竹叶发酵液的美白、增强皮肤屏障和抗炎护肤功效研究.pdf

第 37 卷第 4 期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.4 Vol.37 2023 年 8 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Aug.2023 文章编号：1003-9015(2023)04-0591-08 竹叶发酵液的美白、增强皮肤屏障和抗炎护肤功效研究 叶琳琳1,陈志雄1,阮建成2,钱 超2(1.杭州雅妍化妆品有限公司,浙江 杭州 311123;2.浙江大学 化学工程与生物工程学院,浙江 杭州 310058)摘 要：为研究竹叶发酵液(FBL)的护肤功效，选取角质形成细胞(HaCaT)和黑色素瘤细胞(B16)作为细胞模型，利用细胞计数试剂(CCK-8)评估竹叶发酵液的细胞毒性；并通过检测黑色素含量、十二烷基硫酸钠(SLS)损伤模型下丝聚蛋白和炎症因子的基因表达，分别考察 FBL 的美白、增强皮肤屏障和抗炎的护肤功效。结果表明，FBL 对上述细胞均没有毒性，同时能够显著降低 B16 细胞内黑色素的含量(显著性 p0.001)，并能促进丝聚蛋白的基因表达(p0.001)、抑制肿瘤坏死因子-(TNF-)和白介素-6(IL-6)的基因表达(p0.001，p0.01)。因此，FBL 具有潜在的护肤功效。关键词：竹叶发酵液；美白；皮肤屏障；抗炎 中图分类号：TQ033 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-9015.2023.04.010 Effects of bamboo leaf fermentation broth on the whitening,skin barrier strengthening and anti-inflammatory skincare functions YE Linlin1,CHEN Zhixiong1,RUAN Jiancheng2,QIAN Chao2(1.Hangzhou Yayan Cosmetics Co.Ltd.,Hangzhou 311123,China;2.College of Chemical and Biological Engineering,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)Abstract:HaCaT cells and B16 cells were applied to establish evaluation models to study the effects of bamboo leaf fermentation broth(FBL)on skincare functions.CCK-8 test was performed to evaluate cell toxicity of FBL.The whitening,skin barrier strengthening and anti-inflammatory effects of FBL were determined by melanin content assay,gene expression assay of filaggrin and inflammatory factors under sodium lauryl sulfate injury model,respectively.The results show that FBL has no toxicity to HaCaT and B16 cells.FBL can significantly reduce melanin contents in B16 cells(p 0.001),promote filaggrin gene expression(p 0.001)and inhibit the expression of TNF-and IL-6(p 0.001,p 0.01).In conclusion,FBL has potential skincare effects.Key words:bamboo leaf fermentation broth;whitening;skin barrier;anti-inflammation 1 前 言 竹子属禾本科竹亚科，我国竹子资源丰富种类繁多，共有 40 余属 400 多种1；其中毛竹的种植面积约占竹子总面积的三分之一，但其利用率很低2。