GC-MS_MS法测定复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中N-亚硝基二甲胺与N-亚硝基二乙胺.pdf

2720Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期GC-MS/MS法测定复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中 N-亚硝基二甲胺与 N-亚硝基二乙胺岳青阳1，2，张耀文1，2，徐万魁1，2*（1.辽宁省检验检测认证中心，沈阳110036；2.辽宁省药品检验检测院/国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室，沈阳110036）摘要：目的建立复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中 N-亚硝基二甲胺（NDMA）与 N-亚硝基二乙胺（NDEA）的检测方法。方法色谱柱为 Agilent VF-WAXms，载气为氦气，流速为 1.2 mLmin 1，进样口温度 250，柱温为程序升温。电子轰击电离方式，离子源温度：230；定量测定采用 MRM模式。以 8 批复方盐酸二甲双胍格列吡嗪胶囊为测定对象，测定其 NDMA和 NDEA含量。结果NDMA、NDEA及相邻色谱峰之间的分离良好，分别在 0.1966 39.32 ngmL 1（r 0.9990）和 0.1870 37.41 ngmL 1（r 0.9995）内与峰面积线性关系良好，检测限分别为 0.0983 ngmL 1和 0.0935 ngmL 1，加样回收率分别为 82.3%和 85.4%。结论该法分离效果好、操作简便、灵敏度高，可同时检测复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中 NDMA和 NDEA的含量。关键词：GC-MS/MS；N-亚硝基二甲胺；N-亚硝基二乙胺；复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中图分类号：R927文献标识码：A文章编号：1672-2981(2023)10-2720-04doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2023.10.026Determination of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylamine in compound metformin hydrochloride and glipizide capsules by GC-MS/MSYUE Qing-yang 1,2,ZHANG Yao-wen1,2,XU Wan-kui1,2*(1.Liaoning Inspection,Examination and Certification Centre,Shenyang 110036;2.Liaoning Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drug,Shenyang 110036)Abstract:Objective To establish a specific method to determine N-nitrosodimethylamine(NDMA)and N-nitrosodiethylamine(NDEA)in compound metformin hydrochloride and glipizide capsules.Methods The separation was performed on an Agilent VF-WAXms column in a temperature rising program.The carrier gas was helium with the flow rate of 1.2 mLmin 1.The inlet temperature was 250.The sample was ionized by electron ionization with multi reaction monitoring data acquisition mode.NDMA and NDEA were detected in 8 batches of compound metformin hydrochloride and glipizide capsules following based on the conditions.Results NDMA,NDEA and adjacent chromatographic peaks were separated well and showed good linearity at 0.196639.32 ng mL1(r0.9990)and 0.187037.41 ngmL 1(r 0.9995),respectively.The limit of detection was 0.0983 ngmL 1 and 0.0935 ngmL 1.The sample recoveries were 82.3%and 85.4%.Conclusion The method separaties well,convenient and sensitive,which can be used in the simultaneous determination of NDMA and NDEA in compound metformin hydrochloride and glipizide capsules.Key words:GC-MS/MS;N-nitrosodimethylamine;N-nitrosodiethylamine;compound metformin hydrochloride and glipizide capsule基金项目：辽宁省自然科学基金项目（No.2020-MS-073）。作者简介：岳青阳，女，副主任药师，主要从事药品质量标准研究，email：*通信作者：徐万魁，男，主任药师，主要从事药品质量标准研究与质量控制研究，email：2721中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 基因毒性杂质是指能够直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向的一类物质，对 DNA 的损害包括染色体断裂、DNA 重组及复制过程中共价键的插入和修饰，也包括在细胞水平产生基因毒性物质而产生的突变1-2，如磺酸酯类、N-亚硝胺类、卤代烷烃类和肼类等，其中 N-亚硝胺类基因毒性杂质是公认的强毒性的化合物之一。