云香水仙WD40基因克隆及序列分析.pdf

第39卷第4期2023年8月山西大同大学学报（自然科学版）Journal of Shanxi Datong University(Natural Science Edition)Vol.39 No.4Aug.2023云香水仙WD40基因克隆及序列分析李欢1，2，3，陈晓静2，3*（1.蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030；2.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002；3.福建农林大学 园艺植物遗传育种研究所，福建 福州 350002）摘要：目的目的 探讨云香水仙WD40基因在花色形成中的作用。方法方法 基于前期的转录组数据，以云香水仙为材料，采用RT-PCR技术对WD40基因进行克隆，并结合Real-time PCR检测其在不同花期的表达水平。结果结果 克隆得到1个WD40基因，命名为NtWD40，开放阅读框长为1 020 bp，共编码339个氨基酸。同源性分析表明，云香水仙与拟南芥、苹果、矮牵牛及苜蓿的相似系数分别为68%、68%、68%和69%。Real-time PCR分析表明：始花期NtWD40的表达量较其他花期有明显差异。结论结论 NtWD40可能参与云香水仙类黄酮途径相关色素的合成。关键词：云香水仙；WD40；基因克隆；花色；qRT-PCR中图分类号：X503文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1674-0874.2023.04.020中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）是蒜科水仙属植物，是多花水仙（Narcissus tazetta L.）的一个变种。由于中国水仙品种较少、花色单一、育种资源匮乏等原因，传统育种方面进展较慢，改良中国水仙依然是广大研究者对水仙研究的重点之一1。转录因子（反式作用因子）是一类能与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合的蛋白质分子，主要作用是激活或抑制基因的转录效应2。常见的和花色调控相关的转录因子主要有 MYB、bHLH和 WD40三大类3。MYB根据 R基数量可分为 4个亚群，其中含量最多的为R2R3型MYB4。bHLH（ba-sic/helix-loop-helix）是植物中的第二大类转录因子，拟南芥中含有147个bHLH转录因子被分成21个亚族5。WD40 由 Fong 等6首次发现，van Nocker 和Ludwig7把拟南芥中的237个WD转录因子分为143个亚族。植物中，花青素生物合成的转录调控受MYB-bHLH-WD40（MBW）复 合 体 的 协 同 调 控8。如，拟南芥中 TTG1（WD40）与 bHLH 的互作有助于加强花青素的合成9。云香水仙（证书标号：认2012-34-1）为福建农林大学遗传育种研究所培育出来的一种多花水仙，其形态特征（花径较大，小花量大，繁殖容易且抗病强）、花色（副冠颜色较浅）、香气（香气特别浓）等与其它两色花主栽品种不同，在一定程度上丰富了中国水仙花资源。目前，伴随生物技术的发展，利用基因工程手段改善中国水仙花色已成为可能10。本研究以云香水仙为实验材料，通过对WD40进行基因克隆和序列分析，并对其不同花期表达量进行研究，以期为中国水仙花色改良提供部分理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料云香水仙（白色花瓣和黄色副冠）由福建农林大学遗传育种研究所提供。分别取花苞、花蕾、始花和盛花期的花朵，去掉花丝、花药和花柱，花瓣和副冠分别置于离心管中，液氮速冻，-80 保存1-2。1.2 实验方法1.2.1 总RNA的提取和反转录采用离心柱型多糖多酚RNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物限公司）分别提取云香水仙4个花期的花瓣与副冠的总 RNA。采用 Revert AidTM FirstStrand cDNA Synthesis Kit（购自 Fermenta）合成的cDNA用于3-RACE1-2。1.2.2 PCR引物的设计与合成根 据 转 录 组（NCBI SRA 数 控 库，登 录 号：SRR2477578 和 SRR2477579）已经获得的花色相关收稿日期：2023-03-02基金项目：蚌埠学院人才引进项目BBXY2020KYQD01；校企合作项目No.20223403060001作者简介：李欢（1988-），安徽阜阳人，博士，讲师，研究方向：花卉遗传育种。陈晓静（1954-），女，江苏扬州人，博士，教授，通信作者。E-mail：，文章编号：1674-0874（2023）04-0100-052023年转录因子序列设计特异性引物（表1）。表1 引物及其序列引物NtWD40-FNtWD40-RqNtWD40-FqNtWD40-RNtActinFNtActinR序列（5-3）CGTCTTCCGCAACCACAGTGTACCTCCTCACAGTCTCACCACCCCTTCCCTCTCCTTCTCCACCGCAGAATCATTGACCCTTGACCTTGCTGGGAGAGATGATGTCACGGACAATTTCACGC用途基因克隆荧光定量内参1.2.3 WD40开放阅读框的获得以云香水仙的cDNA为模板，采用NtWD40-F和NtWD40-R 为 上 下 游 引 物 扩 增 NtWD40 的 ORF。PCR扩增采用 25 mL反应体系（表 2）和 35 cycle、退火时间均为 90 s。凝胶电泳后回收目的片段，连接18-T载体，转化DH5（Escherichia coli），后测序鉴定目的片段1-2。表2 PCR反应体系/L组分模板Deionized H2O上游引物(10 M)下游引物(10 M)10Ex-Taq BufferdNTP Mix(2.5 mM)Ex-Taq(5U/L)体积1.018.30.50.52.52.00.21.2.4 序列拼接及生物信息学分析使用DNAMAN和Primer5.0进行引物设计和序列拼接。