MEHP对小鼠睾丸间质细胞DNA甲基化水平和细胞周期进程的影响.pdf

8期第 45 卷8 期2023 年 8 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University邻苯二甲酸酯类（phthalic acid esters，PAEs），又称为塑化剂，因其能够软化塑料、增加弹性，被广泛应用于合成橡胶、黏合剂、涂料等生产用品。以邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）为代表的塑化剂类物质在聚合物分子中以范德华力结合，导致其在高温等条件下易解离逸散，并主要通过口腔、皮肤、呼吸道和静脉途径进入人体1。在多器官系统中，DEHP 的毒性是由邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）介导产生的2。邻苯二甲酸酯及其代谢物可在男性精液中检测到，其中DEHP 和邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）及其代谢产物 MEHP、邻苯二甲酸单丁酯（MBP）是备孕男性精浆中主要的邻苯二甲酸酯类型，精液中邻苯二甲酸酯代谢物浓度对精液质量有不利影响3。目前，已有研究4-5从表观遗传学的角度来探讨 PAEs 类物质的生殖毒性机制，在MEHP 致小鼠睾丸间质细胞（TM-3）雄性生殖损伤方面，对 DNA 甲基化水平的研究还较少。本研究拟以 TM-3 为受试细胞，检测 MEHP 染毒对TM-3 细胞 DNMT1、DNMT3B、转录因子 FOXO1、细胞周期蛋白依赖性激酶 2（CDK2）、细胞周期抑制因子 P27 mRNA 表达改变的影响，探讨 MEHP对 TM-3 细胞 DNA 甲基化水平和周期进程的影文章编号：1674-6309（2023）08-0757-07论著收稿日期：2021-03-17基金项目：宁夏医科大学校级科研基金项目（2020008）；宁夏医科大学自治区级大学生创新创业训练计划项目（S202010752041）；宁夏自然科学基金项目（2021AAC03163）作者简介：翁晓梦（1994），女，硕士，研究方向为劳动卫生与环境卫生学。通信作者：李玲（1971），女，教授，从事环境有害因素与健康研究。MEHP 对小鼠睾丸间质细胞 DNA 甲基化水平和细胞周期进程的影响翁晓梦1，2，李玲1，2，宋贝贝1，2，黄金瑞1，2，德小明1，2，李丽萍1，2，张亚娟1，2，张鹏举1，2（1.宁夏医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学系，银川750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨邻苯二甲酸单（2-乙基已基）酯（MEHP）对小鼠睾丸间质细胞（TM-3）DNA 甲基化水平和周期进程的影响。方法体外培养 TM-3 细胞，MEHP 按照 0、200、400、800 滋mol L-1共 4 个梯度进行分组，待其长到对数生长期，染毒 24 h 后处理细胞；采用 Western blot 检测 DNMT1、DNMT3B 两种甲基化转移酶（DN原MTs）和转录因子 FOXO1 蛋白表达水平，流式细胞术检测细胞周期进程，RT-qPCR 技术检测细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK2、细胞周期抑制因子 P27 mRNA 表达水平；给予 TM-3 细胞不同浓度的甲基化抑制剂 5-氮杂脱氧胞苷（5-Aza-Cdr）溶液（0、10-4、10-3、10-2、10-1、10 滋mol L-1）处理，采用 CCK-8 法检测细胞存活率，确定干预组染毒剂量；设置对照组（0 滋mol L-1）、400 滋molL-1MEHP 染毒组、MEHP（400 滋molL-1）+5-Aza-Cdr（10-4滋mol L-1）干预组，采用 CCK-8 法、Western blot、流式细胞术、RT-qPCR 法检测各项实验指标。结果Western blot 结果显示，与 0 滋mol L-1组相比，400、800 滋mol L-1MEHP 染毒组 DNMT1 蛋白表达水平降低，DNMT3B 蛋白表达水平升高（P 均0.01）；200、400、800 滋mol L-1组 FOXO1 蛋白表达水平均升高（P 均0.01）。流式细胞术结果显示，MEHP 染毒导致细胞增殖受阻。RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，随着染毒剂量的增加，P27 mRNA 表达水平升高，CDK2 mRNA 表达水平降低（P 均0.05）；抑制剂干预后 Western blot 结果显示，与 400 滋mol L-1MEHP 染毒组相比，MEHP+5-Aza-Cdr 干预组 DNMT1、DNMT3B 蛋白表达水平降低，FOXO1蛋白表达水平升高（P 均0.05）；RT-qPCR 结果显示，与 400 滋mol L-1MEHP 染毒组相比，MEHP+5-Aza-Cdr干预组 P27 mRNA 表达水平上升（P0.05）；流式细胞术结果显示，与对照组相比，400 滋mol L-1MEHP 染毒组、MEHP+5-Aza-Cdr 干预组细胞均阻滞在 G1 期（P均0.01）。