据本草纲目记载，竹叶、竹茹、竹根等有着丰富的药食两用价值，为开发中医药、保健品和护肤品提供了重要资源。近年来随着生物技术和现代医学的发展，人们对竹叶的开发利用有了进一步的提高3。据研究报道，竹叶中含有丰富的竹叶黄酮、收稿日期：2022-05-25；修订日期：2022-10-18。作者简介：叶琳琳(1978-)，女，浙江杭州人，杭州雅妍化妆品有限公司工程师，博士。通信联系人：叶琳琳，E-mail： 引用本文：叶琳琳,陈志雄,阮建成,钱超.竹叶发酵液的美白、增强皮肤屏障和抗炎护肤功效研究 J.高校化学工程学报,2023,37(4):591-598.Citation：YE Linlin,CHEN Zhixiong,RUAN Jiancheng,QIAN Chao.Effects of bamboo leaf fermentation broth on the whitening,skin barrier strengthening and anti-inflammatory skincare functions J.Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities,2023,37(4):591-598.592 高 校 化 学 工 程 学 报 2023年8月 多糖、氨基酸以及多种微量元素4。潘进权等5研究表明竹叶黄酮作为一种天然的抗氧化剂，对超氧阴离子和羟基自由基有较好的清除能力；王楠等6研究表明通过将竹叶黄酮纳米粒子作用于黑色素瘤细胞(B16)，能显著抑制细胞内的酪氨酸酶活性，抑制黑色素的生成，且当竹叶黄酮纳米粒子的质量浓度为 100 mgmL1时，其美白效果优于-熊果苷。黄赛金等7研究表明竹叶多糖能显著降低实验组小白鼠的脂质过氧化，提升超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活性，表明竹叶多糖具有一定的抗衰老功效。张英等8研究表明竹叶中含有丰富的氨基酸资源，如谷氨酸、天冬氨酸等，且其中的特种氨基酸-羟基赖氨酸具有比赖氨酸更高的抗氧化活性。综上所述，大量的研究表明竹叶中的活性成分具有抗氧化、抗自由基、抗衰老、美白等生物学功效。在护肤行业中，发酵化妆品已成为天然植物提取化妆品之后的又一大热点，如海蓝之谜、SK-II 神仙水等，因其具有显著的护肤功效，深受消费者喜爱9。植物经过发酵后会产生有显著护肤功效的活性物质，我国拥有丰富的中草药资源，已有不少研究报道通过中草药的微生物发酵得到护肤功效显著的化妆品原料。比如，赵丹等10利用葡萄酒酵母发酵灵芝，得到的灵芝发酵液具有抗衰老和美白功效；蔡丙国等11研究酵母菌发酵茉莉花得到的发酵液具有显著的美白功效。然而对于竹叶发酵利用的研究较为有限，竹叶发酵产物的护肤功效尚未被充分阐明。本研究以毛竹竹叶发酵液为研究对象，初步研究了发酵液对角质形成细胞(HaCaT)和黑色素瘤细胞(B16)的影响，为竹叶发酵液在化妆品美白、保湿、抗炎等功效的应用提供一定的实验依据，同时也为提高毛竹的利用率提供参考。2 实验部分 2.1 实验材料与仪器 2.1.1 实验材料 角质形成细胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)，购于上海歌凡生物科技有限公司；酿酒酵母，购于中国工业微生物菌种宝藏管理中心；RPMI-1640 培养液(含体积分数为 1%的青-链霉素，体积分数为 1%的胎牛血清)和 DMEM 高糖培养液(含体积分数为 1%的青-链霉素，体积分数为 1%的胎牛血清)，购于浙江森瑞生物科技有限公司；胎牛血清，购于浙江天杭生物科技股份有限公司；细胞计数试剂盒(CCK-8)，购于 TargetMol；磷酸缓冲盐溶液(PBS)，购于北京索莱宝生物科技有限公司；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，购于上海生工；RNA 抽提试剂盒(RNAiso Plus Kit)、反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)、荧光定量 PCR 试剂盒(TB Green qPCR)，购于宝日医生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。