N-亚硝基二甲胺（NDMA）及 N-亚硝基二乙胺（NDEA）均为常见的 N-亚硝胺类化合物，不仅属于 2A 类致癌物质，而且属于三大“关注队列”的基因毒性杂质，在 ICH M7 指南中明确该类化合物具有较高致癌性3-5。目前，我国高血糖发病率持续增长，其中 2型糖尿病占糖尿病人群的近 90%，二甲双胍产品作为治疗 2 型糖尿病的一线药物，有着稳定的市场需求6。糖尿病患者需要终身服药，且服用的剂量大、时间长，因此需要更加严格地控制杂质水平。2019 年 12 月，FDA宣布从降糖药物盐酸二甲双胍制剂中检出杂质 NDMA，随后我国药品监督管理部门也陆续开展了二甲双胍制剂中NDMA的监测工作7-9。复方二甲双胍格列吡嗪胶囊为盐酸二甲双胍与格列吡嗪的复方制剂，临床上用于改善 2 型糖尿病患者的血糖控制，由临床数据显示，使用该复方制剂比单独使用二甲双胍效果更佳，且患者依从性、耐受性好，因此该制剂在临床上使用较为广泛10-11。目前复方二甲双胍格列吡嗪胶囊在国内尚属独家品种，并未对其中的亚硝胺类杂质进行控制，国内未见复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中 NDMA和 NDEA检测的有关文献。本文采用 GC-MS/MS法同时测定盐酸二甲双胍格列吡嗪胶囊中的 NDMA和 NDEA，结果准确可靠，可为其质量控制提供依据。1材料1.1仪器气相色谱-质谱联用仪（GC2030 气相色谱仪，TQ8050NX质谱检测器，日本岛津公司）。XP205电子天平（美国 METTLER TOLEDO公司，精度0.000 01 g）。1.2试药NDMA对照品（纯度为 99.5%，批号：510166-202104）、NDEA对照品（纯度为 100.0%，批号：510168-202103）（中国食品药品检定研究院）。二氯甲烷（色谱纯，批号：22085094，美国 Fisher公司）；盐酸（分析纯，批号：20210220，国药集团化学试剂有限公司）；氦气（纯度 99.99%）。8 批复方二甲双胍格列吡嗪胶囊均为辽宁修和药业有限公司生产。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为 Agilent VF-WAXms 毛细管柱（30 m0.25 mm，0.50 m）。柱温为程序升温：初始温度为 40，维持 0.5 min后，以 20min 1的速率升至 200，再以 60min 1的速率升至 240，维持 5 min；进样口温度为 250；进样量：1 L；载气为氦气，流速 1.2 mLmin 1；电离方式：电子轰击源（EI）；离子源温度：230；采集模式：MRM；离子源电压 0.99 kV。NDMA 的定量离子对 74/44，碰撞能量为 6 V，定性离子对为 74/42，碰撞能量为 21 V；NDEA的定量离子对为 102/85，碰撞能量为 6 V，定性离子对为 102/55，碰撞能量为 21 V。2.2对照品储备液的制备分别取 NDMA 与 NDEA 对照品各约 10 mg，精密称定，置 100 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。2.3供试品溶液的制备精密称取本品内容物适量（约相当于盐酸二甲双胍 500 mg），置 50 mL离心管中，加 1 molmL 1盐酸溶液 10 mL，涡旋 1 min，再以350 次min 1的频率振摇 10 min，精密加入二氯甲烷 10 mL，以 1000 rmin 1涡旋 1 min，继续 振 摇 10 min，然 后 以 4000 rmin 1离 心 10 min，小心抽取下层二氯甲烷层过滤，以 0.45 m滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。2.4系统适用性试验精密量取混合对照品储备液适量，用二氯甲烷稀释至质量浓度为 40 ngmL 1的溶液作为系统适用性溶液，以二氯甲烷作为空白溶液，取系统适用性溶液和空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图 1。结果表明，溶剂不干扰 NDMA 和 NDEA 的测定。2.5线性关系考察精密量取混合对照品储备液适量，用二氯甲烷逐步稀释至 0.2、0.5、1、2、5、10、20、40 ng mL 1，进样测定，结果见表 1。各组分在 0.1966 39.32 ngmL 1及 0.1870 37.41 ngmL 1内与峰面积线性关系良好。2722Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期图 1二甲双胍格列吡嗪胶囊代表性色谱图Fig 1Representative chromatogram of compound metformin hydrochloride and glipizide capsulesA.溶剂（solvent）；B.对照品（reference substances）；C.供试品（sample）；D.加标供试品（sample spiked reference）；1.NDMA；2.NDEA2.6检测限和定量限精密量取对照品储备液，用二氯甲烷逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以信噪比（S/N）3 时的浓度，为其检测限（LOD），S/N 10 时的浓度，为其定量限（LOQ），结果见表 1。2.7精密度取 0.5 ngmL 1对照品线性溶液，连续进样6 次，记录色谱图，NDMA 的 RSD 为 1.8%（n 6），NDEA 的 RSD 为 3.2%（n 6），表明仪器的精密度良好。2.8加样回收试验取同一批样品内容物 9 份，分别精密加入 20、25、30 ngmL 1对照品溶液 1 mL，各 3 份，按“2.3”项下方法进行处理后进样测定，计算各浓度的回收率。结果 NDMA和 NDEA加样回收率在82.3%85.4%，RSD在 2.6%3.9%，结果表明该方法准确可靠。2.9重复性取样品 4 粒内容物，精密加入 25 ngmL 1对照品溶液 1 mL，按“2.3”项下方法进行处理后进样测定，同法配制 6 份，记录色谱图。结果 NDMA和 NDEA峰面积的 RSD分别为 2.6%和 4.1%，表明重复性良好（n 6）。