HPLC法测定甘草养生酒中甘草酸含量的研究.pdf

Food and Fermentation Science&Food and Fermentation Science&TechnologyTechnology收稿日期：2023-01-15基金项目：四川省科技项目（2021ZYD0102）作者简介：王丹（1989-），女，硕士，工程师，二级品酒师。研究方向：健康养生酒研究。*通信作者：刘小刚（1983-），男，博士，高级工程师，一级品酒师。研究方向：酿酒及健康养生酒研究。引用格式：王丹，吴小娟，吉喆，等.HPLC法测定甘草养生酒中甘草酸含量的研究 J.食品与发酵科技，2023，59（5）：125-129+147.HPLC法测定甘草养生酒中甘草酸含量的研究王丹1，3，吴小娟2，吉喆1，3，兰余1，3，吴卫宇2，匡立华1，3，周成坪1，3，罗爽2，杨洁1，3，刘小刚1，3*（1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；2.四川国检检测有限责任公司，四川泸州 646000；3.泸州老窖养生酒业有限责任公司，四川泸州 646000）摘要：建立了甘草养生酒中甘草酸的高效液相色谱测定方法。不同甘草酸含量的养生酒样品经适当稀释或100水浴去除乙醇，定容后，以乙腈0.05%磷酸水溶液为流动相，Athena C18-WP水相柱（4.6mm250mm，5m）分离的高效液相色谱法测定甘草酸含量。结果显示：该方法在2.0400mg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9994，线性方程为y5.3538x6.0226，方法检出限、定量限分别为0.50mg/kg、1.50mg/kg；仪器精密度良好，RSD 为 0.34%（n6）；甘草养生酒中 4 个加标水平下的回收率范围为 90.3%104.8%（n6），相对标准偏差为1.748%5.117%。该方法灵敏度高、分析时间短、稳定性好、准确可靠，是测定甘草养生酒中甘草酸含量的有效方法。关键词：高效液相色谱法；甘草酸；甘草养生酒中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：1674-506X（2023）05-0125-0006Determination Glycyrrhizic Acid Content in GlycyrrhizaHealthy Liquor by HPLCWANG Dan1，3，WU Xiaojuan2，JI Zhe1，3，LAN Yu1，3，WU Weiyu2，KUANG Lihua1，3，ZHOU Chengping1，3，LUO Shuang2，YANG Jie1，3，LIU Xiaogang1，3*（1.Luzhou Laojiao Co.，Ltd.，Luzhou Sichuan 646000，China；2.Sichuan Guojian Inspection Co.，Ltd.，Luzhou Sichuan 646000，China；3.Luzhou Laojiao Health Liquor Co.，Ltd.，Luzhou Sichuan 646000，China）Abstract：To establish a HPLC method for the detection of glycyrrhizic acid content in glycyrrhiza healthyliquor.In the method，the experimental samples with different concentration levels of glycyrrhizic acid weremeasured after appropriate dilution or water bath at 100 proposed to remove ethanol and dissolved withmethanol.The analysts were separated on an Athena C18-WP column（4.6 mm250 mm，5 m）by gradientelution with mixtures of acetonitrile 0.05%phosphoric acid solution.The results showed that the method had agood linear relationship in the range of 2.0400 mg/L，with the correlation coefficient of 0.999 4（y5.353 8x6.022 6）.The limit of detection and limit of quantification were 0.50 mg/kg and 1.50 mg/kg.The instrument hada good precision，The RSD value of the peak areas was 0.34%（n6）.The recoveries of four spiking levelsranged from 90.3%to 104.8%（n6）.The RSD values of glycyrrhizic acid content ranged from 1.748%to 5.117%.The method has