2.1.2 实验仪器 CO2培养箱 HF90，购于力康生物医疗科技控股有限公司；多功能酶标仪 Spark，购于瑞士 Tecan集团公司；倒置生物显微镜，购于奥林巴斯中国有限公司；离心机 L3-5K，购于湖南可成仪器设备有限公司；震荡培养箱，购于上海润度生物科技有限公司；紫外可见分光光度计，购于上海凌析仪器有限公司。2.2 实验方法 2.2.1 竹叶发酵液的制备方法 采摘的毛竹用剪刀剪掉多余部分，保留完整的竹叶。将竹叶用清水清洗 23 遍，晾干后放在烘箱 45 下烘干，然后研磨成竹叶粉末。称取 1 g 竹叶粉末，2 g 葡萄糖，加入 100 mL 蒸馏水，121 高压灭菌15 min，冷却后接种酿酒酵母种子液(菌液浓度为 2108 CFUmL1)，于 28 震荡培养箱，60 rmin1，发酵 72 h，精滤得到竹叶发酵液(FBL)。第 37 卷第 4 期 叶琳琳等：竹叶发酵液的美白、增强皮肤屏障和抗炎护肤功效研究 593 2.2.2 竹叶发酵液主要活性物的测量方法 2.2.2.1 竹叶发酵液中黄酮含量的测定 取干燥好的芦丁标准样品 10.0 mg，用 30%乙醇水溶液(无特殊说明时均为体积分数，下同)稀释至100 mL 备用；分别量取上述标准液 0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 于 25 mL 容量瓶中，加入 30%乙醇水溶液适当稀释；向容量瓶中转移 1 mL 预先配制好的质量分数为 5%的亚硝酸钠水溶液，振荡并放置 5 min后，立刻加入 1 mL 10%硝酸铝水溶液，振荡至体系均匀，室温放置 5 min；向上述体系中分别滴加 10 mL 1.0 molL1 氢氧化钠水溶液，摇匀并静置 10 min，用 30%的乙醇水溶液定容，放置 5 min 后测定其在510 nm 处的吸光度(OD)值12，每个样品至少平行测定 3 次，0 mL 溶剂瓶为空白参比。以 OD 值为横坐标，芦丁浓度为纵坐标，绘制标准曲线。取适量的 FBL，用 4 mL 的 30%乙醇水溶液稀释溶解并转移至 25 mL 容量瓶中，加入 1 mL 的 5%亚硝酸钠水溶液，振荡至体系均匀，室温下静置 5 min 后滴加质量分数为 10%的硝酸铝溶液至体系变色，摇匀并放置 5 min；待体系完全反应后加入 1 molL1氢氧化钠水溶液 10 mL，振荡至体系完全均一，静置 10 min，待络合结束加入 30%的乙醇水溶液定容，静置 5 min。取适量的待测液转移至比色皿中，30%的乙醇水溶液(不含样品)作为空白对照，用紫外可见分光光度计测定其在 510 nm 处的 OD 值，每个样品平行测定 3 次，记录每次 OD 值，代入标准曲线方程计算样品中总黄酮的浓度。2.2.2.2 竹叶发酵液中多糖含量的测定 精密称取蒽酮试剂100.0 mg，用预先配制好的质量分数为75%的硫酸水溶液溶解并定容至100 mL，在低温避光条件下保存备用(6 h 内用完，配好的溶液呈现黄色，见光会变绿，使试剂变质)；配制 1 mgmL1的葡萄糖标准液，并稀释成 0、20、40、60、80、100、120、140、160 gmL1的溶液备用；分别取 1 mL上述溶液于 10 mL 的离心管中，1 mL 的蒸馏水作为空白对照，分别于冰浴中加入 4 mL 现配的蒽酮-硫酸试剂，立刻封口振荡，于 100 沸水浴中加热 15 min，每个样品重复 4 次。平行组的 4 个样品自加入沸水浴到反应结束的间隔时间应控制在 15 min，误差控制在 8 s 以内，反应结束后立即转移至冰水浴中冷却5 min后转移至室温环境，待体系与环境温度一致时用紫外可见分光光度计测定其在620 nm的OD值13。以葡萄糖 OD 值为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。取适量的 FBL 稀释至合适浓度，加入蒽酮-硫酸试剂，待反应结束后按上述标准方法测定并计算多糖含量，最终结果以葡萄糖计。2.2.2.3 竹叶发酵液中氨基酸含量的测定 配制 20 mgmL1的茚三酮水溶液 100 mL，低温避光保存(现配现用)；取 10 mL 的离心管，分别加入0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 gmL1不同质量浓度的甘氨酸标准液 1 mL，再加入 2 mL pH6.0的 PBS，摇匀后再加入 1 mL 的茚三酮标准液，振荡后于 100 加热 30 min，反应结束先在冰水浴冷却 5 min再转移至室温环境，用0 gmL1标准液作为空白对照，用紫外可见分光光度计于568 nm处测定OD值14。