3株乳酸菌复合发酵制备的后生元对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制.pdf

兰冬雪，瞿茜楠，于浩东，等.3 株乳酸菌复合发酵制备的后生元对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制 J.食品工业科技，2023，44（21）：154161.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023020029LANDongxue,QUXinan,YUHaodong,etal.StudyonAntibacterialActivityandMechanismofActionofaPostbioticPreparedbyCo-fermentingThreeLacticAcidBacteriaagainstMethicillin-resistantStaphylococcus aureusJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(21):154161.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023020029 生物工程 3 株乳酸菌复合发酵制备的后生元对耐甲氧西株乳酸菌复合发酵制备的后生元对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制林金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制兰冬雪1,2,3，瞿茜楠1,2,3，于浩东1,2,3，黄天3，彭传涛1,2，姚国强3，赵金山1,2，李兆杰1,2,3,*（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109；2.青岛特种食品研究院，山东青岛266109；3.内蒙古农业大学，乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）摘要：为制备一种对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有较好抑菌活性的后生元，研究其抑菌作用及抑菌机制，通过乳酸乳球菌乳亚种 Postbio-F3、副干酪乳酪杆菌 Postbio-P6、发酵粘液乳杆菌 Postbio-Q7 复合发酵，制备对 MRSA 具有较好抑菌活性的后生元（命名 YDFF），通过抑菌圈法和生长曲线评估 YDFF 对 MRSA 的抑菌活性，并对抑菌活性成分进行初步鉴定；通过测定 YDFF 对 MRSA 生物膜的影响、菌体超微结构变化、DNA 泄漏以及 ROS 产生初步探究 YDFF 对 MRSA 的抑菌作用机制；采用棋盘法，研究 YDFF 对 MRSA 耐药性的影响。结果表明：后生元 YDFF 对 MRSA 具有较好抑菌活性，对 MRSA 的抑菌圈直径为 19.11.5mm，且该活性具有较好的 pH 耐受范围（pH3.09.0）；YDFF 中的胞外多糖无抑菌活性，蛋白酶 K 可以使 YDFF 抑菌活性完全失活，说明 YDFF 中的抑菌活性物质主要为蛋白类成分；YDFF 可以显著抑制生物膜的形成，破坏菌体完整性导致DNA 泄漏，并可引起细菌胞内 ROS 浓度升高；YDFF 与甲氧西林联合使用时对 MRSA 的分级抑菌浓度指数（FICI）降低至 0.38，表明 YDFF 可以降低 MRSA 对甲氧西林的耐药性。后生元 YDFF 通过抑制生物膜形成、破坏细胞膜结构、提高胞内 ROS 发挥对 MRSA 的抑菌作用，且可以显著降低 MRSA 对抗生素的耐药性，为后生元在食品、医疗中使用提供理论依据。关键词：后生元，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，抑菌，抑菌机制，生物膜，耐药性本文网刊:中图分类号：TS252.1文献标识码：A文章编号：10020306（2023）21015408DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023020029StudyonAntibacterialActivityandMechanismofActionofaPostbioticPreparedbyCo-fermentingThreeLacticAcidBacteriaagainstMethicillin-resistantStaphylococcusaureusLANDongxue1,2,3，QUXinan1,