孕酮在颗粒细胞中通过cAMP_PKA信号通路影响卵母细胞发育.pdf

宁夏医科大学学报4缘卷在进行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）时，选择合适的促排卵方案是至关重要的。促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）拮抗剂已被广泛应用于促排卵，这些药物可以竞争性地与 GnRH 受体结合，抑制垂体分泌促性腺激素（Gn），快速抑制多卵泡发育引起的促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）峰，避免过早排卵1。高孕激素状态下促排卵（progestin primed o原varian stimulation，PPOS）方案是一种新的卵巢刺激方案，可通过孕激素阻断 LH 激增，还可联合促性腺激素促排卵，获得优质胚胎和满意的临床结局2。研究3-4表明，低孕酮促进小鼠卵泡发育，而高孕酮则会抑制卵泡发育；在灵长类动物中，黄体酮可以抑制恒河猴窦卵泡生长。卵泡刺激素受体（follicle stimulating hormonereceptor，FSHR）属于 G 蛋白偶联受体（GPCRs）超家族，FSHR 主要表达于支持细胞和颗粒细胞的细胞膜上。在卵泡期，卵泡刺激素（FSH）用于颗粒细胞的细胞膜，诱导 FSHR 表达通过下游通路cAMP/PKA、PI3K/AKT 参与卵巢活动，包括类固醇生成、细胞增殖和凋亡5。卵泡液周围的许多生长因子对卵泡的生长和发育起着至关重要的作用。干细胞因子（stem cell factor，SCF）是一种在全身各种组织中持续表达的生长因子。在卵泡期，SCF 主要在颗粒细胞中分泌，影响卵泡募集和发育。SCF 可与其受体 c-Kit 结合，激活 PI3K/AKT、MAPK 等通路，还可被 cAMP/PKA 信号通路激活，其启动子与 cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）结合启动转录，共同与其他生长因子调节卵泡生长和分化6。本研究旨在探究高孕酮是否可下调颗粒细胞 FSHR，并通过 cAMP/PKA 通路下调 SCF 的表达而影响颗粒细胞的功能，从而影响卵泡的生长发育。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞来源实验所用人卵巢颗粒细胞（human ovarian granulosa cell line，KGN）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。1.1.2主要试剂孕激素（Progesterone 批号 57-83-0，纯度 98%）购自上海麦克林生化科技有限公司；DMEM/F12 培养基、胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）、硫酸盐缓冲液均购自以色列 BI 公司；全 RNA 微量提取试剂盒购自美国 AxyGEN收稿日期：2022-10-24基金项目：宁夏回族自治区卫生健康系统科研课题项目（2022-NWKY-058）作者简介：沈亚楠（1997），女，在读硕士研究生，研究方向：生殖内分泌。通信作者：胡蓉（1974），女，博士，主任医师，研究方向：生殖内分泌。E-mail：孕酮在颗粒细胞中通过 cAMP/PKA 信号通路影响卵母细胞发育沈亚楠1，季贵义1，王进芳2，胡蓉3（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院产科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院生殖医学中心，银川750004）摘要：目的探究孕酮在颗粒细胞中影响卵母细胞发育的分子机制。方法将人卵巢颗粒细胞（KGN）用不同浓度孕酮（P4）（0、1 000、2 000、3 000 ng mL-1）处理之后，RT-PCR 和 Western blot 法检测不同浓度 P4 处理后卵泡刺激素受体（FSHR）和干细胞因子（SCF）的表达情况；用 rFSH、H-89、forskolin、forskolin+H-89、P4+H-89 和 P4分别处理 KGN 细胞后，RT-PCR 和 Western blot 法检测 SCF 的基因及蛋白表达情况；CCK-8 法检测不同浓度P4 处理后的细胞存活率；Western blot 法检测不同浓度 P4 处理后 Caspase3、Bcl-2、Bax 相关凋亡蛋白的表达情况。结果用不同浓度 P4（0、1 000、2 000、3 000 ng mL-1）处理之后，FSHR 和 SCF 的基因和蛋白的相对表达量均下降（P均0.05）。用 rFSH、H-89、forskolin、forskolin+H-89、P4+H-89 和 P4 分别处理 KGN 细胞后，显示 P4 可以下调 forskolin 诱导的 SCF 的表达。P4 抑制颗粒细胞系 KGN 细胞的存活率，并促进 Caspase3、Bcl-2、Bax 相关凋亡蛋白的表达。结论P4 通过 cAMP/PKA 通路影响颗粒细胞中 SCF 的表达，并且抑制细胞的存活，促进细胞凋亡。关键词：孕酮；卵泡刺激素受体；卵母细胞中图分类号：R339.2文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.010第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University文章编号：1674-6309（2023）06-600-05论著600窑窑6期公司；逆转录试剂盒和荧光定量 PCR 试剂盒购自 TaKaRa 宝日医生物技术（北京）有限公司；鼠抗 Bax、兔抗 Bcl-2、兔抗 Caspase3、兔抗 茁-actin、HRP 标记山羊抗兔 IgG（HRP-IgG）和山羊抗鼠IgG（HRP-IgG）均购自美国 Proteintech 公司；兔抗 FSHR、兔抗 SCF、forskolin、H-89 均购自美国Abcam 公司；ECL 化学发光液、CCK-8 试剂（10 滋L/孔）、全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2方法1.2.1细胞培养KGN 细胞以适量浓度接种于培养瓶中，培养于 DMEM/F12 完全培养基（含10%胎牛血清和 1%青霉素链霉素双抗）中，放置于37 益、5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞呈贴壁状态生长，每周传代 1耀2 次，在显微镜下观察细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化传代。