结论MEHP 影响 TM-3 细胞正常分裂与增殖，与 DNMTs 相关蛋白表达水平改变、甲基化水平的异常修饰有关。关键词：邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯；DNA 甲基化；细胞周期中图分类号：R114文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.08.001757窑窑宁夏医科大学学报4缘卷响，以期为进一步阐明 DNA 甲基化水平在MEHP致 TM-3 细胞雄性生殖损伤中的作用提供研究思路和方向。1材料与方法1.1细胞株来源、主要仪器和试剂TM-3细胞（美国 ATCC 细胞研究中心）。HF90CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司），I510全波长酶标仪（赛默飞世尔公司），BioRad 荧光实时定量 PCR 仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司，柱形核酸纯化产品、PrimeScriptTMRTMaster Mix 反转录试剂盒、TB GreenRPremix ExTaqTM域实时荧光定量试剂盒 宝生物（大连）工程有限公司、目的基因及内参基因引物 生工生物工程（上海）股份有限公司、MEHP 标准品（纯度为 97%，美国 Sigma 公司），DMEM 培养基、胎牛血清（美国 Gibco 公司），DNMT1 抗体（美国 CellSignaling Technology 公司），全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），DNMT3B、FOXO1、茁-actin 抗体（美国 Proteintech 公司），其他试剂均为国产分析纯。MEHP 染毒液配制：用适量的无菌 DMSO 标准品稀释质量为 0.5 g 的 MEHP 标准品，配制成浓度为 1.80 mol L-1的 MEHP 染毒液，然后用无菌培养基稀释成浓度为 1 600 滋mol L-1的 MEHP 母液备用，实验前按梯度稀释成 200、400、800 滋mol L-1的染毒液。1.2TM-3 细胞培养复苏 TM-3 细胞，离心弃掉冻存液，加入新鲜配制的浓度为 10%的完全培养基，培养 48 h后换液；待细胞增殖至对数生长期，弃去旧培养基，加入 3 mL PBS 清洗，清洗结束后加入 1 mL胰酶消化 30 s，然后加入 4 mL 完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞，制成单细胞混悬液，将细胞混悬液分为两份置于两个新培养瓶中，最后加入2 mL 完全培养液定容至 4 mL，混匀，于 37 益、5%CO2、100%相对湿度培养箱中培养。1.3染毒浓度选择体外培养 TM-3 细胞，根据课题组前期研究成果，按照 0、200、400、800 滋mol L-1共 4 个梯度进行分组。采用 CCK-8 法检测细胞活力，取处于对数生长期的 TM-3 细胞，胰酶消化后加入完全培养基配成细胞混悬液，然后吸取 100 滋L 加入96 孔板（约 8 000 个/孔），置于 37 益、5%CO2细胞培养箱中培养 68 h。待细胞贴壁后弃去旧培养基并加入 5-Aza-Cdr 溶液（0、10-4、10-3、10-2、10-1、10 滋mol L-1），再将 96 孔板放置于 37 益、5%CO2、100%湿度的细胞培养箱中染毒 24 h。弃去染毒液并向各孔中加入 10 滋L 的 CCK-8 检测液，于37 益培养箱继续孵育 12 h，在酶标仪 450 nm波长下检测各孔光密度（OD）值并计算细胞活力，细胞活力（%）=（染毒组 OD-空白组OD）/（对照组 OD-空白组 OD）伊100%。确定最终的染毒浓度后，设置对照组（0 滋mol L-1）、400 滋mol L-1MEHP 染毒组和 MEHP（400 滋mol L-1）+5-Aza-Cdr（10-4滋mol L-1）干预组。1.4Western blot 检测相关蛋白表达水平TM-3 细胞经过 MEHP 染毒 24 h 后，弃去培养基，先用冷 PBS 洗涤 3 次，用刮匙刮下贴壁细胞并转移到 1.5 mL 离心管内，向每管加入 150300 滋L 细胞裂解液，于涡旋振荡器振荡 30 s，冰上放置 4 min，重复 5 次。离心机 12 000伊g、4 益离心 5 min 后取上清为全蛋白提取物；用 BCA 蛋白定量法检测蛋白浓度。