2,3，YUHaodong1,2,3，HUANGTian3，PENGChuantao1,2，YAOGuoqiang3，ZHAOJinshan1,2，LIZhaojie1,2,3,*（1.CollegeofFoodScienceandEngineering,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China；2.QingdaoSpecialFoodResearchInstitute,Qingdao266109,China；3.KeyLaboratoryofDairyBiotechnologyandEngineering,MinistryofEducation,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China）Abstract：To prepare a postbiotic with good antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),andtostudyitsantibacterialeffectandactionmode,apostbioticnamedYDFFwaspreparedbyco-fermenting收稿日期：20230206基金项目：山东省自然科学基金面上项目（ZR2020MC217）；国家自然科学基金项目（32101917）。作者简介：兰冬雪（1997），女，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全，E-mail：。*通信作者：李兆杰（1981），男，博士，教授，研究方向：食品安全检测，E-mail：hunterlee_。第44卷第21期食品工业科技Vol.44No.212023年11月ScienceandTechnologyofFoodIndustryNov.2023Lactococcus lactissubspPostbio-F3,Lactobacillus paracaseiPostbio-P6andLactobacillus fermentansPostbio-Q7,itsantibacterialactivityagainstMRSAwasdeterminedbybothinhibitionzoneandgrowthcurve,andtheactiveingredientsexertingantibacterialactivitywerepreliminarilyidentified.TheantibacterialmechanismofYDFFonMRSAwasinves-tigatedbydetectingtheeffectsofYDFFonMRSAbiofilmformation,ultrastructuralchanges,DNAleakage,andROSgeneration.Furthermore,theeffectofYDFFontheantibioticresistanceofMRSAtomethicillinwasexploredbyches-sboardmethod.TheresultsshowedthatthepostbioticYDFFhadgoodantibacterialactivityagainstMRSA(Thediameterof inhibition zone was 19.11.5 mm)with wide pH tolerance range(pH3.09.0).The extracellular polysaccharidesextractedfromYDFFhadnoantibacterialactivity,butproteaseKcouldcompletelyinactivateitsantibacterialactivity,indicatingthatthemainantibacterialactivesubstanceinYDFFwasprotein.ItwasdemonstratedthatYDFFexhibitedantibacterialactivitybyseveralwaysincludinginhibitingtheformationofbiofilms,destroyingthecellmembraneintegritywhichresultedintheleakageofDNA,andincreasingtheconcentrationofintracellularROS.Additionally,whenYDFFwasusedcombinedwithmethicillin,thefractionalinhibitoryconcentrationindex(FICI)wassignificantlydecreasedto0.38,indicatingYDFFcouldreducetheantibioticresistanceofMRSAtomethicillin.Takentogether,YDFFexhibitedgoodantibacterialactivityonMRSAbyinhibitingthebiofilmformation,destroyingmembranestructureandincreasingtheintracellularROS,andreducedtheantibioticresistancetomethicillin,whichwouldprovideatheoreticalbasisfortheuseofpostbioticsinfoodandmedicine.Key words：postbiotics；methicillin-resistant Staphylococcus aureus；antibacterial；antibacterial mechanism；biofilm；antibioticresistance根据国际益生菌和益生元科学协会（ISAPP）2021 年发布的后生元共识声明，后生元是指“对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂”1。后生元含有多种活性成分，包括肽聚糖、磷壁酸等菌体成分，以及维生素、有机酸、细菌素、短链脂肪酸、酶和氨基酸等活性代谢产物1。根据微生物的类型、菌株和代谢产物的不同，后生元的效果也不同2。使用后生元有助于改善健康，已有研究表明，后生元具有免疫调节、预防感染、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病、抗高血压、抗增殖、抗突变、抗肿瘤和减少食物过敏等作用35。后生元在宿主体内发挥预防和治疗双重作用，临床上使用后生元来缓解一系列疾病的症状，如婴儿绞痛、成人特应性皮炎和腹泻等。除具有多种功效外，后生元还具有多种优势：一是具有更高的安全性。后生元对一些特殊人群如新生儿、肠道手术人群以及一些敏感人群同样适应，而且后生元不受抗生素的干扰抑制，没有传递耐药基因风险；二是具有更高的稳定性。后生元可以耐受高温、氧气等环境，因此具有更长的保质期，运输储存也更方便；三是具有更广泛的作用靶点，不仅限于肠道，口腔、皮肤、泌尿生殖道或鼻咽等都可作为后生元的靶点，而且更易于被肠道吸收，提高利用率。后生元因其清晰的化学结构和安全剂量参数等，被认为是天然的免疫刺激剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗菌剂以及生长促进剂6。根据 ISAPP 对后生元的定义，后生元不是单一的或纯化的化合物，是由多种活性成分组成的混合物。因此后生元通常是作为一个整体进行研究和开发应用。尽管如此，对其活性成分的解析、作用机制的研究仍是后生元研究的一个重要方向，这将为后生元的进一步研究和产业化提供重要的理论和科学依据。以抑菌功能后生元为例，根据文献报道，后生元中发挥抑菌作用的成分有胞外多糖、细菌素、有机酸等，对单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌等常见的致病菌具有较好的抑菌效果78。李书鸿等9通过对植物乳杆菌代谢产物的研究发现，其抑菌活性与植物乳杆菌菌株、病原指示菌及发酵碳源相关，且受上清液低 pH 的影响，其中主要的抑菌物质有机酸。研究发现由鼠李糖乳杆菌 L.1.0320 中纯化出细菌素 1.0320 在靶细胞细胞膜上形成孔洞，增加细胞膜通透性，增加质子动力势 PMF（protonmotiveforce）的耗散，破坏细胞膜的完整性，导致胞内内容物流出，诱导细菌死亡10。从微生物灭活方式来看，目前，制备后生元的方法通常有热处理、或紫外线照射、酶处理、超声处理、高压处理、溶剂萃取或它们的组合进行裂解等。大多数情况下，热处理是灭活益生菌菌体的常用方法，但作用时间和温度因微生物种类不同而不同，还取决于微生物自身的耐热性11。此外，2 株或者多株菌共发酵时不同菌株间会存在互作关系，从而引起菌株代谢活动发生变化1213，这给特定功能后生元的制备提供了思路。近年来，抗生素耐药性的出现导致治疗失败的风险增加、复发和医疗保健系统成本增加14。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株是最常见的抗生素耐药菌之一，对大多数-内酰胺类抗生素具有耐药性，包括甲氧西林、青霉素、碳青霉烯类、头孢菌素类及其衍生物。