取 2 代以后对数期稳定状态的细胞进行后续实验。1.2.2RT-PCR 检测使用全 RNA 微量提取试剂盒制备 RNA 样品。按照日本 TaKaRa 公司的逆转录试剂说明书将 RNA 逆转录为 cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq 按照制造商的说明进行 PCR。以 茁-actin 为内参基因，使用 ABI 7500 FAST 荧光定量 PCR 仪进行实时荧光定量 PCR。使用2-驻驻Ct法计算基因相对表达水平。每组设置 3 个复孔，PCR 引物序列见表 1。表 1RT-PCR 引物序列引物引物序列FSHR上游：GGAGGTGATAGAGGCAGATG下游：GGGTTGATGTAGAGCAGGTSCF上游：TCATTCAAGAGCCCAGAACC下游：TTCAGATGCCACTACAAAGTCCA-actin上游：GGCACCACACCTTCTACAAT下游：CGTCATACTCCTGCTTGCTG1.2.3Western blot 检测收集培养的各组 KGN细胞制备蛋白样品，使用二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白提取试剂盒提取全蛋白并测定蛋白浓度。制备 5%的浓缩胶和 10%的分离胶，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，用5%的脱脂牛奶封闭 1.5 h，加入一抗后在 4 益摇床上孵育过夜，TBST 洗涤残留一抗后加入二抗孵育 1 h，根据增强型化学发光（enhanced chemi原luminescence，ECL）液说明书，配制 1颐1 的发光液，凝胶成像系统观察结果，Image J 分析条带灰度值，以 茁-actin 为内参。1.2.4CCK-8 检测使用 CCK-8 法测定细胞活力和增殖。将处于对数生长期的 KGN 细胞用胰酶消化，以 4.5伊103个/孔的密度接种于 100 滋L 培养基中，置于 96 孔微孔板中培养，每组设置 5 个复孔，均以重组卵泡刺激素（rFSH）处理细胞24 h，然后用不同浓度的孕酮（P4）（0、1 000、2 000、3 000 ng mL-1）处理细胞 24、48、72、96 h。在细胞培养每个时间点后，每孔加入 CCK-8 试剂10 滋L，继续培养 1.5 h。所有实验均分 3 份进行。使用酶标仪在 450 nm 处分析吸光度。以无细胞孔作为空白对照组。1.3统计学方法实验数据用 GraphPad Prism 7.0 统计学软件进行分析，实验结果至少重复 3 次，并以均数依标准差（x依s）表示，两组间比较采用成组 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1P4 对 KGN 细胞 FSHR、SCF mRNA 表达量的影响在 KGN 细胞中，使用不同浓度 P4 处理细胞后，RT-PCR 检测不同组的 FSHR、SCF mRNA 表达量。与 0 ngmL-1组相比，处理组（2 000、3 000 ng mL-1P4）的 FSHR、SCF mRNA 表达均下降（P 均约0.05），见图 1。A.FSHR；B.SCF；与对照组比较*P0.05。图 1P4 对 KGN 细胞 FSHR、SCF mRNA 表达量的影响A沈亚楠，等.孕酮在颗粒细胞中通过cAMP/PKA信号通路影响卵母细胞发育B1.51.00.50.01.51.00.50.0*P4/（ng mL-1）P4/（ng mL-1）01 0002 0003 00001 0002 0003 000601窑窑宁夏医科大学学报4缘卷2.2P4 对 KGN 细胞 FSHR、SCF 相对蛋白表达量的影响Western blot 检测不同组的 FSHR、SCF 蛋白表达量，结果见图 2。与 0 ng mL-1组相比，处理组（2 000、3 000 ng mL-1P4）的 FSHR、SCF 的蛋白表达量均下降（P 均约0.05）。A.Western blot 实验灰度值分析图；B、C.蛋白相对表达量统计分析图；与对照组比较*P0.05。图 2P4 对 KGN 细胞 FSHR、SCF 相对蛋白表达量的影响2.3P4 通过调控 cAMP/PKA 信号通路影响 SCF的表达分别用 rFSH、forskolin（cAMP/PKA 信号通路激动剂）、H-89（cAMP/PKA 信号通路抑制剂）、P4单独或联合处理各组细胞后，分析 SCF 的 mRNA和蛋白表达。用 RT-PCR 检测 SCF mRNA 的表达水平，结果见图 3A。首先单独使用 rFSH 处理细胞后，可观察到 SCF 的 mRNA 表达。在使用 rFSH处理细胞基础上，用 forskolin 处理后，SCF mRNA表达水平增加（P约0.05）；用抑制剂 H-89 处理后SCF mRNA 表达水平下降（P约0.05）；使用 P4 时，SCF mRNA 表达水平降低（P约0.05）；在 H-89 中加入 P4 后，SCF 的 mRNA 表达水平降低（P约0.05）；在 forskolin 组中加入 P4 后，SCF 的 mRNA 表达水平低于单独使用 forskolin 组（P约0.05）。Western blot 实验检测 SCF 相对蛋白的表达，结果见图 3B。使用 rFSH 处理细胞后，可观察到 SCF 的蛋白表达。