加入适量的裂解缓冲液和 5伊上样缓冲液配制蛋白上样体系 20 滋L，100 益变性 510 min 后分装蛋白。根据蛋白分子质量并利用 SDS-PAGE 凝胶电泳技术跑胶，结束后转膜至孔径为 0.45 滋m 的 PVDF 膜上。用 5%脱脂奶粉封闭 2 h 后，加入 1颐1 000 稀释比例的一抗并于 4 益冰箱孵育过夜。用 PBST 洗膜 3 次后，加入 1颐2 000 稀释比例的二抗室温孵育 1 h，用 PB原ST 洗膜 3 次后经化学发光法曝光观察目的蛋白条带。以 茁-actin 为内参蛋白。结果采用 Image J软件定量分析条带灰度值。1.5RT-qPCR 检测细胞周期相关基因 mRNA表达水平用柱形核酸纯化试剂盒提取细胞总 RNA，然后根据反转录试剂盒说明书进行 cDNA 合成，以此为模板进行 PCR 扩增（引物序列见表 1），扩增条件：95 益、30 s，95 益、5 s，55 益、30 s，45 个循环。并以 95 益、10 s，65 益、5 s，95 益、5 s，测定熔解曲线，以 茁-肌动蛋白（茁-actin）为内参基因，目的基因的 mRNA 相对表达量用 2-驻驻Ct方法计算。表 1CDK2、P27、茁-actin 基因 RT-qPCR 引物序列引物名称引物序列（5-3）CDK2上游：CTGCCATTCTCACCGTGTCCTTC下游：GGCTCTTGCTAGTCCAAAGTCTGCP27上游：TCTCTTCGGCCCGGTCAAT下游：AAATTCCACTTGCGCTGACTC茁-actin上游：GGTCATCACTATTGGCAACG下游：ACGGATGTCAACGTCACACT758窑窑8期1.6流式细胞术检测细胞周期TM-3 细胞处理后，收集细胞，制备单细胞悬液，离心后去除上清，加入 500 滋L 70%冷乙醇固定细胞，4 益保存过夜；第 2 天用 PBS 洗去固定液，再加入 500 滋L 工作液，室温避光 3060 min，上机检测。1.7统计学方法采用 SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，每项实验均重复 3 次以上。计量资料以均数依标准差（x依s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验，检验水准琢=0.05。2结果2.1MEHP 毒性效应2.1.1相关蛋白表达水平与 0 滋mol L-1组（1.00依0.00）相比，400、800 滋mol L-1MEHP 染毒组 DNMT1 蛋白表达水平 （0.63依0.06）、（0.47依0.04）均降低（P 均0.01），DNMT3B 蛋白表达水平 （1.50依0.13）、（1.62依0.10）均升高（P 均0.01），200、400、800 滋mol L-1MEHP 染毒组 FOXO1 蛋白表达水平 （1.28依0.03）、（1.66依0.10）、（2.21依0.14）均升高（P 均0.01），见图 1。2.1.2细胞周期各时相分布情况与 0 滋mol L-1组相比，400 滋mol L-1组细胞在 G1 期分布比例增加，S 期分布比例降低，800 滋mol L-1组细胞在G1 期分布比例减少，S 期和 郧圆 期分布比例增加，MEHP 染毒导致 TM-3 细胞增殖受阻，见图 2和表 2。A.Western blot 检测蛋白条带图；B.蛋白相对表达量条形图；与 0 滋mol L-1组比较*P0.01。图 1不同浓度 MEHP 对 TM-3 细胞相关蛋白表达影响（24 h）图 2不同浓度 MEHP 处理 TM-3 细胞各周期时相分布情况（24 h）1 4001 2001 0008006004002000200 滋mol L-11 2001 00080060040020001 5001 0005000G1 期G2 期S 期800 滋mol L-1400 滋mol L-102004006008001 000FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）1 5001 000500002004006008001 000FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）0200400600800 10001200 1400FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）02004006008001 000FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）G1 期G2 期S 期G1 期G2 期S 期G1 期G2 期S 期0 滋mol L-1翁晓梦，等.MEHP 对小鼠睾丸间质细胞 DNA 甲基化水平和细胞周期进程的影响ABDNMT1DNMT3BFOXO1茁-actin200 kDa95 kDa82 kDa42 