氨基酸多重序列比对和CDD功能区域分析使用NCBI中的BLASTX；氨基酸理化分析使用Ex-PASy-ProtParam tool；构 建 系 统 进 化 树 使 用MEGA5.05中的邻近相法 neighbor-joining tree；氨基酸信号肽预测使用SignalP 4.1Server；氨基酸跨膜预测使用 TMHMM Server v.2.0；氨基酸的亲疏水特性使用ProtScale；亚细胞定位使用Softberry1-2。1.2.5 实时荧光定量PCR反应实时荧光定量特异性引物见表 1 中的 qNt-WD40-F 和 qNtWD40-R。使用 20 L qRT-PCR 反应体 系：ddH2O 9.2 L；Premix ExTaqTM(2)8 L；PCR Forward 和 Reverse Primer(10 mol/L)各 0.4L；cDNA 模板 2.0 L。设定反应程序为：94 C 预变性 3 min，95 C 变性 15 s,60 C 退火 15 s，72 C分离 20 s1-2。反应结束后，分析融解曲线和扩增曲线并得到Ct值。采用2-CT法最终得到不同基因的相对表达量11。2 结果与分析2.1 NtWD40基因开放阅读框的获得以云香水仙RNA反转录成的cDNA为模板，使用特异引物进行PCR扩增。得到一条与预测相当的约为1 000 bp的片段（图1），开放阅读框1 020 bp，初步判断已经获得NtWD40基因的cDNA全长。图1 NtWD40基因的凝胶电泳图2.2 NtWD40蛋白生物信息学分析使用DNAMAN分析NtWD40基因序列，结果显示 NtWD40 共编码 339 个氨基酸。使用 ExPASy-ProtParam等在线工具推测WD40氨基酸基本理化性质（表3），结果显示为亲水性和酸性不稳定蛋白，等电点为4.73。二级结构中最多的为无规卷曲且-转角最少。该蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白。Nt-WD40蛋白跨膜螺旋数为0，预测其不属于跨膜蛋白。此外，亚细胞定位在线预测显示NtWD40位于细胞核的可能性较大。表3 NtWD40蛋白的理化性质预测值蛋白分子量（kD）等电点分子式GRAVY值不稳定指数Asp+GluArg+LysNtWD4037.274.73C1665H2552N448O509S9-0.20647.63924将 NtWD40 基因编码区的氨基酸序列在 NCBI的CDD上搜索，如图2，该基因属于典型的WD40 su-perfamily。对其开放阅读框所推导的氨基酸进行同源序列分析（图3），NtWD40同拟南芥的AtTTG1、苹果 的 MdTTG1、矮 牵 牛 的 PhAN11 及 苜 蓿 的 Mt-WD40-1的同源性分别为68%、68%、68%和69%。为李欢等：云香水仙WD40基因克隆及序列分析101山西大同大学学报(自然科学版)2023年了研究NtWD40蛋白的进化关系，使用MEGA5.05中的邻近相法 neighbor-joining tree 法构建了 NtWD40的系统发育树（图4），分析表明，云香水仙与玉米亲缘关系最近，处于同一分支，同属于单子叶植物，其次是双子叶植物大豆、百脉根等。矮牵牛和番茄同属茄科，苹果和沙梨同属蔷薇科，小心叶薯、橙红茑萝和大花牵牛同属旋花科，处于进化树的同一分支，此进化树分析同植物分类学基本一致。图2 NtWD40基因编码区的保守结构域图3 NtWD40氨基酸序列多重序列比对图4 NtWD40系统发育树1022023年2.3 NtWD40蛋白生物信息学分析随着云香水仙花朵的绽放，NtWD40在花苞、花蕾、始花和盛花期的转录水平表现为先上升后下降的趋势，始花期花瓣和副冠的相对表达量分别是花苞期花瓣和副冠的 5 倍和 8.1 倍（图 5）。在花苞期和花蕾期，NtWD40在花瓣中的表达量稍高于副冠，而始花期和盛花期副冠中NtWD40 表达量稍高于花瓣。相对表达量Y1，花苞期；Y2，花蕾期；Y3，始花期；Y4，盛花期；P，花瓣；C，副冠图5 NtWD40基因的表达分析3 讨论WD40 蛋白一般有 4 16 个串联的 WD40 基元，该高度保守的基元约由40个氨基酸残基组成，在不同的植物中高度保守12-13。WD40蛋白参与植物的多种生理活动，如参与植物的胚胎发育14、开花过程13、花的发育15和调控花青素的合成16等。本研究中，NtWD40推导的氨基酸同MtWD40-1、AtTTG1、MdTTG1和PhAN11的氨基酸序列同源比对表明，NtWD40 同样含有 4 个高度保守的 WD 基序（WD、FD、LD 和 WE）。研 究 表 明 MtWD40-117、AtTTG118、MdTTG119和 PhAN1120参与花青素的生物合成调控。因此，推测NtWD40可能参与云香水仙类黄酮及花青素的生物合成。此外，NtWD40 基因的荧光定量结果显示，Nt-WD40在云香水仙花苞期、花蕾期和始花期中呈上升趋势，这和花苞期副冠和花瓣的浅绿色至始花期的黄色和乳白色的表观相符合。盛花期NtWD40的表达量低于始花期，这和盛花期副冠和花瓣的颜色变浅相一致，因此推测NtWD40可能参与云香水仙类黄酮途径相关色素的合成。本研究的开展对中国水仙花色育种及品种改良提供了一定的基因资源和理论基础。参考文献1 李欢.多花水仙转录组分析及相关功能基因的研究 D.福州:福建农林大学，2016.2 李欢，何炎森，李科.多花水仙WRKY转录因子的克隆与序列分析 J.