advantages such as high sensitivity，short analysis time，good stability and the results wereaccurate and reliable.It can be used to determine the content of glycyrrhizic acid in glycyrrhiza healthy liquor.Keywords：HPLC；glycyrrhizic acid；glycyrrhiza healthy liquordoi：10.3969/j.issn.1674-506X.2023.05-022王丹等：HPLC法测定甘草养生酒中甘草酸含量的研究2023年第5期甘草酸是豆科植物甘草中的一种三萜皂苷类化合物，也在中国药典中被列为甘草的质量控制指标之一 1-2，甘草酸具有抗炎、抗癌、抗过敏、抗氧化、抗乙型肝炎病毒、增强免疫并改善肝功能等作用3-4。随着生物医药技术的不断进步，甘草被广泛应用于食品、药品等多个领域。其中，甘草养生酒是以传统白酒为酒基，以甘草为主要原料，辅以其他可食用或药食两用的原料，经现代萃取技术将食药材中的风味、活性等成分融入酒体中，形成在风味、口感上区别于传统白酒的健康养生酒，备受消费者喜爱。目前，对于甘草原料及各类含甘草酸的制品中甘草酸的检测已有相关研究，如：紫外可见分光光度法、超快速液相色谱、电化学法、高效毛细管电泳法、近红外光谱法、高效液相色谱-串联质谱法等分析方法5-13，其中尤以高效液相色谱法应用较多且效果较好，但针对高效液相色谱法在酒类基质中甘草酸含量的检测研究上，未见有从样品前处理方法到色谱检测条件的全面系统的优化分析。考虑到酒体中乙醇及其他食药材成分可能会对甘草酸的检测造成干扰，影响稳定性及准确度，本文主要探讨甘草养生酒中甘草酸含量测定的高效液相色谱检测法，优化并建立包括样品前处理方法在内的相关检测参数，以期为养生酒甘草酸含量检测提供快速简便、专属性强、准确度及灵敏度高的测定方法。1材料与方法1.1材料与试剂甘草酸含量100 mg/kg的甘草养生酒样品（酒样A）、甘草酸含量100 mg/kg的甘草养生酒样品（酒样B）、甘草养生酒样品（样品1#和样品2#），泸州老窖养生酒业有限责任公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；甘草酸标准品（纯度99%），成都曼斯特生物科技有限公司；试验用水符合GB/T 66822008中一级水的规定；其他试剂均为国产分析纯。1.2仪器与设备LC 1260 II 高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司；Athena C18-WP液相色谱柱（4.6 mm250 mm，5m）、有机相针式滤器（尼龙，13mm0.45m），上海安谱实验科技股份有限公司；Milli-Q integral 3纯水/超纯水一体化智能系统，美国Millipore公司；BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器；HH-S恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；OA-SYS 氮吹仪，美国Organomation 公司；BD-328WL立式冷藏冷冻转换柜，中国海尔集团。1.3试验方法1.3.1色谱检测条件色谱柱：Athena C18-WP水相柱（4.6mm250mm，5 m）；流速：1.0 mL/min；柱温：35；检测波长：237nm，进样量：10L；流动相：乙腈（A）0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表1。1.3.2甘草酸标准溶液的制备甘草酸标准储备液配制：精密称取10.0mg甘草酸标准品用甲醇溶解并定容至10mL，混匀，得浓度为1.00mg/mL标准品储备液，于4保存备用。甘草酸标准系列工作液：用甲醇将甘草酸标准储备液稀释成浓度为2.0、5.0、10、50、100、200、300、400mg/L标准工作溶液。1.3.3样液制备方法直接稀释法：称取混匀试样2g（精确至0.0001g），直接用甲醇稀释成适当浓度，经0.45 m有机微孔滤膜过滤后，待高效液相色谱分析。100 水浴法：称取混匀试样 10 g（精确至0.0001g），100水浴去除乙醇后，加甲醇溶解转移至10 mL容量瓶，定容后摇匀，经0.45 m有机微孔滤膜过滤后，待高效液相色谱分析。60 氮吹法：称取混匀试样 10 g（精确至0.000 1 g），60 氮吹去除乙醇后，加甲醇溶解转移至10 mL容量瓶，定容后摇匀，经0.45 m有机微孔滤膜过滤后，待高效液相色谱分析。2结果与讨论2.1流动相配比与洗脱方式选择选择不同流动相进行系统适用性比较，分别比较两种流动相下，即甲醇0.02 mol/L乙酸铵水溶液（含0.2%乙酸）和乙腈0.05%磷酸水溶液下的出峰情况。结果发现，采用甲醇0.02mol/L乙酸铵水溶液（含0.2%乙酸）（65 35）时，目标峰与杂峰分不开，尝试把流动相比例从65 35调整至55 45，调整后色谱图显示出峰时间22min左右，目标峰前拖尾严重；采用乙腈0.05%磷酸水溶液体系，按照药典一部甘草2含量测定下的流动相乙腈0.05%磷酸水溶液体系梯度洗脱，出峰时间32 min左右，采集时间较长。