以甘氨酸 OD 值为横坐标，其对应的不同质量浓度的甘氨酸标准溶液的值为纵坐标，绘制标准曲线。取适量的 FBL，加入茚三酮水溶液，按上述标准方法测定并计算氨基酸含量，最终结果以甘氨酸计。2.2.3 细胞培养和分组 HaCaT 细胞和 B16 细胞分别用 RPMI-1640 培养液和 DMEM 高糖培养液在 37、5%CO2条件下培养，当细胞融合度达到 70%80%时，采用质量分数为 0.25%的胰酶进行消化，并用血球计数板计数，最后制备一定浓度的细胞悬液接种于细胞培养皿传代。角质形成细胞实验分为 3 组：空白对照组、模型组、实验组；其中空白对照组细胞不经过任何处理，模型组细胞采用85 gmL1浓度的十二烷基硫酸钠(SLS)处理4 h，实验组细胞先用一定浓度的FBL处理24 h，吸弃培养基，再用无菌 PBS 洗 2 遍，最后用质量浓度为 85 gmL1的 SLS 处理 4 h15。2.2.4 HaCaT 细胞和 B16 细胞的活力测定 选择适当浓度的 FBL，对 HaCaT 细胞和 B16 细胞进行 CCK-8 实验。取对数生长期的 HaCaT 细胞和594 高 校 化 学 工 程 学 报 2023年8月 B16 细胞，密度为 31045104个mL1，分别在 96 孔细胞培养板上铺板，在 37，5%CO2条件下过夜培养。加入 10 L 已配好梯度浓度的 FBL，作用 24 h 后，再加入 10 L 的 CCK-8 试剂孵育 24 h，用酶标仪测定各孔在 450 nm 下的 OD 值。细胞活力计算方法如下16：450450450450ODOD100%ODOD实验组-凋零孔细胞活力对照组-凋零孔 2.2.5 B16 细胞内黑色素含量的测定 通过氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量17，取对数生长期的 B16 细胞，密度为 31045104个mL1，在 96 孔细胞培养板上铺板，在 37，5%CO2条件下过夜培养。加入 10 L 已配好梯度浓度的FBL，每组设置 5 个平行组，作用 24 h，吸弃上清液，再用已灭菌的 PBS 洗涤 3 次，加入 150 L 1 molL1 氢氧化钠溶液(含质量分数为 10%的二甲基亚砜)，用移液器吹打混匀，再在 80 水浴锅中反应 40 min，最后在酶标仪上测定 405 nm 处 OD 值。相对黑色素含量计算方法如下：450450450450ODOD100%ODOD实验组-凋零孔相对黑色素含量对照组-凋零孔 2.2.6 RNA 抽提和荧光定量 PCR 取对数生长期的细胞，密度为 5104个mL1，在 6 孔细胞培养板上铺板，每孔总体积为 2 mL；细胞分为 3 组，分别是空白对照组、SLS 组、FBL 组，利用 RNAiso 提取总 RNA，然后采用 PrimeScriptRT reagent Kit 把 RNA 逆转成互补 DNA(cDNA)，加入SYBR 染料、引物以及 cDNA 模板后，进行实时荧光定量 PCR 反应。反应程序为两步法，具体程序如下：预变性 95，30 s；PCR 反应 95，5 s，60，30 s，40 次循环。丝聚蛋白(FLG)基因、肿瘤坏死因子-(TNF-)基因、白介素-6(IL-6)基因和内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的上游(F)及下游(R)引物序列分别为 FLG-F:TGAAGCCTATGACACCACTGA,FLG-R:TCCCCTACGCTTTCTTGTCCT;TNF-F:GAGGCCAAGCCCTGGTATG，TNF-R:CGGGCCGATTGATCTCAGC；IL-6-F:CCTGAACCTTCCAAAGATGGC，IL-6-R:TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA；GAPDH F:ACCCACTCCTCCACCTTTGA，GAPDH R:CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT。2.2.7 竹叶发酵液多次皮肤刺激性试验 本实验由浙江方圆检测集团股份有限公司完成并提供报告。实验方法如下：试验前动物在实验动物房环境中至少适应 3 d 时间。