kDa02004008000200400800MEHP 浓度/（滋mol L-1）2.52.01.51.00.50.0DNMT1DNMT3BFOXO1*MEHP 浓度/（滋mol L-1）759窑窑宁夏医科大学学报4缘卷浓度/（滋mol L-1）OD 值存活率/%01.350.03100.000.0010-40.890.0299.386.9510-30.910.02*102.692.8710-20.800.01*85.262.63*10-10.780.05*82.904.85*100.690.06*68.226.24*F值133.5525.63P值0.010.01表 3CCK-8 法检测不同浓度 5-Aza-Cdr 染毒对TM-3 细胞存活率的影响（n=3，x依s）表 4CCK-8 法检测 5-Aza-Cdr 干预对 TM-3 细胞存活率的影响（n=3，x依s）组别OD 值存活率/%对照组0.780.01100.000.00400 滋mol L-1MEHP 染毒组0.420.00*41.902.07*MEHP+5-Aza-Cdr 干预组0.400.01*38.860.04*F值1 066.941 919.94P值0.010.012.1.3细胞周期相关基因表达水平与 0 滋mol L-1组（1.00依0.00）相比，200、400、800 滋mol L-1MEHP染毒组 P27 mRNA 表达水平 （3.14依0.09）、（3.46依0.05）、（8.94依0.15）升高，CDK2 mRNA 表达水平（0.65依0.10）、（0.49依0.03）、（0.42依0.06）降低（P均0.01），见图 3。0200400800MEHP 浓度/（滋mol L-1）1086420CDK2P27*与 0 滋mol L-1组比较*P0.05），故将 10-4滋mol L-1确定为干预组染毒剂量，见表 3。与对照组相比，400 滋mol L-1MEH孕 染毒组和 MEHP+5-Aza-Cdr干预组细胞存活率均下降（P均0.01），见表 4。2.2.2抑制剂干预后相关蛋白表达水平与400 滋mol L-1MEHP 染毒组（0.79依0.06）、（1.27依0.01）、（1.25依0.05）相比，MEHP+5-Aza-Cdr 干预组 DNMT1和 DNMT3B 蛋白表达水平 （0.67依0.05）、（0.49依0.02）降低，FOXO1 蛋白表达水平 （1.59依0.15）升高（P均0.05），见图 4。表 2不同浓度 MEHP 处理 24 h 后 TM-3 细胞各周期时相分布（n=3，x依s）MEHP 浓度/（滋mol L-1）G1 期S 期G2 期080.341.4017.241.402.420.0120080.361.0317.930.901.720.1340089.751.23*5.460.61*4.790.6280054.001.66*32.891.81*13.103.47*F值259.56157.5817.59P值0.010.010.01与 0 滋mol L-1组比较*P0.01。与 0 滋mol L-1组比较*P0.05，*P0.01。与对照组比较*P0.01。A.Western blot 检测蛋白条带图；B.蛋白相对表达条形图；与对照组比较*P0.05，*P0.01；与 400 滋mol L-1MEHP 染毒组比较aP0.05），见图 5、表 5。2.2.45-Aza-Cdr 干预后周期相关基因表达水平与 400 滋mol L-1MEHP 染毒组 （0.62依0.06）相比，MEHP+5-Aza-Cdr 干预组 P27 mRNA 表达水平 （0.84依0.13）升高（P0.05），见图 6。浓度/（滋mol L-1）*aCDK2P271.51.00.50.0与对照组比较*P0.01；与 400 滋mol L-1MEHP 染毒组比较aP 0.05。图 65-Aza-Cdr 干预细胞周期相关基因表达变化（24 h）3讨论DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化作用下，以 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，形成 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mc）的化学修饰过程6。MEHP 是否通过诱导细胞DNA 甲基化水平的改变，促进转录因子FOXO1 表达水平升高，进一步抑制细胞周期相关基因的表达水平，导致细胞周期阻滞，影响 TM-3 细胞的正常分裂和增殖，目前尚不清楚。在不改变 DNA 分子一级结构的情况下，DNA 甲基化通过化学修饰的方式来调节基因组的功能。已知哺乳动物体内共有 5 种 DNMTs 家族 成 员：DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L。其中 DNMT1 是维持甲基化酶，DNMT3B是重新甲基化酶，两者共同调控基因组的甲基化水平。