值比较采用 t 检验,两组以上组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较根据方差齐性采用 LSD 检验或 Dunnett-t 检验。以 P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 宫腔粘连组织中 lncRNA FAM95B1、IGF2 及纤维化标志物-SMA、COL1A1 表达水平上调RT-qPCR 结果显示,宫腔粘连组织中 lncRNA FAM95B1 的 mRNA 平均表达水平为 4.162.74(0.7811.92)显著高于正常子宫内膜组织中 lncRNA FAM95B1 的 mRNA 平均表达水平1.110.86(0.043.07),差异有统计学意义(P0.001)(图 1)。Western blotting 结果表明,与正常子宫内膜相比,宫腔粘连组织中 IGF2、-SMA 和 COL1A1 的蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.01)(因采集的宫腔粘连组织标本量有限,在行 RT-qPCR检测 mRNA 表达水平后,仅剩 3 例宫腔粘连标本有足够组织量行 Western blotting 检测)(图 2)。328首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷图 1 宫腔粘连组织和正常子宫内膜组织中lncRNA FAM95B1 的 mRNA 表达水平比较Fig.1 Comparison of mRNA expression levels of lncRNA FAM95B1 in samples of IUA and normal controls P0.001;n=20;IUA:intrauterine adhesion.图 2 宫腔粘连组织和正常子宫内膜组织中 IGF2、-SMA、COL1A1 的蛋白表达水平比较Fig.2 Comparison of protein expression levels of IGF2,-SMA,COL1A1 in samples of IUA and normal controls P0.01 vs normal controls.n=3;IGF2:insulin-like growth factor 2;-SMA:-smooth muscle actin;COL1A1:collagen type I alpha 1 chain protein;IUA:intrauterine adhesion.2.2ESCs 向 成 纤 维 细 胞 分 化 过 程 中 lncRNA FAM95B1 及 IGF2 表达水平上调显微镜下观察 ESCs 呈长梭形,经 TGF-1 处理后,ESCs 细胞形态渐变肥大,其形态特征由纤维样细胞向肌成纤维细胞形态过度、转变(图 3);纤维化标志蛋白-SMA、COL1A1、Snail 的 mRNA 表达水平上调,上皮标志蛋白 E-cadherin 的 mRNA 表达水平下调,差异有统计学意义(P0.01)(图 4)。在此过程中 lncRNA FAM95B1 和 IGF2 的 mRNA 表达水平显著升高(P0.01)(图 4)。图 3 TGF-1 处理前(A)、处理后(B)显微镜下ESCs 形态学观察Fig.3 Morphological observation of ESCs under the microscope before(A)and after(B)TGF-1 treatment(40)TGF-1:transforming growth factor-1;ESCs:endometrial stromal cells.图 4 ESCs 向成纤维细胞转化过程中 lncRNA FAM95B1、IGF2、-SMA、COL1A1、Snail、E-cadherin 的 mRNA 表达水平Fig.4 The mRNA expression levels of lncRNA FAM95B1,IGF2,-SMA,COL1A1,Snail and E-cadherin in the transdifferentiation of ESCs into myofibroblasts P0.01 vs 0 ng/mL group.n=3.ESCs:endometrial stromal cells;IGF2:insulin-like growth factor 2;-SMA:-smooth muscle actin;COL1A1:collagen type I alpha 1 chain protein.2.3 lncRNA FAM95B1 与 IGF2 之间的相互作用si-FAM95B1 和 si-IGF2 分别转染入 ESCs 中,qRT-PCR 进一步检测 lncRNA FAM95B1 和 IGF2 的 mRNA表达水平,结果显示:si-FAM95B1-1 和 si-FAM95B1-2可显著抑制FAM95B1 的mRNA 表达(图5A)(P0.01);428第 5 期巫剑红等:LncRNA FAM95B1 调控胰岛素样生长因子 2 的表达对宫腔粘连发生的影响图 5 下调 FAM95B1 后的 lncRNA FAM95B1(A)与 IGF2(B)的 mRNA 水平,下调 IGF2 后的 IGF2(C)和 lncRNA FAM95B1(D)的 mRNA 表达水平Fig.5 The mRNA expression levels of lncRNA FAM95B1(A)and IGF2(B)after down-regulating FAM95B1,the mRNA expression levels of IGF2(C)and lncRNA FAM95B1(D)after down-regulating IGF2 P0.01 vs siControl;n=3;IGF2:insulin-like growth factor 2.IGF2 随着 lncRNA FAM95B1 的变化而发生对应的变化,差异有统计学意义(图 5B)(P0.01)。