试验前约 24 h，将实验动物背部脊柱两侧毛剃除，去毛范围左、右各约 3 cm3 cm，涂抹面积约 2.5 cm2.5 cm。试验时取受试物约 0.5 mL 涂抹在试验侧皮肤上，另一侧作为对照，每天涂抹 1 次，连续涂抹 14 d。从第 2 天开始，每次涂抹前剪毛，用水清除残留受试物。1 h 后观察结果，对照区和试验区同样处理。按化妆品安全技术规范(2015 年版)的“第六章 4 皮肤刺激性/腐蚀性试验”18，对皮肤刺激反应进行评分，按下列公式计算每只动物平均分，并根据评分皮肤刺激强度分级判定皮肤刺激强度。45014d14每只动物的红斑和水肿总积分每天每只动物平均积分(刺激指数)受试动物数 2.2.8 数据分析 实验结果均以标准差x s 表示，不同实验条件下比较均采用齐性方差 t 检验，再由 GraphPad Prism 8软件中的 One-Way ANOVO 完成数据分析，显著性 p0.05 有差异统计学意义。第 37 卷第 4 期 叶琳琳等：竹叶发酵液的美白、增强皮肤屏障和抗炎护肤功效研究 595 Control110-1 10-2 10-3 050100150200*FBL/(gmL1)图 1 竹叶发酵液对 HaCaT 细胞增殖的作用 Fig.1 Effects of FBL on cell viability of HaCaT cells Cell viability/%Control110-1 10-2 10-3 0255075100125FBL/(gmL1)图 2 竹叶发酵液对 B16 细胞增殖的作用 Fig.2 Effects of FBL on cell viability of B16 cells Cell viability/%3 实验结果与讨论 3.1 竹叶发酵液中主要活性成分测定结果 FBL 中主要成分是竹叶黄酮 5、多糖 7和氨基酸8，测得竹叶黄酮质量浓度为 129.77 gmL1、多糖质量浓度为581.74 gmL1、氨基酸质量浓度是 32.23 gmL1，并与常规的水-乙醇提取方法相比，如表 1 所示：这 3 种成分的提取率都有明显的提高。本研究发现发酵过程有效地提高了多糖、黄酮和氨基酸的提取率，这可能是发酵期间酵母菌对细胞壁的分解，促进细胞内有效成分的溶出，从而提高了竹叶发酵的功能性成分提取率；此外，酵母的增殖可能强化了对发酵底物的转化，如将植物基蛋白质降解为小分子氨基酸。赵丹等10的研究中也有提到灵芝发酵液相对灵芝水提液中多糖、多肽、黄酮含量均有提高。使用微生物进行发酵有助于产生更多的活性物质，提高生物活性成分的利用。3.2 竹叶发酵液的细胞毒性测定 HaCaT 细胞和 B16 细胞经过不同质量浓度FBL的 FBL 处理 24 h 后的增殖率如图 1、2 所示。当细胞活力小于 80%时，可说明该样品对细胞存在毒性19。从图 1 中可以看出 FBL 对 HaCaT 细胞具有一定的促进增殖的作用，尤其添加 101 gmL1 FBL 时，细胞活力最高，具有统计学意义(p0.01)。但是同样的质量浓度下竹叶水提取液对 HaCaT 细胞的活性具有明显的抑制作用，细胞活力均在 80%以下。原因可能是因为发酵液中的竹叶黄酮在一定浓度下对 HaCaT 具有良好的生物学作用，对超氧阴离子和羟基自由基有着较好的清除能力5，从而有促进角质形成细胞的增殖能力；而其他质量浓度的 FBL 对 HaCaT 细胞没有显著促进增殖，也没有毒性。因此，FBL 对 HaCaT 细胞有一定的细胞增殖功效，并且在测试的浓度范围内没有细胞毒性，温和性较好，并且温和性高于竹叶水提取液。综上分析初步判断 FBL 作为一种天然的护肤原料具有一定的安全性。此外，从图 1、2 可知在 FBL 作用下 2 种细胞的活力均在 100%以上，后续功效实验选择 103 gmL1作为主要的实验浓度。3.3 竹叶发酵液对 B16 细胞内黑色素含量的影响 小鼠黑色素瘤细胞(B16)与人类黑色素细胞合成黑色素的代谢过程较为相似，因此在体外筛选美白相关的原料时大都会采用此细胞作为模型。熊果苷、抗坏血酸(VC)等是目前化妆品中常用的美白原料，但有研究发现他们在高浓度下对细胞有较大的毒性20。当下美白原料的开发不仅要注重美白效果，也要考量对细胞的毒性，即安全性。从图 2 可以发现 FBL 对 B16 细胞没有细胞毒性，相对温和安全。并且从图3 中可以看出当 FBL 稀释 1 000 倍再作用在 B16 细胞 24 h 后，细胞中的黑色素含量降低到空白对照组的63.81%，与空白对照组相比差异极显著(p0.001)。