在使用 rFSH 处理细胞基础上，使用激动剂 forskolin 后，SCF 蛋白表达水平增加（P约0.05），同时加入 P4 处理之后，SCF 蛋白A.RT-PCR 实验；B.Western blot 实验；与 rFSH（+）组比较*P0.05；与 forskolin（+）组比较#P0.05。图 3P4 通过调控 cAMP/PKA 信号通路影响 SCF 的表达*BASCF茁-actin*#*2.52.01.51.00.50.02.52.01.51.00.50.0+-rFSHforskolinH-89P4+-+-+-+-+-+-+-rFSHforskolinH-89P4+-+-+-+-+-+-+*FHSRSCF茁-actinP4/（ng mL-1）P4/（ng mL-1）*CBA1.51.00.50.01.51.00.50.0P4/（ng mL-1）01 0002 0003 00001 0002 0003 00001 0002 0003 000602窑窑6期表达水平降低（P约0.05）；相反，使用拮抗剂 H-89后，SCF 蛋白的表达水平降低（P约0.05），使用 P4时，SCF 蛋白表达水平降低（P约0.05），同时使用H-89 和 P4 时，SCF 蛋白表达水平均降低（P 均约0.05）。2.4P4 对 KGN 细胞存活率的影响CCK-8 检测结果显示。使用 P4 处理之后，与对照组相比，细胞处理 24 h 后，处理组（2 000、3 000 ng mL-1P4）细胞存活率随浓度的增加而下降，处理 48、72、96 h 后，处理组（1 000、2 000、3 000 ng mL-1P4）细胞存活率均低于对照组（P均约0.05）。在同样药物浓度干预后，与 24 h 相比，1 000、2 000 ng mL-1P4 处理组 96 h 的细胞存活率降低，3 000 ng mL-1P4 处理组 48、72、96 h 的细胞存活率均下降（P 均约0.05），见图 4。A.Western blot 实验灰度值分析图；B.蛋白相对表达量统计分析图；与 0 ng mL-1组比较*P0.05。图 5P4 对 KGN 细胞中细胞凋亡相关蛋白表达量的影响2.5P4 对 KGN 细胞中 Caspase3、Bax、Bcl-2 蛋白表达量的影响与对照组相比，处理组（3 000 ng mL-1P4）Caspase3、Bax 表达升高，Bcl-2 表达降低，Bcl-2/Bax 表达降低（P 均约0.05），见图5。3 讨论控制性促排卵（COH）是使用药物诱导多个卵泡的生长、发育和成熟，获得一定数量的优质卵母细胞7。近年来，一种新的 PPOS 方案，即从卵泡的早期阶段开始口服外源性黄体酮，在控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）期间与 Gn 一起使用，被越来越多地应用于卵巢储备功能差、月经周期紊乱或其他紊乱的患者中，以获得有效胚胎8。因此，它可以用作 GnRH0 ng mL-11 000 ng mL-12 000 ng mL-13 000 ng mL-11251007550250*吟吟吟吟 吟吟 吟24487296沈亚楠，等.孕酮在颗粒细胞中通过cAMP/PKA信号通路影响卵母细胞发育时间/h与 0 ng mL-1组比较*P0.05，*P0.01；与 24 h 比较P0.05，P0.01。图 4P4 对 KGN 细胞存活率的影响ABCCaspase 3BaxBcl-2茁-actinP4/（ng mL-1）2.52.01.51.00.50.01.51.00.50.0P4/（ng mL-1）*0 ng mL-11 000 ng mL-12 000 ng mL-13 000 ng mL-1Caspase 3BaxBcl-201 0002 0003 00001 0002 0003 000603窑窑宁夏医科大学学报4缘卷类似物常规治疗的替代方案，但高剂量孕激素的临床效果尚不清楚。研究9发现，接受 PPOS 方案的患者其获卵数、成熟卵泡数和 2PN 数均减少。通过体外细胞培养，本课题组发现，接受 P4 刺激的 KGN 细胞中 FSHR 和 SCF 表达下降。因此，推测高浓度孕酮可能影响颗粒细胞的功能，进而影响卵泡阶段的发育和成熟机制。已有研究10证实 FSH 可以调控 FSHR mRNA的表达，FSH 与其膜受体结合后，性腺细胞中FSH-FSHR 下游通路激活的信号通路对哺乳动物的生殖细胞发育和繁殖具有重要作用。在颗粒细胞中，FSH 与 FSHR 结合，激活与 FSHR 偶联的 G 蛋白，并通过 cAMP 激活信号通路促进类固醇合成酶的转录，这是配子生长发育所必需的11。SCF 的表达与卵泡发育和成熟有关，说明孕酮可以通过 cAMP/PKA 通路负调控 FSHR 和 SCF 的表达。CCK-8 结果显示，不同浓度孕激素刺激后，颗粒细胞的细胞活性受抑制并且促凋亡因子的表达增加。SCF 在卵泡周围颗粒细胞中表达降低，影响早期卵泡的发育和生长12。人颗粒细胞和黄体细胞的寿命取决于它们暴露于促进细胞活力增长还是诱导细胞凋亡的因素。相反，不同大小的卵泡以及黄体细胞的颗粒细胞的活力由生长因子和激素维持，颗粒细胞的凋亡可直接影响卵泡的生长13，最终发展为闭锁卵泡，这可能是本研究中发现 PPOS 方案中卵泡质量及数量不佳的原因。综上所述，孕酮通过 FSHR 下游 cAMP/PKA通路调节 SCF，影响颗粒细胞的功能，进而影响卵泡的数量和质量，这可能是 PPOS 方案获得的卵母细胞数量不足的原因。高剂量孕酮对卵泡发育和成熟具有局部作用。为了更好地了解孕酮对FSHR 的影响，还需要进一步深入研究。