左、右半结肠癌PD-L1表达、MSI状态、KRAS突变及临床病理特征的差异.pdf

2023,43(6)http:/J Clin Pathol Res 临床与病理杂志左、右半结肠癌PD-L1表达、MSI状态、KRAS突变及临床病理特征的差异任贝贝1，2，3，吴道远1，2，3，王艺1，2，3，夏庆欣1，2，3，张贺1，2，3（1.郑州大学附属肿瘤医院病理科，郑州 450008；2.河南省病理诊断抗体工程研究中心，郑州 450008；3.河南省肿瘤病理和人工智能医学重点实验室，郑州 450008）摘要 目的：探讨左半结肠癌、右半结肠癌程序性死亡因子配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)表达、微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)、Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)基因突变以及临床病理特征的差异。方法：收集2021年1月至12月郑州大学附属肿瘤医院临床病理中心723例结直肠癌患者的临床病理与分子检测资料进行回顾性分析；采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法检测MSI、KRAS基因突变，免疫组织化学法评估PD-L1蛋白表达。结果：在723例结直肠癌中，左半结肠癌521例，右半结肠癌202例。相较于左半结肠癌，右半结肠癌具有女性多发、浸润深度更深、分化更差的特点(均P0.05)；同时，右半结肠癌MSI发生率显著高于左半结肠癌(P0.05)。结论：左半结肠癌、右半结肠癌的临床病理特征、MSI状态及PD-L1表达均存在显著差异，提示左、右半结肠癌可能是两种不同的肿瘤。关键词 结直肠肿瘤；左半结肠癌；右半结肠癌；程序性死亡因子配体1；Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物；微卫星不稳定性；临床病理特征Differences of PD-L1 expression,MSI status,KRAS mutation,and clinicopathological characteristics between left and right colorectal cancerREN Beibei1,2,3,WU Daoyuan1,2,3,WANG Yi1,2,3,XIA Qingxin1,2,3,ZHANG He1,2,3(1.Department of Pathology,Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Pathological Diagnostic Antibody Engineering Research Center of Henan Province,Zhengzhou 450008;3.Henan Medical Key Laboratory of Tumor Pathology and Artificial Intelligence Diagnosis,Zhengzhou 450008,China)DOI：10.11817/j.issn.2095-6959.2023.222678收稿日期(Date of reception)：2022-12-15第一作者(First author)：任贝贝，Email:,ORCID:0000-0002-6921-175X通信作者(Corresponding author)：张贺，Email:,ORCID:0000-0001-7729-739X基金项目(Foundation item)：国家自然科学基金(31901233)；河南省医学科技攻关联合共建项目(LHGJ20210174)；河南省科技攻关计划(222102310157)。This work was supported by the National Natural Science Foundation(31901233),Medical Science and Technology Joint Construction Project of Henan Province(LHGJ20210174),and Scientific and Technological Breakthroughs in Henan Province(222102310157),China.1119临床与病理杂志,2023,43(6)http:/ABSTRACT Objective:To investigate the differences of programmed death-ligand 1(PD-L1)expression,microsatellite instability(MSI),Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog(KRAS)gene mutation,and clinicopathological characteristics between left and right colorectal cancer.Methods:A total of 723 colorectal cancer patients with complete clinicopathological and molecular detection data from January to December 2021 were selected from the Clinical Pathology Center of Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University for retrospective analysis.Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect MSI and KRAS gene mutations,and immunohistochemistry was used to evaluate the expression of PD-L1 protein.Results:Among the 723 cases of colorectal cancer,there were 521 cases of left colorectal cancer,and 202 cases of right colorectal cancer.Compared with left colorectal cancer,the right colorectal cancer occurred more often in women,with deeper invasion depth and worse differentiation(all P0.05).Moreover,the incidence of MSI in right colorectal cancer was significantly higher than that in left colorectal cancer(P0.05).Conclusion:There are significant differences in the clinicopathological characteristics,MSI status,and PD-L1 expression between left and right colorectal cancer,suggesting that left and right colorectal cancer may be 2 different tumors.KEY WORDS colorectal neoplasms;left colorectal cancer;right colorectal cancer;programmed death-ligand 1;Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog;microsatellite instability;clinicopathological characteristics结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率在我国呈逐年上升的趋势，病死率较高1。Bufill2在1990年系统阐述了左、右半结肠癌在流行病学、临床表现、病理特征及分子遗传学等方面的差异，提出左、右半结肠癌是2种不同类型肿瘤的观点。左、右半结肠癌现有的治疗模式主要是手术、化疗、生物药物和放疗。对于二线方案，免疫治疗正在获得越 来 越 多 的 关 注，其 中 基 于 程 序 性 死 亡 因 子(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡因子配体 1(programmed death-ligand 1，PD-L1)通路的肿瘤免疫靶向治疗效果尤为突出3。PD-L1属于B7家族中的负向共刺激分子，在活化的B细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞和大量的肿瘤细胞中表达4。PD-L1与表达在淋巴细胞表面的PD-1结合后，能抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态，从而诱导免疫逃逸，促进肿瘤生长。本研究通过对左、右半结肠癌患者的临床病理特征、微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)基因突变以及PD-L1表达的差异进行分析，旨在探讨左、右半结肠癌的差异，为结直肠癌的个体精准化治疗提供依据。1 对象与方法 1.1 对象收集 2021 年 1 至 12 月郑州大学附属肿瘤医院临床病理中心723例临床病理与分子检测资料完整的结直肠癌患者，回顾性分析左、右半结肠癌患者 PD-L1 表达、MSI 状态、KRAS 基因突变以及临床病理特征的差异。纳入标准：1)全身检查无多原发癌证据；2)于郑州大学附属肿瘤医院行结直肠癌切除术且术后病理诊断为结直肠癌。排除标准：1)术前行新辅助放化疗；2)相关分子检测及临床资料不完整。在723例患者中，男398例，女325例，发病年龄为2090(中位数60)岁；左半结肠(包括脾1120左、右半结肠癌PD-L1表达、MSI状态、KRAS突变及临床病理特征的差异 任贝贝，等曲、降结肠、乙状结肠和直肠)521例，右半结肠(包括盲肠、升结肠、肝曲、横结肠)202例。病理分期标准 按 照 美 国 癌 症 联 合 委 员 会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)/国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)结直肠癌第 8版 TNM 分期标准评定。本研究经郑州大学附属肿瘤 医 院 医 学 伦 理 委 员 会 批 准(审 批 号：2022-318-001)。1.2 方法1.2.1 PD-L1检测及判读采用EnVision法，使用罗氏PD-L1单克隆抗体(克隆号：SP263)及 OptiView DAB 显色系统，在Ventana BenchMark ULTRA全自动免疫组织化学染色系统上检测PD-L1蛋白表达。PD-L1的结果判读采用联合阳性评分(combined positive score，CPS)，代表肿瘤细胞及免疫细胞联合阳性，CPS指阳性活跃肿瘤细胞(任何强度的部分或完全膜染色)及其同一20倍视野内阳性淋巴细胞、巨噬细胞(任何强度的细胞膜或细胞质染色)占所有活肿瘤细胞的百分比，结果采用0100分来表示(计算结果超过100时，CPS的最高评分仍定为100)。由2位高年资病理专科医师进行双盲独立阅片，对PD-L1染色结果进行判读评分。1.2.2 MSI检测每例石蜡包埋组织连续切卷，脱蜡后提取DNA，采 用 多 重 荧 光 聚 合 酶 链 反 应(polymerase chain reaction，PCR)-毛细管电泳技术，使用MSI检测试剂盒(上海源奇生物医药科技有限公司)在ABI 3130 分析仪(美国Applied Biosystems公司)上检测5个单核苷酸重复位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24 和MONO-27)，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。