热带作物学报，2014，35（12）:2378-2383.3 BROUN P.Transcriptional control of flavonoid biosynthesis:A complex network of conserved regulators involved in multiple as-pects of differentiation in Arabidopsis J.Curr Opin Plant Biol，2005，8（3）:272-279.4 DUBOS C，STRACKE R，GROTEWOLD E.MYB transcription factors in Arabidopsis J.Trends Plant Sci，2010，15（10）:573-581.5 TOLEDO-ORTIZ G，HUQ E，QUAIL P H.The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family J.Plant Cell，2003，15（8）:1749-1770.6 FONG H K W，HURLEY J B，HOPKINS R S.Repetitive segmental structure of the transducin beta-subunit-homology with thecdc4 gene and identification of related messenger-rnas J.P Natl Acad Sci USA，1986，83（7）:2162-2166.7 VAN NOCKER S，LUDWIG P.The WD-repeat protein superfamily in Arabidopsis:conservation and divergence in structureand function J.BMC Genomics，2003，4:50.8 RAMSAY N A，GLOVER B J.MYB-bHLH-WD40 protein complex and the evolution of cellular diversity J.Trends PlantSci，2005，10（2）:63-70.9 WALKER A R，DAVISON P A，BOLOGNESI-WINFIELD A C.The TRANSPARENT TESTA GLABRA1 locus，which regu-lates trichome differentiation and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis，encodes a WD40 repeat protein J.Plant Cell，1999，11（7）:1337-1349.10 吴用，何炎森，李科.多花水仙 HDS基因 cDNA全长克隆与序列分析 J.热带作物学报，2015，36（10）:1825-1830.11 LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-CTmethod J.Methods，2001，25（4）:402-408.12 NEER E J，SCHMIDT C J，NAMBUDRIPAD R.The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins J.Nature，1994，371（6495）:297-300.13 杨红玉，张学琴.拟南芥WD40蛋白 J.植物生理学通讯，2008，14（5）:1025-1033.李欢等：云香水仙WD40基因克隆及序列分析103山西大同大学学报(自然科学版)2023年14 YAMAGISHI K，NAGATA N，YEE K M.TANMEI/EMB2757 encodes a WD repeat protein required for embryo developmentin Arabidopsis J.Plant Physiol，2005，139（1）:163-173.15 KINOSHITA T，HARADA J J，GOLDBERG R B.Polycomb repression of flowering during early plant development J.PNatl Acad ScI USA，2001，98（24）:14156-14161.16 YAO P F，ZHAO H X，LUO X P.Fagopyrum tataricum FtWD40 functions as a positive regulator of anthocyanin biosynthesisin transgenic tobacco J.J Plant Growth Regul，2017，36（3）:755-765.17 PANG Y Z，WENGER J P，SAATHOFF K.A WD40 repeat protein from Medicago truncatula is necessary for tissue-specificanthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis but not for trichome development J.Plant Physiol，2009，151（3）:1114-1129.18 陈湘瑜，郑国栋，黄金堂.拟南芥AtTTG1基因的克隆及用于转化花生的MAR调控表达载体构建 J.花生学报，2014，43（2）:1-6.19 AN X H，TIAN Y，CHEN K Q.The apple WD40 protein MdTTG1 interacts with bHLH but not MYB proteins to regulate an-thocyanin accumulation J.J Plant Physiol，2012，169（7）:710-717.20 DEVETTEN N，QUATTROCCHIO F，MOL J.The an11 locus controlling flower pigmentation in petunia encodes a novelWD-repeat protein conserved in yeast，plants，and animals J.Gene Dev，1997，11（11）:1422-1434.Cloning and Sequence Analysis of WD40 Gene from Yunxiang Narcissus tazetta L.LI Huan1,2,3,CHEN Xiao-jing2,3*（1.School of Food and Bio-engineering,Bengbu University,Bengbu