参考文献：1 Albano C，Smitz J，Camus M，et al.Hormonal profileduring the follicular phase in cycles stimulated with acombination of human menopausal gonadotrophin andgonadotrophin-releasing hormone antagonist（Cetrore原lix）J.Hum Reprod，1996，11（10）：2114-2118.2 Massin N.New stimulation regimens：endogenous andexogenous progesterone use to block the LH surgeduring ovarian stimulation for IVF J.Hum ReprodUpdate，2017，23（2）：211-220.3 Komatsu K，Masubuchi S.The concentration-depen原dent effect of progesterone on follicle growth in themouse ovary J.J Reprod Dev，2017，63（3）：271-277.4 Yuan XH，Yang CR，Wang XN，et al.Progesteronemaintains the status of granulosa cells and slows folli原cle development partly through PGRMC1 J.J CellPhysiol，2018，234（1）：709-720.5 Casarini L，Lazzaretti C，Paradiso E，et al.Membraneestrogen receptor（GPER）and follicle-stimulating hor原mone receptor（FSHR）heteromeric complexes promotehuman ovarian follicle survival J.i Science，2020，23（12）：101812.6 Fu YX，Wang FM，Ou-Yang XE，et al.Anti-M俟lleri原an hormone regulates stem cell factor via cAMP/PKAsignaling pathway in human granulosa cells by inhibit原ing the phosphorylation of CREB J.Reprod Sci，2020，27（1）：325-333.7 Racca A，Drakopoulos P，Neves AR，et al.Current ther原apeutic options for controlled ovarian stimulation inassisted reproductive technology J.Drugs，2020，80（10）：973-994.8 赵敏，何玮，张耀.高孕激素状态下促排卵方案在卵巢低反应患者体外受精-胚胎移植临床应用中的研究进展 J.浙江医学，2021，43（13）：1475-1478.9 Long H，Yu W，Yu S，et al.Progesterone affects clinicoocyte yields by coordinating with follicle stimulatinghormone via PI3K/AKT and MAPK pathways J.J AdvRes，2021，33：189-199.10 Casarini L，Cr佴pieux P.Molecular Mechanisms ofAction of FSH J.Front Endocrinol（Lausanne），2019，10：305.11 Conti M.Specificity of the cyclic adenosine 3，5-monophosphate signal in granulosa cell function J.Biol Reprod，2002，67（6）：1653-1661.12 Sasson R，Amsterdam A.Stimulation of apoptosis inhuman granulosa cells from in vitro fertilization pa原tients and its prevention by dexamethasone：involve原ment of cell contact and bcl-2 expression J.J ClinEndocrinol Metab，2002，87（7）：3441-3451.13 Lu N，Li M，Lei H，et al.Butyric acid regulates pro原gesterone and estradiol secretion via cAMP signalingpathway in porcine granulosa cellsJ.J SteroidBiochem Mol Biol，2017，172：89-97.（责任编辑：刘瑛）（下转第 611 页）604窑窑6期Progesterone Affects Oocyte Development Through cAMP/PKA SignalingPathway in Granulosa CellsSHEN Ya nan1，JI Guiyi1，WANG Jinfang2，HU Rong3（1.College of Clinical Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；2.Department ofObstetric，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；3.ReproductiveMedicine Center，the General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China）Abstract：ObjectiveTo explore the molecular mechanism of progesterone affecting oocyte development ingranulosa cells.MethodsHuman ovarian granulosa cell line（KGN）were treated with different concentrations ofP4（0，1 000，2 000，3 000 ngmL-1）expression