由于其分布广泛且具有多重耐药性，已成为令人担忧的超级细菌1516。此外，MRSA还是一种常见的皮肤化脓感染致病菌，易通过接触传播形成流行传播，引起败血症、脓毒血症等疾病。MRSA 可形成具有保护作用的生物膜，阻挡抗菌剂，产生耐药性，使治疗效果变差。生物膜是附着在表面的微生物群落，它们由胞外聚合物基质的结构支持，第44卷第21期兰冬雪，等：3 株乳酸菌复合发酵制备的后生元对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制155该基质包含一种或多种胞外多糖、蛋白质和 DNA，在细菌感染的持续存在中起重要作用17。MRSA 生物膜的存在致使其致病性和耐药性增加，因此开发针对 MRSA 的绿色、不产生耐药性的天然抗菌制剂成为解决 MRSA 致病性及耐药性的关键。因此，本研究拟通过多株益生菌复合发酵，制备一种对 MRSA 具有抑菌活性的后生元，研究其对MRSA 的抑菌活性及对 MRSA 生物膜的影响，并探究其抑菌作用机制，为后生元在食品、医疗中使用提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器乳酸乳球菌乳亚种 Postbio-F3、副干酪乳酪杆菌 Postbio-P6、发酵粘液乳杆菌 Postbio-Q7来自青岛农业大学益生菌与后生元基础研究与开发应用创新实验室乳酸菌菌种库；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC43300美国模式培养物集存库；甲氧西林北京百奥莱博科技有限公司；LB 肉汤培养基、MRS 肉汤培养基、营养琼脂培养基（NA）青岛海博生物技术有限公司；活性氧检测试剂盒上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胃蛋白酶（酶活力3U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力 600U/mg）、蛋白酶K（酶活力 30U/mg）、胰蛋白酶（酶活力 10U/mg）、淀粉酶（酶活力 100U/mg）、脂肪酶（酶活力 350U/mg）TaKaRa 公司。SU5000 扫描电子显微镜株式会社日立制作所；TU-1810 型可见分光光度计普析通用公司；Cen-trifuge5810R 型冷冻离心机艾本德公司；CLC111E-CO 型恒温培养箱MMMMedcenterEinrichtungenGmbH公司；CMaxPlus 酶标仪美国 MD公司；SCIENTZ-WSQ 型全自动生长曲线分析仪宁波新芝生物科技股份有限公司；SupcreG10 型全自动菌落分析仪杭州迅数科技有限公司；BDFACSCali-bur 流式细胞仪美国 BD 公司。1.2实验方法1.2.1具有抑菌功能的后生元的制备参考文献 1819 报道方法并适当修改进行后生元的制备。将副干酪乳酪杆菌 Postbio-P6、发酵粘液乳杆菌Postbio-Q7、乳酸乳球菌乳亚种 Postbio-F3 按 2%接种量分别接种 MRS 液体培养基进行活化，培养条件为 37 好氧发酵 24h，pH 约 3.8。将活化培养物按 2%接种量分别接种 MRS 液体培养基进行二代培养，培养条件同上。将二代培养物分别按 3%、2%、3%接种量接种同一 MRS 液体培养基进行复合发酵，发酵条件为 37，好氧发酵 24h。发酵结束后首先进行镜检，通过菌落形态判断菌的增殖情况，然后将培养液于 121 高温高压灭菌 30min，通过菌落计数法确认是否完全灭活，将制备的后生元于20 保存备用。此外，通过测试 3 种菌不同接种量下的抑菌活性，筛选确定 3 种菌的最佳接种量。1.2.2抑菌实验1.2.2.1抑菌圈将 MRSA 接种到 LB 液体培养基中，37 培养 16h 活化备用。将最佳接种量条件下制备的后生元 8000r/min 离心 10min，分别收集上清液和沉淀（灭活菌体），上清液过 0.22m 滤膜，沉淀用等量无菌水重悬。采用抑菌圈法分别验证后生元的上清液、沉淀以及未经离心的混合液对 MRSA的抑菌活性。MRSA 用生理盐水稀释 107CFU/mL的菌液后，吸取 20L 菌液加入到 30mL 未凝固的LB 培养基（45 以下）中，充分混匀后倾注到培养皿中。待培养基凝固后，用打孔器在培养基上打直径为8mm的小孔。吸取上述后生元200L到琼脂孔，做 3 个重复，对照孔加等量 PBS（pH7.4，0.01mol/L）。将培养皿置于 4 扩散 4h 后放入 37 恒温培养箱培养 12h，测量抑菌圈的大小2021。