FBL 能显著降低 B16 细胞中黑色素的含量，原因可能是发酵后的竹叶黄酮含量有明显提升，而竹叶黄酮能显著抑制细胞内的酪氨酸酶活性6，从而抑制其黑表 1 发酵对主要成分提取率的影响 Table 1 Effects of fermentation on the extraction rate of essential components Essential components Extraction rate of traditional extraction/%Extraction rate of fermentation/%Amino acids 0.15 0.28 Flavonoids 1.16 1.39 Polysaccharides 3.69 7.14 596 高 校 化 学 工 程 学 报 2023年8月 图 4 竹叶发酵液对角质形成细胞形态的影响 Fig.4 Effects of FBL on HaCaT cells morphology(a)control(b)treated with SLS(c)treated with FBL and SLS色素的生成。由上可以推测 FBL 具有一定的美白功能，并且温和安全。3.4 竹叶发酵液增强皮肤屏障的研究 角质形成细胞位于皮肤的表皮层，在皮肤屏障功能中起着重要作用21。SLS 是化妆品行业常见的一种表面活性剂，它能破坏皮肤表皮屏障功能，破坏细胞正常生长22。因此研究采用SLS作为皮肤表皮屏障破坏的模型对FBL进行了研究。图 4 为 HaCaT 细胞在倒置显微镜下(目镜放大10 倍，物镜放大 20 倍)的形态图；图 4(a)的细胞没有经过任何处理，正常的 HaCaT 细胞生长方式为贴壁生长，轮廓清晰，形态呈扁平多角形，折光性好23；图 4(b)的细胞经过 85 gmL1浓度的 SLS 处理 4 h，此时贴壁细胞的数量明显比图 4(a)少，且部分细胞的形态变成长条形，轮廓模糊，细胞内外可见较多的颗粒物；图 4(c)的细胞先用一定浓度的 FBL 处理 24 h 后，吸弃样品再用无菌 PBS 洗两遍，最后再用 85 gmL1浓度的 SLS 处理 4 h，此时 HaCaT 细胞不管是数量还是形态上均与图 4(a)差异不大。以上结果表明 FBL 可以有效增强皮肤屏障功能。丝聚蛋白(FLG)是角质形成细胞分化蛋白中的一种，主要在颗粒层和透明层中表达。Batista 等24研究表明特应性皮炎患者中丝聚蛋白的表达明显比正常人低；Park 等25发现丝聚蛋白表达水平下降，会导致皮肤屏障功能异常。从图5 中可以看出 SLS 模型组的丝聚蛋白的信使 RNA(mRNA)表达水平显著低于空白对照组(p0.01)，而 FBL 组的丝聚蛋白的 mRNA 表达水平显著高于 SLS 模型组(p0.001)，这一结果与倒置显微镜下观察到的细胞形态的结果一致，综上分析推测 FBL 可以通过增加丝聚蛋白的表达，来强化皮肤屏障的功能。3.5 竹叶发酵液的抗炎功效评价 SLS 是化妆品中常见的一种表面活性剂，它能破坏皮肤表皮的屏障功能，且能通过 TNF-信号通路引发皮肤炎症，最终使促炎因子白介素-6(IL-6)表达增加22。本实验通过一定浓度的 SLS 制造炎症模型，从图 6 中可以看出 SLS 模型组的 TNF-和 IL-6 的 mRNA 表达水平显著高于空白对照组(p0.001，p0.01)，这一结果与 Bernhofer 等26的研究结论一致，而 FBL 组的 TNF-和 IL-6 的 mRNA 表达水平显著低于 SLS 模型组(p0.001，p0.01)。以上结果表明，FBL 能抑制细胞中 TNF-和 IL-6 的基因表达，减轻角质形成细胞的炎症反应，保护由 SLS 造成损伤的细胞。因此，FBL 作为一种化妆品原料具有抗炎的功效。