无任 何 位 点 的 变 化 定 为 微 卫 星 稳 定(microsatellite stability，MSS)，将表现为2个位点变化(微卫星高度不稳定，microsatellite instability-high，MSI-H)和表 现 为 1 个 位 点 变 化(微 卫 星 低 度 不 稳 定，microsatellite instability-low，MSI-L)的情况定为微卫星不稳定。1.2.3 KRAS基因突变检测采用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)法检测 KRAS 基因的第 12、13和61位密码子突变情况，试剂盒购自北京雅康博生物科技有限公司。具体操作和结果判读按照说明书进行。1.3 统计学处理采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，率的比较采用 2检验；PD-L1 的表达差异采用 Mann-Whitney U检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1 左、右半结肠癌临床病理特征的差异本组共723例结直肠癌患者，其中左半结肠癌患者 521 例，右半结肠癌患者 202 例。相较于左半结肠，右半结肠癌女性多发，浸润深度更深，分化更差(均P0.05，表1)。表1 左、右半结肠癌临床病理特征比较Table 1 Comparison of clinicopathological features in the left and right colorectal cancer组别左半结肠右半结肠合计2Pn521202723年龄/例(%)60岁247(47.4)105(52.0)352(48.7)1.2180.27060岁274(52.6)97(48.0)371(51.3)性别/例(%)男301(57.8)97(48.0)398(55.0)5.5960.018女220(42.2)105(52.0)325(45.0)浸润深度/例(%)T1+T2131(25.1)14(6.9)145(20.1)30.1170.001T3+T4390(74.9)188(93.1)578(79.9)组别左半结肠右半结肠合计2P淋巴转移/例(%)无311(59.7)130(64.4)441(61.0)1.3310.249有210(40.3)72(35.6)282(39.0)分化程度/例(%)低161(30.9)93(46.0)254(35.1)14.6360.001中+高360(69.1)109(54.0)469(64.9)脉管癌栓/例(%)阴性307(58.9)127(62.9)434(60.0)0.9450.331阳性214(41.1)75(37.1)289(40.0)神经侵犯/例(%)阴性406(77.9)164(81.2)570(78.8)0.9280.335阳性115(22.1)38(18.8)153(21.2)1121临床与病理杂志,2023,43(6)http:/2.2 左、右半结肠癌MSI及KRAS基因突变的差异右半结肠癌MSI发生率为27.2%，显著高于左半结肠癌MSI发生率(6.9%；2=54.617，P0.05，表2)。2.3 左、右半结肠癌PD-L1表达的差异PD-L1在肿瘤细胞的细胞膜表达；在肿瘤间质中，浸润淋巴细胞的细胞膜和细胞质也有不同强度的着色(图 1)。Mann-Whitney U 检验结果显示：右半结肠癌PD-L1的联合阳性分数显著高于左半结肠癌(Z=2.290，P=0.022，图2)。3 讨 论 结直肠癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，2022年最新癌症统计数据5显示其病死率居第2位。结直肠癌的发生、发展是多基因、多因素共同作用的结果。近年，分子生物学的发展提示结直肠癌变的主要通路有染色体不稳定与 MSI。MSI 于 1993 年首次在遗传性非息肉病性结直肠癌中发现，是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象6。最新指南及专家共识7-8指出：MSI是结直肠癌诊疗检测I类推荐生物学标志物，特别是临床考虑遗传性结直肠癌患者，建议常规进行错配修复表2 左、右半结肠癌MSI及KRAS基因突变比较Table 2 Comparison of MSI and KRAS gene mutations in the left and right colorectal cancer组别左半结肠右半结肠合计2Pn521202723MSI状态/例(%)MSS485(93.1)147(72.8)632(87.4)54.6170.001MSI36(6.9)55(27.2)91(12.6)KRAS基因突变/例(%)无288(55.3)116(57.4)404(55.9)0.2720.602有233(44.7)86(42.6)319(44.1)MSI：微卫星不稳定性；KRAS：Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物；MSS：微卫星稳定。ACB图1 PD-L1在结肠癌组织细胞中的表达(EnVision，400)Figure 1 Expression of PD-L1 in colorectal cancer histiocytes(EnVision,400)A:Negative expression of PD-L1;B:Tumor mesenchymal lymphocytes are positive for PD-L1;C:Tumor cell membrane PD-L1 are positive for PD-L1.PD-L1:Programmed death-ligand 1.151050P0.05PD-L1 联合阳性分数左半结肠癌 右半结肠癌图2 左、右半结肠癌患者PD-L1联合阳性分数比较Figure 2 Comparison of PD-L1 combined positive scores in the left and right colorectal cancerPD-L1:Programmed death-ligand 1.1122左、右半结肠癌PD-L1表达、MSI状态、KRAS突变及临床病理特征的差异 任贝贝，等缺陷(different mismatch repair,dMMR)/MSI状态检测以排除诊断。随着免疫学和分子生物学的发展，人们对肿瘤免疫耐受有了新的认识和了解，肿瘤的免疫治疗越来越受到重视。因此，探讨左、右半结肠癌临床病理特点及分子生物特征对结直肠癌患者的临床诊疗和预后评估等具有重要作用。