si-IGF2-1、si-IGF2-2 和 si-IGF2-3 可显著抑制 IGF2 的 mRNA表达(图 5C)(P 0.05);TGF-1 处理 ESCs 后,抗IGF2 组的 lncRNA FAM95B1 表达水平显著高于 IgG组(P0.05)(表 2)。表 2 lncRNA FAM95B1 与 IGF2 在 TGF-1 处理的子宫内膜基质细胞中结合Tab.2 The binding relationship between lncRNA FAM95B1 and IGF2 in TGF-1-treated endometrial stromal cells(xs)GroupsTGF-1 untreatedTGF-1 treatedIgG0.630.130.670.11LncRNA FAM95B10.760.092.450.21t-2.15-34.52P0.100.000 IGF2:insulin-like growth factor 2;TGF-1:transforming growth fac-tor-1.2.4 si-FAM95B1 在 ESCs 向成纤维细胞分化过程中抑制 IGF2 的表达本研究选择基因敲减效果好的 si-FAM95B1-1 和si-FAM95B1-2 进行下一步实验。将 si-FAM95B1-1 和si-FAM95B1-2 转染入 ESCs 并经过 10 ng/mL 的 TGF-1 处理 48 h,然后检测 IGF2、-SMA、COL1A1、Snail和 E-cadherin 的蛋白表达水平。研究显示,与 siCon-trol+TGF-1 组相比,si-FAM95B1-1 和 si-FAM95B1-2可显著抑制 IGF2 及纤维化标志物-SMA、COL1A1、Snail 的蛋白表达水平,可显著升高上皮标志蛋白 E-cadherin 的表达水平,差异有统计学意义(P0.01)(图 6)。3 讨论宫腔粘连继发于子宫内膜损伤,可导致月经异常、不孕、反复自然流产、胎盘粘连、胎盘植入等一系列问题。近年来,随着各种宫腔操作的增多,宫腔粘连的发病率呈上升趋势6。宫腔镜是诊断宫腔粘连的金标准,宫腔镜下宫腔粘连分离术是宫腔粘连最主要的治疗方式。然而,术后宫腔粘连复发率高达 3.1%23.5%,尤 其 在 重 度 宫 腔 粘 连 病 例 中(20%62.5%)7,因此积极寻求有效的宫腔粘连治疗方法,尤其是针对发病机制的靶向治疗,已经成为临床上亟待解决的问题。本研究显示,在宫腔粘连组织中纤维化标志物-SMA、COL1A1 的蛋白表达水平明显上升,说明宫腔粘连的形成是纤维化发生的过程,因此探讨抑制其纤维化发生的分子靶点,具有重要的临床意义。LncRNA 虽然不编码蛋白质,但其可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达,包括细胞增殖、分化和凋亡。LncRNA 主要通过顺式和反528首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷图 6 si-FAM95B1 通过下调 IGF2 的表达抑制 ESCs 向成纤维细胞转化Fig.6 si-FAM95B1 inhibits the transdifferentiation of ESCs into myofibroblasts by down-regulating the expression of IGF2 P0.01 vs siControl+TGF-1 group.n=3;IGF2:insulin-like growth factor 2;ESCs:endometrial stromal cells;TGF-1:transforming growth factor-1;-SMA:-smooth muscle actin;COL1A1:collagen type I alpha 1 chain protein.式两种方式发挥作用,lncRNA 调控同一染色体上其邻近部位蛋白编码基因为其顺式作用的靶基因;ln-cRNA 与调控的蛋白编码基因在位置上没有关系,而与其表达相关性较高,为其反式作用的靶基因8。本研究前期通过生物信息学分析发现,IGF2 是 ln-cRNA FAM95B1 反式作用的靶基因。研究9表明,lncRNA 在纤维化疾病中既可发挥促纤维化作用又可发挥抗纤维化作用。LncRNA FAM95B1 作为一种新发现的 lncRNA,位于人染色体 9p11,与甲状腺癌预后10及类风湿关节炎的炎症反应相关,并且与 TGF-信号通路相关11。然而,尚未见 lncRNA FAM95B1 在纤维化疾病中的研究。IGF2 作为促有丝分裂细胞因子,与组织修复过程相关12-13。另外,IGF2 在多种纤维化疾病中高表达14。