DNMT1、DNMT3B 除了能识别 5-mc 的生物功能外，还参与了基因组中 5-mc 的维持和产生机制7。本研究发现，MEHP 染毒能够诱导 TM-3细胞 DNMTs 表达的改变，导致异常的甲基化修饰。在 MEHP 对人前列腺癌 LNCaP 细胞的影响的研究8中发现，MEHP 可能会通过影响整体DNA甲基化水平而改变前列腺癌的进展情况；刘特等9用 RT-qPCR 方法从体外分离的精子样本中检测到 DNMT1、DNMT3B mRNA 的表达，推测在精子样本中可能存在基因甲基化修饰现象，这与本研究结果类似。本研究还发现，与 0 滋mol L-1组相比，400、800 滋mol L-1组 DNMT1 蛋白表达水平降低，DNMT3B 蛋白表达水平升高，两种甲基化转移酶的表达水平并不一致。Li 等10研究发现，DBP 通过诱导 PTEN/Akt 通路产生表观遗传学水平的改变，在其致小鼠精原细胞生殖损伤过程中发现，与对照组相比，DNMT1 蛋白的表达未发生明显图 55-Aza-Cdr 干预各组细胞周期时相分布图（24 h）表 55-Aza-Cdr 干预各组细胞周期时相分布情况（24 h）组别G1 期S 期G2 期对照组81.782.6816.162.122.060.61400 滋mol L-1MEHP 染毒组90.331.33*5.080.79*4.590.56*MEHP+5-Aza-Cdr 干预组89.312.50*6.793.04*3.901.25*F值12.95022.3106.834P值0.010.010.05与对照组比较*P0.01。400 滋mol L-1MEHP 染毒组MEHP+5-Aza-Cdr 干预组1 4001 2001 00080060040020001 5001 000500002004006008001 000FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）02004006008001 000FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）02004006008001 000FL-2 Propidium lodide-A（伊1 000）1 5001 0005000G1 期G2 期S 期G1 期G2 期S 期G1 期G2 期S 期对照组翁晓梦，等.MEHP 对小鼠睾丸间质细胞 DNA 甲基化水平和细胞周期进程的影响761窑窑宁夏医科大学学报4缘卷改变，DNMT3B 蛋白表达水平下降；在对非甾体类雌激素己烯雌酚致生殖损伤中 DNA 甲基化作用的研究11表明，3 种 DNMTs 蛋白和 mRNA 表达水平并不相同；DNMTs 的异常表达说明 MEHP可诱导 TM-3 细胞发生异常的甲基化修饰现象，DNA 低甲基化会促进基因的高表达，DNA 高甲基化会抑制基因表达。表观遗传学可以通过影响细胞周期关键性调控因素来调控细胞的周期进程，但有关 DNA甲基化与许多细胞周期关键性调控因素之间的具体作用机制仍未被完全阐明12。DNMT1 作为唯一维持甲基化状态的关键酶，在 G1/S 期主要通过 DNA 复制位点来维护新合成链的 DNA 甲基化状态，在 G2、M 期则主要通过与染色质结合来维持已建立的甲基化模式13。DNMT1 在雄性配子形成过程中，DNA 甲基化模式起着重要作用，DNMT1 在粗线期精母细胞表达下调而在复制后细线期/偶线期精母细胞表达上调，说明 DNMT1在雄性生殖细胞发育减数分裂期发挥着重要作用14-15。小鼠精原干细胞需要转录因子 FOXO1维持和启动精子的发生16。马林等17的研究发现，FOXO 信号通路可能参与 miR-203-3p 的调控，在双酚 A 诱导 TM-3 细胞生殖损伤过程中发挥作用。本研究发现，MEHP 能够诱导 TM-3 细胞DNA 甲基化水平发生异常改变，影响转录因子FOXO1、G1/S 期负性调控因子 P27 mRNA、正向调控因子 CDK2 mRNA 的正常表达；加入甲基化抑制剂后，细胞总甲基化水平降低，促进了转录因子 FOXO1 和 P27 的表达，导致细胞未能进入DNA 合成期，影响细胞的正常分裂和增殖。张洪开等18研究表明，在对 PI3K 和 MAPK 信号通路的研究中发现，FOXO1 能促进 A549 细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡。Ward 等19研究发现，叉头转录因子 FOXO 家族是 PI3K/Akt 通路的下游靶点，参与细胞周期和细胞凋亡的调控；韩彦渊等20研究表明，高糖能够诱导 茁 细胞 FOXO1 蛋白表达，促进细胞周期抑制因子 P27 蛋白的表达，细胞 G1/G0 期比率升高，导致细胞周期阻滞，增殖能力降低；这与本研究结果相互印证。针对 DNA甲基化水平如何在 FOXO1 调控细胞周期进程中发挥作用的问题，其具体的发生机制还需要进一步探究。