1.2.2.2生长曲线的测定将 MRSA 用生理盐水稀释成 1105CFU/mL 的菌液，分别吸取 100L 菌液加入到 48 孔板的 5 个孔中，然后吸取 100L 浓度为 12.5%、25%、50%和 100%的 YDFF 分别加入到孔中，对照孔中用等量 PBS（pH7.4）代替，最后向每个孔中加入 800LLB 培养基，组成 1mL 的培养体系，每个样品做 3 个重复，37 下振荡培养，每隔1h 使用微生物生长曲线分析仪测量 OD600值，24h后对所有结果进行统计分析，并绘制成图。1.2.3后生元 YDFF 对 MRSA 的抑菌特性1.2.3.1酶对后生元 YDFF 抑菌活性的影响分别配置 10mg/mL 的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶溶液，与后生元按 1:9混合，使酶的终浓度为mg/mL。分别在酶最适宜pH 下置于37 水浴反应 30min，用相同体积的水与后生元混合作为对照，然后通过抑菌圈法测定各种酶对抑菌活性的影响。1.2.3.2pH 对后生元 YDFF 抑菌活性的影响用5mol/L 的 NaOH 和 5mol/L 的 HCl 分别将后生元YDFF 的 pH 调至 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按照 1.2.2.1 的方法进行抑菌实验，测量并记录抑菌圈直径，分别测试不同 pH 对YDFF 抑菌活性的影响。根据实验结果选择合适的 pH 用于后续实验。1.2.3.3后生元 YDFF 中胞外多糖的抑菌活性判断参考文献 22 的方法，采用乙醇沉淀法对后生元YDFF 中的胞外多糖进行粗提。在后生元（pH7.0）中加入终浓度为10%（质量体积分数）的三氯乙酸，充分混合，4 静置过夜以沉淀蛋白，然后4、12000r/min 离心 15min 取上清，慢慢加 3 倍体积的冰乙醇，4 静置 24h，沉淀多糖。4、12000r/min离心 15min弃上清液，收集沉淀，挥发去除沉淀中的乙醇后进行冷冻干燥，得到胞外粗多糖提取物。配置 12.5%、25%、50%胞外多糖溶液，通过抑菌圈法测试不同浓度胞外多糖的抑菌活性。156食品工业科技2023 年11月1.2.4后生元 YDFF 对 MRSA 的抑菌机制1.2.4.1后生元 YDFF 对 MRSA 生物膜形成的影响参考文献 23 方法，通过结晶紫染色法测定后生元 YDFF 对 MRSA 生物膜形成的抑制作用。具体步骤如下：在 96 孔平底培养板中每孔加入 100L浓度为 106CFU/mL 的 MRSA 菌悬液和 100L 浓度为 25%、50%和 100%的 YDFF（pH7.0），对照组中加入等量的水，37 恒温培养箱培养 48h 后，除净上层培养基以及游离细菌，用 200LPBS 清洗3 次，再添加200L0.4%结晶紫染色 15min，吸走结晶紫；用无菌水清洗 3 次洗去浮色，待干燥后用30%醋酸溶液脱色，用酶标仪测定 OD600，按照以下公式计算后生元 YDFF 对 MRSA 生物膜形成的抑制率。抑制率(%)=ODcODtODc 100式中：ODc为对照组 OD 值：ODt为后生元处理组的 OD 值。1.2.4.2后生元 YDFF 对 MRSA 形态结构的影响将 MRSA 活化并稀释至 106107CFU/mL，8000r/min，离心 10min，用 PBS 清洗 3 次，除净上清液，加入 100L 浓度 100%的后生元 YDFF（pH7.0），对照组加入等量的水。置于 37 水浴锅 30min 后，8000r/min，离心 10min 收集沉淀，用 PBS 清洗 3 次，除净上清液，用2.5%的戊二醛溶液4 固定 24h；8000r/min，离心 10min，用 PBS 洗涤 3 次，除净上清液；用浓度递增的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%及 100%）依次进行梯度脱水，脱水后对菌体细胞进行真空冷冻干燥，干燥后进行喷金包被，扫描电子显微镜观察细菌的细胞形态变化2425。1.2.4.3后生元 YDFF 对 MRSA 胞内 DNA 泄漏的影响根据 Yin 等26的方法，将 MRSA 活化并稀释至 106107CFU/mL 后，8000r/min，离心 10min，用PBS 清洗 3 次，除净上清液，分别加入 100L 浓度为 25%、50%、100%的后生元 YDFF（pH7.0），对照组加入等量的水。置于 37 水浴 30min 后，利用紫外分光光度计，通过比较阴性对照与后生元处理过后的 MRSA 在 260nm 波长下吸光度值的变化，检测后生元处理 MRSA 后的 DNA 泄漏情况。