为提高检测效率，在满足分离要求的前提下，对流动相洗脱方法进行调整优化，确定的洗脱程序见表1，采集时间缩短为30 min且梯度洗脱效果较好，该条件下甘草酸标准品的色谱图见图1。126第59卷（总第237期）王丹等：HPLC法测定甘草养生酒中甘草酸含量的研究2.2样品前处理方法的选择分别采用直接稀释法、100水浴法、60氮吹法三种方法对以甘草为主要原料的养生酒样品进行前处理，通过分析比较检测结果（见图2），考察不同甘草酸浓度水平的养生酒样品中乙醇对检测甘草酸含量的影响。图2酒样在不同前处理方法下的甘草酸含量Fig.2Glycyrrhizic acid content of wine samplesunder different pretreatment methods020406080100120140160180甘草酸含量/（mg/kg）直接稀释法100水浴法60氮吹法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一酒样A酒样B一一一一一一一一结果表明，针对甘草酸含量100 mg/kg 的酒样B，直接稀释法和60氮吹法处理后测得的甘草酸含量相差不大，而100 水浴法较其他两种前处理法下测得的甘草酸含量明显偏低，考虑主要是由于样品经 100 水浴挥发至近干，再加入甲醇产生了超声难溶解的絮状沉淀，致使 100 水浴处理后的甘草酸含量偏低，综合考虑60氮吹法检测时间成本较高且直接稀释后进样乙醇对甘草酸含量的影响可忽略，因此选择直接稀释法作为较适宜的前处理方法。针对甘草酸含量100 mg/kg的酒样A，60 氮吹法和100水浴法去除乙醇后再用甲醇定容测得的甘草酸含量与直接稀释法测得的甘草酸含量相差不大；将直接稀释法与60氮吹法、100水浴法处理后的样品色谱图（见图3）对比，发现仅直接稀释法处理后的样品色谱图在其保留时间8min左右有较明显杂峰，综合考虑到当色谱柱柱效下降后，直接稀释法处理后样品色谱峰峰形会变差的情况，在后续试验选择去除乙醇的方法处理酒样；同时采用加标回收试验进一步考察两种去除乙醇的前处理方法（60氮吹法和100水浴法）对甘草酸热稳定性的影响，由表2检测结果可知，酒样在10mg/kg加标水平下，样品中甘草酸的平均回收率均较高，超过90%，表明甘草酸热稳定性良好，综合比较回收率结果，选择100水浴法处理甘草酸含量（100mg/kg）相对较低的养生酒样品。图3酒样A在不同前处理方法下的色谱图Fig.3HPLC chromatogram of wine sampleA by different pretreatment methods051015202530时间/min100102030405060708090响应值/mAU（1）60氮吹法（2）100水浴法（3）直接稀释法甘草酸甘草酸甘草酸表2酒样（甘草酸含量100mg/kg）在不同前处理方法时的加标回收结果Tab.2The results of spiked recoveries testing bydifferent pretreatment method for liquors（glycyrrhizic acid content 100mg/kg）酒样前处理方法100水浴法60氮吹法甘草酸含量测定平均值/（mg/kg）20.20020.965平均回收率/%94.86192.4222.3方法适应性考察分别称取养生酒阴性空白样品及其加标样，按照“1.3.3”项下的“100 水浴法”制备供试样品和“1.3.1”项下的色谱条件进行检测（见图4），比较两色谱图目标峰保留时间，发现阴性空白样品在色谱表1梯度洗脱程序Tab.1Elution condition for separation of glycyrrhizic acid时间/min0520252630乙腈（A）/%19195010019190.05%磷酸水溶液（B）/%81815008181图1甘草酸标准溶液色谱图Fig.1Chromatogram of glycyrrhizic acid standard solution甘草酸051015202530时间/min020406080响应值/mAU1272023年第5期图中甘草酸目标峰位置无干扰峰存在，方法专属性强，适应性良好。2.4检出限、定量限和线性关系在养生酒阴性空白样品中加入不同浓度梯度的甘草酸标液，对6份加标量为0.5 mg/kg的样品按照“1.3.3”项下的“100水浴法”制备供试样品并上机检测，发现6次加标测定的信噪比均大于3，当继续减少加标量时信噪比均小于3，按照信噪比S/N3和S/N10确定方法检出限为0.50 mg/kg，定量限为1.50mg/kg。取“1.3.2”项下的甘草酸标准系列工作液，在优化后的色谱条件上机检测，以甘草酸质量浓度（mg/L）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得出甘草酸浓度在2.0400 mg/L范围内时，峰面积y与质量浓度x呈良好线性关系（y5.3538x6.0226，R20.9994）。2.5精密度试验精密吸取同一酒样，按照“1.3.3”项下的“直接稀释法”制备供试样品，重复进样测定6次，计算峰面积（n6）的RSD，结果见表3。由表3可知，6次测定的保留时间和峰面积相对标准偏差均较小，表明仪器精密度良好。2.6重复性试验取两个不同甘草酸浓度水平的养生酒样品（即样品1#和样品2#）进行重复性试验，每个样品分别平行称取6份，样品1#、2#分别按照“1.3.3”项下的“直接稀释法”“100 水浴法”制备供试样品溶液，上机测定。