综上所述，MEHP 染毒能够诱导 TM-3 细胞DNMTs 表达水平改变，引起 DNA 甲基化异常修饰，影响转录调控因子的表达，进一步阻滞细胞周期相关基因的表达，影响细胞正常分裂与增殖。但在 DNA 甲基化水平和细胞周期相关性探讨方面，未设置下调基因实验来反向验证甲基化水平和周期分布的关系。因此，在后续的实验中，会进一步完善相关设计，更深入地探讨 DNA 甲基化在 MEHP 诱导 TM-3 细胞周期阻滞中的调控作用，为后续的靶向研究提供理论基础。参考文献：1 马林，马明月.邻苯二甲酸酯类对生殖毒性的影响及其机制的研究进展 J.沈阳医学院学报，2017，19（4）：359-363.2 Tetz LM，Cheng AA，Korte CS，et al.Mono-2-ethyl原hexyl phthalate induces oxidative stress responses inhuman placental cells in vitro J.Toxicol Appl Phar原macol，2013，268（1）：47-54.3 Koch HM，Bolt HM，Preuss R，et al.New metabolitesof di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）in human urineand serum after single oral doses of deuterium-la原belled DEHP J.Arch Toxicol，2005，79（7）：367-376.4 李玉秋，段志文，裴秀丛，等.DEHP、MEHP 对小鼠胚胎干细胞细胞毒性的研究 J.实用药物与临床，2016，19（8）：925-928.5 Zama AM，Uzumcu M.Epigenetic effects of endocrine-disrupting chemicals on female reproduction：粤n ovar原ian perspective J.Front Neuroendocrinol，2010，31（4）：420-439.6 董锁花，王芳，包金风.DNA 甲基化对细胞周期的调控 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Yajuan1，2，ZHANG Pengju1，2（1.Department of Occupational Hygiene and Environmental Hygiene，School of Public Health，Ningxia MedicalUniversity，Yinchuan750004，China；2.Ningxia Key Laboratory of Environmental Factors and ChronicDisease Control，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of phthalic acid mono-2-ethylhexyl ester（MEHP）on DNAmethylation level and cycle progression of mouse Leydig cells（TM-3）.MethodsTM-3 cells were cultured invitro，MEHP was grouped according to the four gradients of 0，200，400 and 800 滋mol L-1.When the cells grewto the logarithmic growth phase，they were treated after 24 h of exposure.Western blot was used to detect theexpression levels of DNMT1 and DNMT3B methylation transferases（DNMTs）and transcription factor FOXO1.Cell cycle progression was detected by flow cytometry；RT-qPCR was used to detect the mRNA expression ofcyclin-dependent kinase CDK2 and cell cycle inhibitor P27.Treatment of TM-3 cells with different concen-trations of 5-Aza-Cdr solution（0，10-4，10-3，10-2，10-1，10 滋mol L-1）at different concentrations of TM-3 cells，Cell viability was determined by the CCK-8 assay，the toxic dose of the