1.2.4.4后生元 YDFF 对 MRSA 胞内 ROS 产生的影响采用活性氧检测试剂盒进行检测。试剂盒中的探针 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA）可以与细胞内产生的 ROS 反应生成荧光素，通过流式细胞仪检测荧光素的荧光强度即可间接检测ROS 的产量27。离心收集 106107CFU/mL 的 MRSA菌体，用PBS清洗 3 次后重悬于900LPBS中，分别加入 100L 浓度为 25%、50%和 100%的后生元YDFF（pH7.0），37 水浴30min，未处理组用水做对照，分别加入终浓度为10mmol/LH2DCF-DA37 避光染色 1h，然后用 PBS 清洗，最后用流式细胞仪检测后生元对 MRSA 胞内 ROS 产生的影响。1.2.5后生元 YDFF 对 MRSA 抗生素耐药性影响根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准并参考文献方法28，使用棋盘式微量液基稀释法（简称棋盘法）检测后生元 YDFF 对 MRSA 的耐药性影响。首先测定后生元 YDFF 和-内酰胺类抗生素甲氧西林的最小抑菌浓度（MIC），并测定其对 MRSA的分级抑菌浓度指数（FICI），FICI0.5 为两者抗菌具有协同作用，FICI4 为拮抗作用，0.5FICI4 为无关作用。将 MRSA 菌液用 LB 培养基稀释至106CFU/mL，在 96 孔平底培养板中依次加入 100L倍比稀释的后生元（pH7.0）、甲氧西林和 100L 的菌悬液，将 96 孔平底培养板置于 37 恒温培养箱中培养 18h，在 600nm 波长下测定吸光度值的变化，参考 ROLTA 等29的方法，根据以下公式计算 FICI。FICI=FICa+FICb=MICab/MICa+MICba/MICb式中：MICa和 MICb分别表示药物后生元和甲氧西林单用时的 MIC 值，MICab是后生元在甲氧西林联合下的 MIC 值，MICba是甲氧西林在后生元联合下的 MIC 值29。1.3数据处理本文中所有实验均平行三次。所有数据均以平均值（mean）标准差（SD）表示。采用Origin8.0 软件对实验结果进行数据统计，组间两两比较采用 t 检验法。2结果与分析2.1具有抑菌功能的后生元的制备本研究对 3 株菌的不同初始接种量进行了验证，由表 1 可知，副干酪乳酪杆菌 Postbio-P6、发酵粘液乳杆菌 Postbio-Q7、乳酸乳球菌乳亚种 Postbio-F3 在接种量分别为 3%、2%、3%时所制备的后生元表1不同接种量对后生元抑菌活性的影响Table1Effectsofdifferentinoculateddoses接种比例（%）抑菌圈直径（mm）副干酪乳酪杆菌Postbio-P6发酵粘液乳杆菌Postbio-Q7乳酸乳球菌乳亚种Postbio-F331315.20.8b32319.11.5a33312.41.1c注：不同字母表示有显著性差异（P0.05）。第44卷第21期兰冬雪，等：3 株乳酸菌复合发酵制备的后生元对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制157活性最高，说明在此接种比例下，菌株之间通过互作关系能够刺激相关代谢通路高量表达，从而产生更多抑菌活性物质，因此选用该接种量所制备的后生元用于后续实验。本研究采用高温高压方法制备后生元YDFF（含有死菌体和代谢产物），经测试抑菌活性未受影响，说明 YDFF 中的抑菌活性物质耐受高温高压。此外，通过菌落计数法检测后生元 YDFF 无活菌生长，证明高温高压方法灭菌完全。2.2后生元 YDFF 对 MRSA 的抑菌作用2.2.1抑菌圈实验如图 1A 所示，后生元 YDFF 上清液和后生元 YDFF 混合液对 MRSA 均有明显的抑制作用。后生元 YDFF 上清液对 MRSA 的抑菌圈直径为19.11.5mm，后生元YDFF 混合液对MRSA的抑菌圈直径为 18.51.2mm，而后生元 YDFF 死菌体无抑菌活性。综上结果选用上清液进行后续的实验。A上清液混合液沉淀00123OD60045678PBS后生元50%后生元25%后生元12.5%后生元4812时间(h)162024B图1后生元 YDFF 对 MRSA 的抑菌活性Fig.1AntibacterialactivityofpostbioticYDFFonMRSA注：A.抑菌圈；B.生长曲线。2.2.2生长曲线的测定不同浓度的后生元 YDFF对 MRSA 生长变化趋势影响如图 1B 所示，未加后生元的空白对照组细菌生长呈现出典型的 S 型生长曲线。