本研究对左、右半结肠癌临床病理特征、MSI状态、KRAS 基因和 PD-L1 表达进行比较，发现右半结肠癌患者具有女性多发、浸润深度更深、分化更差的特点。右半结肠中胆汁酸代谢酶浓度较高，雌激素能促进肝对胆固醇的代谢9，更容易使具有强致癌作用的初级胆汁酸进入肠道，这可能是女性更易发生右半结肠癌的原因。从解剖学来看，右半结肠毛细血管网更丰富，因此肿瘤浸润深度可能会更深。既往研究10-11也发现：相比男性而言，女性有更高的右半结肠癌发生率，右半结肠癌相对于左半结肠癌分期更晚、分化更差、组织浸润更明显，更易发生淋巴结转移和血管侵犯。但本研究中左、右半结肠癌在年龄、淋巴转移、脉管癌栓、神经侵犯等方面差异均无统计学意义。本研究 MSI 的总发生率为 12.6%，右半结肠癌的MSI发生率显著高于左半结肠癌(27.2%vs 6.9%)，与以往的研究结论12一致。这表明左、右半结肠癌的分子生物学特征不同，支持左、右半结肠癌是2种 不 同 疾 病 的 观 点。EGFR 介 导 的 RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT等下游信号转导通路可持续激活导致肿瘤发生，此观点已得到广泛认可13。KRAS基因是RAS家族的重要成员，参与EGFR的信号转导，调控细胞生长、分化、增殖和存活。KRAS 基因突变被认为是结直肠癌发生的早期标志，近年来，KRAS 突变已成为潜在的肿瘤免疫治疗靶点及生物学标志物14。本组结直肠癌患者的 KRAS 基因总体突变率为 44.1%，略高于以往的相关研究15，左半结肠癌的KRAS突变率高于右半结肠癌，但无显著性差异，与朱凤伟等11的研究结果一致。但也有研究16发现KRAS基因突变好发于右半结肠，目前关于左、右半结肠癌KRAS基因突变率之间的差异研究结论不一，可能是检测试剂、检测方法或样本量不同等原因造成的。此外，本研究使用 SP263 抗体检测 PD-L1 在结直肠癌中的表达，结果显示右半结肠癌 PD-L1 的表达显著高于左半结肠癌。PD-L1的表达受多因素影响，目前关于左、右半结肠癌 PD-L1 表达的差异及机制结论不一，有待进一步研究。Rosenbaum等17发 现：结 直 肠 癌 中 PD-L1 的 表 达 与 MSI、BRAF突变、髓质形态和细胞毒性肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)相 关，且PD-L1 的高表达是 MSI 型结直肠癌的一个重要特征。本研究进一步分析也发现 PD-L1 在 MSI 型结直肠癌中的表达高于 MSS 型结直肠癌，证实了冯稳等18的研究结果。同时，dMMR/MSI-H 结直肠癌患者具有高密度 TILs 免疫微环境，可刺激上调免疫检查点分子的表达，包括 PD-1、PD-L1 等，从而平衡细胞毒性T淋巴细胞/1型辅助性T细胞的活 性 功 能，在 肿 瘤 微 环 境 中 制 造 免 疫 逃 避 状态19-20，这些发现为 dMMR/MSI-H 结直肠癌患者的免疫治疗提供了理论基础。此外，研究 PD-1/PD-L1 在 NK 细胞活化、杀伤肿瘤细胞效应中的作用，探讨其对NK细胞为代表的固有免疫应答和适应性免疫应答之间的调控与相关信号通路，可为恶性肿瘤精准免疫治疗提供新的方向21。最新研究22发现：激活KRAS可通过活性氧介导的FGFR1信号通路促进 PD-L1 的表达，也为探索肿瘤免疫逃 逸 机 制 提 供 了 新 思 路。研 究 PD-L1、KRAS、MSI 在结直肠癌中的状态将有利于预测免疫疗法的疗效，使更多的结直肠癌患者受益。本研究中，我们只观察到 PD-L1 在左、右半结肠癌中有显著差异，未能深入研究其机制，同时研究数据存在时间局限性，未来将进一步对患者进行随访并补充数据，深入分析 PD-L1、KRAS、MSI 在结直肠癌中的状态对生存预后的影响，为临床治疗提供更多的依据。综上所述，本研究发现左、右半结肠癌临床病理特征不尽相同，且 MSI 和 PD-L1 表达亦存在显著差异，表明左、右半结肠癌具有不同的生物学行为，进一步支持2种疾病的观点，也为结直肠癌的临床诊断、精准治疗以及预后评估提供了依据。利益冲突声明：作者声称无任何利益冲突。参考文献1刘宗超,李哲轩,张阳,等.2020全球癌症统计报告解读J.肿瘤综合治疗电子杂志,2021,7(2):1-14.https:/doi.org/10.12151/JMCM.2021.02-01.LIU Zongchao,LI Zhexuan,ZHANG Yang,et al.Interpretation on the report of global cancer statistics 2020J.Journal of Multidisciplinary Cancer Management.Electronic Version,2021,7(2):1-14.https:/doi.org/10.12151/JMCM.2021.02-01.1123临床与病理杂志,2023,43(6)http:/2Bufill JA.Colorectal cancer:evidence for distinct genetic categories based on proximal or distal tumor locationJ.Ann Intern Med,1990,113(10):779-788.https:/doi.org/10.7326/0003-4819-113-10-779.3缪康,张力.程序性死亡受体1及其配体1单克隆抗体抗肿瘤机制的研究进展J.中华内科杂志,2021,60(11):1005-1009.https:/doi.org/10.3760/112138-20210811-00546.MIAO Kang,ZHANG Li.Anti-tumor mechanism of anti-programmed cell death 1/programmed cell death-ligand 1 monoclonal antibodiesJ.Chinese Journal of Internal Medicine,2021,60(11):1005-1009.https:/doi.org/10.3760/112138-20210811-00546.4Nishimura CD,Pulanco 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