of follicle stimulating hormone receptor（FSHR）and stemcell factor（SCF）was detected by RT-PCR and Western blot.KGN cells were treated with rFSH，H-89，forskolin，forskolin+H-89，P4+H-89 and P4，respectively.The expression of SCF mRNA and protein was detect-ed by RT-PCR and Western blot.The cell viability treated with different concentrations of P4 was detected byCCK8 assay.Western blot was used to detect the expression of Caspase3，Bcl-2，and Bax-related apoptotic pro-teins after different concentrations of P4 treatment.ResultsThe relative expression levels of FSHR and SCFgenes and proteins decreased after treatment with different concentrations of P4（0，1 000，2 000，3 000 ng mL-1）（P all0.05）.After KGN cells were treated with rFSH，H-89，forskolin，forskolin+H-89，P4+H-89 and P4，re-spectively，P4 down-regulated forskolin-induced SCF expression.P4 inhibited the cell viability of KGN cells andpromoted the expression of Caspase3，Bcl-2，and Bax-related apoptotic proteins.ConclusionP4 affects the ex-pression of SCF in granulosa cells through cAMP/PKA pathway，inhibits cell survival and promotes apoptosis.Key words：progesterone；follicle stimulating hormone receptor；oocytewere given intragastric administration of equal volume of normal saline every day.The changes in EEG of rats ineach group were monitored，and the seizures were scored by Racine.The rats were sacrificed 2 weeks later.Hematoxylin（HE）staining was used to detect pathological changes in the prefrontal cortex and hippocampus ofbrain tissue，Nissl staining was used to detect changes in neurons in the hippocampus，and Western blot wasused to detect inflammation（IL-1，IL-4，TNF-）and autophagy related proteins（Beclin-1，P62）.ResultsCompared with the sham group，the EEG in the PTE group showed a high-point waveform，and the pathologicalmorphology of the brain tissue and neuron damage were aggravated.Nissl staining showed that the neurons andNissl bodies in the hippocampus area decreased，and the inflammatory factors IL-1，IL-4 and TNF-in-creased.And serum autophagy protein Beclin-1 decreased，P62 increased（P all0.05）.Compared with the PTEgroup，the pathological damage of brain tissue in the everolimus group was alleviated，Nissl staining showed in-creased neurons and Nissl bodies，inflammatory factors IL-1，IL-4，TNF-decreased，autophagy proteinBeclin-1 increased，P62 decreased（P all0.05）.ConclusionEverolimus can significantly improve brain tis-sue damage and restore neurons in PTE rats，and the mechanism may be related to promoting autophagy and re-ducing inflammation levels.Key words：post-traumatic epilepsy；everolimus；autophagy（上接第 604 页）冯岩，等.依维莫司激活自噬缓解氯化亚铁诱导创伤性癫痫611窑窑