添加浓度为 50%和 100%的后生元 YDFF完全抑制了细菌的生长，OD 值基本不变；添加浓度为 25%的后生元 YDFF 在 20h 前细菌不生长，20h开始轻微生长；而添加 12.5%后生元尽管没有完全抑制细菌的生长，但细菌的对数生长期大大推迟，较对照推迟了 12h。上述结果说明后生元 YDFF 可以显著抑制 MRSA 的生长。2.3后生元 YDFF 对 MRSA 的抑菌特性2.3.1不同酶对后生元 YDFF 抑菌活性的影响实验验证了种不同的酶对后生元 YDFF 抑菌活性的影响，结果如图 2 所示。从图中可以看出，后生元YDFF 对木瓜蛋白酶、蛋白酶 K、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶较为敏感，对胃蛋白酶不敏感。其中，后生元 YDFF 经蛋白酶 K 处理后其活性完全丧失，由此可推断，后生元 YDFF 中发挥抑菌作用的可能是蛋白类物质。18abf对照组胃蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶蛋白酶K淀粉酶脂肪酶dce16141210抑菌圈直径(mm)86420图2不同酶对后生元 YDFF 抑菌活性的影响Fig.2EffectsofdifferentenzymesontheantibacterialactivityofposttioticYDFF注：图中不同字母代表差异显著（P0.05）；图 3、图 5、图 7 同。2.3.2不同 pH 对后生元 YDFF 抑菌活性的影响由图 3 可知，后生元 YDFF 在 pH3.09.0 范围内均具有抑菌活性。在酸性条件下（pH3.06.0），随着pH 降低，抑菌活性呈现增高趋势；而在中性和碱性条件下（pH7.09.0），抑菌活性呈现先升高后降低的趋势，在 pH8.0 时活性达到最大。通常后生元成分中发挥抑菌作用的主要有细菌素和有机酸等物质3031，YDFF 在 pH7.0 时仍保持较好活性，说明 YDFF 中除了有机酸还有其他活性抑菌成分。上述结果说明YDFF 抑菌活性具有较宽的 pH 耐受范围，这对 YDFF的实际应用具有重要意义。25acfgd3456pH789eb20抑菌圈直径(mm)151050图3不同 pH 对 YDFF 抑菌活性的影响Fig.3EffectsofpHontheantibacterialactivityofYDFF2.3.3后生元 YDFF 中胞外多糖的抑菌活性判断通过乙醇沉淀法粗提后生元 YDFF 中的胞外多糖，并验证后生元中的胞外多糖是否具有抑菌活性。如图 4 所示，12.5%、25%、50%的胞外多糖对 MRSA均无抑菌作用，初步判断后生元中发挥抑菌活性的物质不是多糖。158食品工业科技2023 年11月2.4后生元对 MRSA 生物膜形成的影响本论文通过结晶紫染色法测定了后生元 YDFF对 MRSA 生物膜形成的抑制作用。由图 5 可知，后生元 YDFF 对 MRSA 生物膜的形成具有显著的抑制作用（P0.001），100%、50%、25%后生元对 MRSA生物膜的抑制率分别为 81.2%、78.3%、76.8%，且呈现一定的浓度依赖性。据报道，细菌的生物膜与细菌的致病性、毒力密切相关，尤其与其抗生素耐药性相关32。由此推断，后生元YDFF 可能会通过破坏MRSA生物膜抑制细菌生长并降低细菌的耐药性。0.8ab水25%后生元 50%后生元100%后生元cd0.70.60.50.4OD6000.30.20.10.0图5后生元 YDFF 对 MRSA 生物膜的形成的影响Fig.5EffectoftheYDFFonbiofilmformationofMRSA2.5后生元对 MRSA 形态结构的影响通过扫描电镜观察后生元 YDFF 对 MRSA 菌体形态结构的影响，如图 6 所示，对照组中未经后生元处理的 MRSA 菌体细胞为典型的细胞结构，菌体圆型，表面圆润光滑，细胞表面完全没有破损，结构完整，而且菌体生长良好，没有聚集皱缩；后生元 YDFF处理的 MRSA 细胞壁和细胞膜被破坏，菌体变形并有溶解现象，细胞完整性丧失，细胞整体结构坍塌。由此可见，后生元 YDFF 可以有效地破坏 MRSA 的菌体结构，对 MRSA 具有损伤作用，能够引起细胞内容物的泄漏。2.6后生元对 MRSA胞内 DNA 泄漏的影响当细胞膜通透性受到破坏时，细胞膜的选择性下降，DNA 等细胞内容物流出。因此通过测定 DNA泄漏可以反映细菌细胞膜结构的完整性33。如图 7所示，经后生元 YDFF 处理后，MRSA 胞内 DNA 出现了泄漏（P0.001），且随着后生元浓度的增加，胞内 DNA 泄漏量也逐渐增多，说明后生元 YDFF 破坏了 MRSA 细胞膜的完整性，导致细胞内容物外泄。