2.10稳定性表 1NDMA 和 NDEA 线性关系、检测限及定量限 Tab 1Linearity，detection limit，and quantitation limit of NDMA and NDEA化合物线性方程r范围/（ngmL 1）检测限/（ngmL 1）定量限/（ngmL 1）NDMAY 6.233103X 5.0821030.99900.1966 39.320.09830.1966NDEAY 4.809103X 851.20.99950.1870 37.410.09350.1870取重复性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在 0、2、4、8、12 h进样测定。结果表明，以二氯甲烷为溶剂，NDMA 和 NDEA在 12 h 内稳定，峰面积的 RSD 分别为 2.4%和 4.9%。2.11测定结果取本品适量，按“2.3”项下方法处理后进样测定，将测定结果代入标准曲线计算 NDMA 和NDEA含量。结果表明，8 批复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中均未检出 NDMA 和 NDEA。3讨论3.1检测方法的选择 目前，N-亚硝胺杂质的定量分析方法主要有GC-MS 法、GC-MS/MS 法、LC-MS/MS 法、LC-HRMS 法等12-15，本文采用 GC-MS/MS 方法，检测专属性强，灵敏度高，操作简便。3.2质谱条件的选择 制备 10 gmL 1的混合对照品溶液，使用全扫描模式对混合对照品溶液进行 m/z 40 200内的扫描，使用谱库比对确定 NDMA 和 NDEA的色谱峰，根据相对强度选择前体离子，NDMA和 NDEA 均选择分子离子作为前体离子。再通过产物离子扫描对碰撞能量及二级碎片离子进行优化，选择响应最高的产物离子，作为定性离子和定量离子。3.3供试品提取方法的选择 中国食品药品检定研究院颁布的盐酸二甲双胍中 N-亚硝基二甲胺推荐检测方法中盐酸二甲双胍不同制剂采用了不同提取溶剂，本研究分别2723中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 考察了二氯甲烷及盐酸加二氯甲烷两种提取方式，并考察了涡旋时间及振摇时间等因素。通过NDMA 及 NDEA的回收率对比试验，发现采用二氯甲烷提取，基质效应较大，辅料干扰测定，而采用 1 molmL 1盐酸加二氯甲烷作为提取溶剂时，辅料不干扰测定，且提取时涡旋 1 min，振摇 10 min，提取效果最佳。3.4假阳性结果的处理 在样品测定中发现在与 NDMA 对照品相同保留时间处出现色谱峰，且该色谱峰的定量与定性离子对均与对照品相同，但离子强度比与对照品相差较大，出现了假阳性现象。经优化质谱条件，将分辨率由“high”优化为“unit”后，假阳性现象消失。根据美国致癌性数据库（CPDB）中化合物的TD50值，NDMA和 NDEA按每日注射最大日暴露量（PDE）96 ngd 1和 26.5 ngd 1计，按照二甲双胍每日最大剂量 2000 mg，NDMA和 NDEA对应的分析评价阈值（AET）为 48 ngg 1和13.25 ngg 1。通过对 8 批复方二甲双胍格列吡嗪胶囊中的 NDMA和 NDEA杂质进行检测，结果显示两种杂质含量均小于其 AET。参考文献1 Bouder F.Regulating impurities in pharmaceutical prod-ucts：a tolerability of risk approach J.Expert Rev Clin Pharmacol，2008，1（2）：241.2 葛雨琦，叶晓霞，乐健，等.N-亚硝胺类基因毒性杂质与检测方法研究进展J.药物分析杂志，2020，40（1）：83-89.3 Pottegard Ottegard A，Kristensen KB，Ernst MT，et al.Use of N-nitrosodimethlyamine（NDMA）contaminated valsartan products and risk of cancer：danish nationwide cohortstudy J.BMJ，2018，362：k3851.4 ICH Harmonised Guideline.Assessment and control of DNA reactive（Mutagenic）impurities in pharmaceu-ticals to limit potential carcinogenic risk M7（R1）S.2017-03-31.5 International Agency for rsearch on Cancer（IARC）.Agents Classified by IARC Monographs S.2020-03-03 6 王慧，皇甫建，肖睿.二甲双胍降糖作用及降糖外作用的研究进展J.医学研究杂志，2018，47（4）：179-182.7 化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）S.2020-05-088 文松松，牛冲，刘琦，等.气相色谱-质谱联用法测定盐酸二甲双胍及制剂中的痕量 N-亚硝基二甲胺 J.中国医药工业杂志，2021，52（2）：244-249.9 叶晓霞，葛雨琦，乐健，等.缓释制剂辅料导致盐酸二甲双胍降解产生 N-亚硝基二甲胺的影响因素研究 J.药物分析杂志，2021，41（2）：293-299.10 张海鹏.二甲双胍格列吡嗪胶囊治疗 2 型糖尿病有效性和安全性的临床观察D.长春：吉林大学，2009.11 马智宇，曲斌，丁娅，等.盐酸二甲双胍格列吡嗪胶囊的健康人体药动学研究J.药物分析杂志，2012，32（1）：7-14.12 李彩霞，朱坤丹，何佳佳，等.GC-MS法测定氯沙坦钾中痕量的 N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基二乙胺J.华西药学杂志，2022，37（4）：425-428.13 杨越莛，郑枫，蔡浒，等.LC-MS/MS法测定三甲基间苯三酚原料药中 N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基二乙胺J.中南药学，2022，20（2）：405-409.14 韦学明，丁文学，雷勇胜，等.GC-MS/MS法测定甲磺酸卡莫司他原料药中 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