Anhui,233030;2.School of Horticulture,Fijian Agriculture and Forestry University,Fuzhou Fujian,350002;3.Institute of Genetics and Breeding in Horticultural Plants,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou Fujian,350002）Abstract:Objective To explore the role of WD40 gene in flower color formation of Yunxiang Narcissus tazetta L.MethodBased on former transcriptome data,a WD40 gene named NtWD40 was cloned by RT-PCR with Yunxiang Narcissus tazetta L asthe material,and its expression level at different flowering stages was detected by real-time PC.Result A WD40 gene,named nt-wd40,was cloned and its open reading frame was 1020 BP long,encoding 339 amino acids.The amino acid sequence homologyanalysis showed that the similarity coefficients of Yunxiang Narcissus tazetta L.with Arabidopsis,apple,Petunia and alfalfa were68%,68%,68%and 69%,respectively.Real-time PCR results further showed that the relative expression of NtWD40 gene at theinitial flowering stage was significantly different from other flowering stages.Conclusion NtWD40 might be essential in the pig-ment synthesis correlated to the flavonoid pathway of Yunxiang Narcissus tazetta L.Key words:Yunxiang Narcissus tazetta L.;WD40;gene cloning;flower color;qRT-PCR责任编辑 杨德兵dents.Methods Centering on its scientific research progress and cutting-edge information on prevention and control of SARS-CoV-2,We took the core knowledge of Medical Microbiology such as its discovery,naming,biological shape,pathogenesis,exper-imental diagnosis,prevention and treatment as the main line,extended and expanded it in depth and breadth,organically integratedthe professional knowledge of relevant medical disciplines and clinical practice.On this basis,we conducted problem orientedteaching design and integrated the curriculum ideological and political education into it to form a case-based integrated thematicteaching that focuses on microbiology knowledge and integrates multi-disciplinary knowledge and discipline development frontier.Results The Integrated thematic teaching practice has been welcomed and recognized by students and achieved positive teachingresults.Conclusion The integrated thematic teaching practice with SARS-CoV-2 as a case makes a new attempt in teaching meth-ods and forms.It is not only beneficial to the study of medical microbiology professional knowledge,but also can better cultivatemedical students clinical thinking,innovative thinking,scientific research thinking,and promote the comprehensive developmentof students comprehensive quality.Key words:SARS-CoV-2;case-based teaching;problem-based learning;integrated teaching;thematic teaching责任编辑 杨德兵（上接第99页）104