0.400.350.300.25d水25%后生元 50%后生元 100%后生元cba0.20OD2600.150.100.050.00图7后生元 YDFF 对 MRSA 的 DNA 泄漏影响Fig.7EffectofpostibioticYDFFonDNAleakageinMRSA2.7后生元 YDFF 对 MRSA胞内 ROS 产生的影响活性氧 ROS 是一种可参与许多细胞的生理活动的重要分子，它能维持细胞内氧化还原平衡，与细胞的生长和死亡密切相关，但过量的 ROS 会引发细胞内的氧化应激反应，从而导致细胞损伤3436。本论文通过流式细胞仪检测后生元 YDFF 对 MRSA 胞内 ROS 产生的影响，如图 8A所示，对照组检测到的产荧光素的细菌占比为 6.31%，添加 25%、50%、100%后生元检测到的产荧光素的细菌占比分别为 14.4%、33.8%、52.9%，且随着后生元浓度升高，荧光强度也增加，具有显著的浓度依赖性（图 8B），说明后生元YDFF 可以显著促进胞内 ROS 升高，这可能也是后生元 YDFF 对 MRSA 产生抑菌活性的其中一个原因。2.8后生元 YDFF 对抗生素耐药性影响为验证后生元 YDFF 对 MRSA 抗生素耐药性的影响，本研究联合后生元 YDFF 与-内酰胺类抗生素甲氧西林，测定其对 MRSA 的 FICI。结果如表 2所示，后生元 YDFF 和甲氧西林联合用药后，后生元的 MIC 由原来的 0.78%降低至 0.025%，甲氧西林的 MIC 由原来的 0.98g/mL降低至 0.25g/mL，而联用后 FICI 降低至 0.38（4为拮抗作用，0.5FICI4为无关作用。160食品工业科技2023 年11月yondpre-andprobioticsJ.Nutrients，2020，12（8）：2189.6AGHEBATI-MALEKIL,HASANNEZHADP,ABBASIA,etal.Antibacterial,antiviral,antioxidant,andanticanceractivitiesofpostbiotics：A review of mechanisms and therapeutic perspectivesJ.BiointerfaceResearchinAppliedChemistry，2021，12：26292645.7PUCCETTIM,XIROUDAKIS,RICCIM,etal.Postbiotic-enabledtargetingofthehost-microbiota-pathogeninterface：Hintsofantibioticdecline?J.Pharmaceutics，2020，12（7）：624.8ABDEG,WAFAAA.Paraprobioticsandpostbiotics：Con-temporary and promising natural antibiotics alternatives and theirapplicationsinthepoultryfieldJ.OpenVeterinaryJournal，2020，10（3）：323330.9李书鸿,柳陈坚,任贝贝,等.不同植物乳杆菌发酵液抑菌活性及其主要有机酸组成比较J.食品科学，2019，40（5）：816.LISH,LIUCJ,RENBB,etal.Comparisonofbacteriostaticac-tivityandmainorganicacidcompositionoffermentationbrothofdifferentLactobacillus plantarumJ.FoodScience，2019，40（5）：816.10XUC,FUY,LIUF,etal.PurificationandantimicrobialmechanismofanovelbacteriocinproducedbyLactobacillus rham-nosus1.0320J.LWT，2021，137：110338.11李杨,周湘人,郭薇丹,等.后生元的研究进展J.食品安全质量检测学报，2021，12（16）：65586564.LIY,ZHOUXR,GUOWD,etal.AdvancesintheresearchofmetagenesisJ.JournalofFoodSafetyandQualityInspection，2021，12（16）：65586564.12CHUANTAOP,GUOQIANGY,YARUS,etal.Compara-tiveeffectsofthesingleandbinaryprobio