intervention group was determined；The control group（0 滋molL-1），400 滋mol L-1MEHP infected group，MEHP（400 滋molL-1）+5-Aza-Cdr（10-4滋mol L-1）intervention group were set.These experimental indexes were measured by CCK-8，West-ern blot，flow cytometry，and RT-qPCR.ResultsThe results of Western blot showed that compared with the0 滋mol L-1group，the expression of DNMT1 protein in 400 and 800 滋molL-1groups decreased，but the ex-pression level of DNMT3B protein increased（P all0.01）.200，400 and 800 滋mol L-1groups FOXO1 proteinexpression level increased（P all0.01）.The flow cytometry results showed that MEHP infection caused cellproliferation blocked.The results of RT-qPCR showed that compared with the control group，with the increaseof exposure doses，the expression levels of P27 mRNA increased，and the expression level of CDK2 mRNAdecreased（P all0.05）.After inhibitor intervention，the Western blot results showed that compared with400 滋mol L-1MEHP exposure group，the protein expression levels of DNMT1 and DNMT3B in MEHP+5-Aza-Cdr intervention group decreased，and the protein expression level of FOXO1 increased（P all0.05），andRT-qPCR results showed that compared with the 400 滋molL-1MEHP exposure group，the expression lev-el of P27 mRNA in the MEHP+5-Aza-Cdr intervention group was increased（P0.05）.The flow cytometry re-sults showed that compared with the control group，the cells in the 400 滋mol L-1MEHP exposure group andMEHP+5-Aza-Cdr intervention group were arrested in G1 stage（P all0.01）.ConclusionMEHP can affectTM-3 cell division and proliferation which related to the change of DNMTs-related protein expression level andabnormal modification of total methylation level.Key words：phthalic acid mono-2-ethylhexyl ester；DNA methylation；cell cycle14 Jue K，Bestor TH，Trasler JM.Regulated synthesis andlocalization of DNA methyltransferase during Sper原matogenesis1 J.Biol Reprod，1995，53（3）：561-569.15 Mertineit C，Yoder JA，Taketo T，et al.Sex-specificexons control DNA methyltransferase in mammaliangerm cells J.Development，1998，125（5）：889-897.16 Goertz MJ，Wu ZR，Gallardo TD，et al.Foxo1 is re原quired in mouse spermatogonial stem