Control110-110-210-30255075100125*FBL/(gmL1)图 3 竹叶发酵液对 B16 黑色素细胞 黑色素合成的影响 Fig.3 Effects of FBL on melanin synthesis in B16 melanoma cells Relative melanin contents/%0.00.51.01.52.02.5*Control SLS FBL图 5 竹叶发酵液对角质形成细胞中 丝聚蛋白基因表达的影响 Fig.5 Effects of FBL on filaggrin gene expression of HaCaT cells mRNA expression of the FLG 第 37 卷第 4 期 叶琳琳等：竹叶发酵液的美白、增强皮肤屏障和抗炎护肤功效研究 597 02468*01234*Control SLS FBL Control SLS FBLmRNA expression of the TNF-mRNA expression of the IL-6(a)RNA expression of the TNF-(b)mRNA expression of the IL-6 图 6 竹叶发酵液对角质形成细胞中炎症因子基因表达的影响 Fig.6 Effects of FBL on inflammatory factor genes expression of HaCaT cells 表2 受试物对家兔多次皮肤刺激性试验结果 Table 2 Results of repeated rabbit skin irritation tests of FBL Days Animal numbers Skin irradiation score Sample(FBL)Control ErythemaEdemaTotalErythema Edema Total1 40000 0 02 40000 0 03 40000 0 04 40000 0 05 40000 0 06 40000 0 07 40000 0 08 40000 0 09 40000 0 010 40000 0 011 40000 0 012 40000 0 013 40000 0 014 40000 0 0Average score of each animal over 14 days 00 Average score of each animal in each day 00 3.6 竹叶发酵液的刺激性评价 根据化妆品安全技术规范(2015 年版)18对 FBL 样品进行安全性毒理检验，结果见表 2。在本试验条件下，受试物对家兔多次皮肤刺激性试验结果为无刺激性。4 结 论 竹叶发酵液作用于 HaCaT 细胞和 B16 细胞都没有毒性，2 种细胞均表现出较高的活力，并且对家兔多次皮肤刺激试验无刺激性，说明 FBL 具有良好的生物安全性。通过测定黑色素含量发现，FBL 能明显抑制 B16 细胞中黑色素的生成，说明 FBL 具有一定的美白功效。通过一定浓度的 SLS 构建角质形成细胞损伤模型，发现加入 FBL 的实验组细胞形态明显好于对照组，且丝聚蛋白的基因表达水平也显著高于对照组，炎症因子 TNF-和 IL-6 的基因表达水平也显著低于对照组，说明 FBL 有一定的增强皮肤屏障和抗炎的功效。参考文献：1 梁泰然.中国竹林类型与地理分布特征 J.竹子研究汇刊,1990(4):1-16.LIANG T R.Types and geographical flora characteristics of bamboo forest in china J.Journal of Bamboo Research,1990(4):1-16.2 李延军,许斌,张齐生,等.我国竹材加工产业现状与对策分析 J.林业工程学报,2016,1(1):2-7.LI Y J,XU B,ZHANG Q S,et al.Present situation and the countermeasure analysis of bamboo timber processing industry in China J.Journal of Forestry Engineering,2016,1(1):2-7.3 YU Y,ZHAN M L,GUANG T C,et al.Bamboo leaf flavonoids extracts alleviate oxidative stress in HepG2 cells via naturally modulating reactive oxygen species production and Nrf2-mediated antioxidant defense responses J.Journal of Food Science,2019,84(6):1609-1620.4 DAN Y Z,CAI Y W,YING S 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