由表4可知，测定结果相对标准偏差分别为0.54%、4.40%，方法重复性良好。2.7加标回收率试验精密称取10g（精确至0.0001g）养生酒阴性空白样品，按照3.0、10、30mg/kg三个浓度水平添加甘草酸标准溶液，采用“1.3.3”项下的“100 水浴法”制备供试样品后进样检测；精密称取 2 g（精确至0.0001g）养生酒阴性空白样品，按照200mg/kg浓度表36次平行测定的峰面积Tab.3Peak area of 6 parallel determinations峰面积/（mAU*s）1197.7572197.9783197.2634198.7635198.9436198.755RSD/%0.34表4重复性试验结果（n6）Tab.4The results of repeatability testing（n6）样品1#2#样品测定值/（mg/kg）13052.98912.30823059.36011.60133028.92811.27143055.99311.69353080.70112.72963059.04912.122平均值/（mg/kg）3056.1711.95RSD/%0.544.40图4甘草酸HPLC色谱图Fig.4HPLC chromatogram of glycyrrhizic acid005101520响应值/mAU51015202530时间/mina005101520响应值/mAU51015202530时间/minb甘草酸注：a.阴性空白样品；b.阴性空白加标样品。图5甘草酸标准曲线Fig.5The standard curve of glycyrrhizic acid0250500750100012501500175020002250峰面积/（mAU*s）0.0100.0200.0300.0400.0甘草酸浓度/（mg/L）128第59卷（总第237期）王丹等：HPLC法测定甘草养生酒中甘草酸含量的研究水平添加甘草酸标准溶液，采用“1.3.3”项下的“直接稀释法”制备供试样品后进样检测。加标回收试验结果见表5。由表5可知，养生酒中甘草酸含量的检测方法回收率良好且较稳定，符合GB/T 274042008附录F中对回收率的要求。2.8稳定性试验取经“1.3.3”项下的“直接稀释法”制备的同一养生酒供试样品溶液，分别在0、2、4、8、24、48 h上机测定，测得其甘草酸峰面积见表6。在48 h内测得的响应峰面积相对标准偏差小于 10%，表明样品溶液置于室温下48 h内测定仍能满足检测精密度要求。3结论本研究优化了高效液相色谱条件，筛选了适用于不同甘草酸浓度水平的养生酒样品前处理方法，建立了高效、适用的HPLC方法测定养生酒中甘草酸含量。该方法在 2.0400 mg/L 浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9994，线性方程y5.3538x6.0226，方法检出限、定量限分别为0.50 mg/kg、1.50 mg/kg；仪器精密度较好，响应峰面积的相对标准偏差为0.34%；方法重复性较好，两个不同甘草酸浓度的养生酒样品6次平行试验测定结果分别为3056.17mg/kg、11.95mg/kg，相对标准偏差分别为 0.54%、4.40%；养生酒样品在加标浓度为3.0、10、30、200mg/kg四个水平下，回收率范围分别为92.8%104.8%、90.9%101.6%、90.3%100.1%、100.0%104.7%，满足相关标准要求，该方法操作简单，具有检测灵敏度高、分析时间短、稳定性好、准确可靠的特点，是检测养生酒中甘草酸含量的有效方法。表6稳定性试验结果（n6）Tab.6The results of stability testing（n6）时间/h峰面积/（mAU*s）0437.1322437.6114436.5268440.28324433.36848437.668相对标准偏差/%0.51表5样品在不同加标浓度下的回收率（n6）Tab.5The recovery rate of glycyrrhizic acid at different spiking concentrations（n6）加标浓度/（mg/kg）3.010甘草酸含量/（mg/kg）2.7852.8322.9593.1433.0692.8029.1709.0929.4739.43010.1559.107回收率/%92.894.498.6104.8102.393.491.790.994.794.3101.691.1相对标准偏差/%5.1174.279加标浓度/（mg/kg）30200甘草酸含量/（mg/kg）27.61427.10727.09128.34428.78230.023199.985201.820201.000200.325209.350204.105回收率/%92.090.490.394.595.9100.1100.0100.9100.5100.2104.7102.1相对标准偏差/%4.0301.748（下转第147页）129第59卷（总第237期）王冰清等：植物油脂中苯并（a）芘含量检测方法研究5 曹梦思，王君，张立实，等.食品中多环芳烃的研究现状 J.卫生研究，2015，44（1）：151-157.6 黄超群，付馨慰，楼成杰，等.植物油中苯并（）芘残留标准样品的研制 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