系统性红斑狼疮患者的肺成纤维细胞中 IGF2 的 mRNA 表达水平是正常人的 4 倍,蛋白表达水平是正常人的 2 倍,且 IGF2 在肺成纤维细胞中通过活化 PI3K 和 JNK 诱导 I 型胶原蛋白和纤连蛋白的表达15。在小鼠肝脏纤维化模型中,肝细胞过表达 IGF2,IGF2 可促进肝星状细胞转化为肝成纤维细胞并促进细胞增殖,促进胶原蛋白和-SMA 的表达16-17。总之,IGF2 可活化 TGF-的促纤维化信号通路,导致成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积,从而导致纤维化疾病的发生。本研究显示,ESCs 经 TGF-1 处理后,其细胞形态由纤维样细胞向肌成纤维细胞形态转变;纤维化标志蛋白-SMA、COL1A1、Snail 的 mRNA 表达水平上调而上皮标志蛋白 E-cadherin 的 mRNA 表达水平下调,说明 ESCs 经 TGF-1 处理后发生了向成纤维细胞分化的 EMT 过程。在此 EMT 过程中,lncRNA FAM95B1 和 IGF2 的 mRNA 表达水平显著升高,与宫腔粘连组织中 lncRNA FAM95B1 和 IGF2 的表达水平明显升高的结果一致,说明 lncRNA FAM95B1 和IGF2 在宫腔粘连的发生过程中发挥了重要作用。为明确 lncRNA FAM95B1 和 IGF2 的相互调控关系,将si-FAM95B1 和 si-IGF2 分别转染入 ESCs 中并检测lncRNA FAM95B1 和 IGF2 的 mRNA 表达水平,结果显示,IGF2 随着 lncRNA FAM95B1 的变化而发生相应的变化,而 IGF2 下调后 lncRNA FAM95B1 无明显变化,证实 lncRNA FAM95B1 正向调控 IGF2;且免疫共沉淀实验显示,抗 IGF2 组的 lncRNA FAM95B1 表达水平显著高于 IgG 组,说明 lncRNA FAM95B1 能与628第 5 期巫剑红等:LncRNA FAM95B1 调控胰岛素样生长因子 2 的表达对宫腔粘连发生的影响IGF2 结合。进一步研究显示,si-FAM95B1-1 和 si-FAM95B1-2 可显著抑制 IGF2 及纤维化标志物-SMA、COL1A1、Snail 的蛋白表达水平,可显著升高上皮 标 志 蛋 白 E-cadherin 的 表 达 水 平,表 明 si-FAM95B1 可抑制 EMT 过程,通过下调 IGF2 的表达而发挥抗纤维化作用。目前笔者未检索到国内外关于 lncRNA FAM95B1 和 IGF2 在宫腔粘连中作用的报道,本研究具有一定的创新性。综上所述,lncRNA FAM95B1 和 IGF2 在宫腔粘连组织及 ESCs 向成纤维细胞转化的 EMT 过程中显著上调表达,si-FAM95B1 可通过下调 IGF2 的表达而抑制 EMT 过程。lncRNA FAM95B1/IGF2 轴可能为宫腔粘连的靶向治疗提供了新的分子靶点。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。作者贡献声明 巫剑红:提出研究思路,设计研究方案,撰写论文;田玉翠、蒋子雯、唐世倩:标本采集,实验数据分析;刘朝晖、代荫梅:总体把关,审定论文。参考文献 1 Li C Q Wang W Y Sun S Y et al.Expression and po-tential role of MMP-9 in intrauterine adhesion J.Medi-ators Inflamm 2021 2021 6676510.2 Li J X Cen B H Chen S P et al.MicroRNA-29b in-hibits TGF-1-induced fibrosis via regulation of the TGF-1/Smad pathway in primary human endometrial stromal cells J.Mol Med Rep 2016 13 5 4229-4237.3 Yang Z Jiang S Shang J J et al.LncRNA shedding light on mechanisms and opportunities in fibrosis and ag-ing J.Ageing Res Rev 2019 52 17-31.4 Henderson N C Rieder F Wynn T A.Fibrosis from mechanisms to medicines J .Nature 2020 587 7835 555-566.5 The American Fertility Society.The American fertility society classifications of adnexal adhesions distal tubal occlusion tubal occlusion secondary to tubal ligation tubal pregnancies mllerian anomalies and intrauterine adhesions J.Fertil Steril 1988 49 6 944-955.6 Barel O Krakov A Pansky M et al.Intrauterine adhe-sion