玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及m6A甲基化修饰相关基因表达的影响.pdf

目的 本文旨在探究玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞的毒性作用 方法 用处理湖羊 通过法检测细胞增殖情况 和 分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化 结结果果 与对照组相比 处理组 活性和增殖数量极显著下降(.)细胞增殖相关基因 及其蛋白表达水平均极显著下降(.)促凋亡基因表达水平(、.、.)均显著升高相对应蛋白表达水平(、.)极显著升高抗凋亡基因 及蛋白表达水平显著降低(.)氧化应激相关基因相对表达水平(.、.)显著或极显著上升其相关蛋白表达水平(.)极显著上升 相关基因 的相对表达水平显著降低(.)和 水平极显著升高(.)水平显著升高(.)结结论论 可抑制湖羊 增殖促进湖羊 凋亡导致 发生氧化损伤产生毒性作用且其毒性作用可能跟 甲基化修饰相关关键词:玉米赤霉烯酮湖羊睾丸间质细胞增殖凋亡氧化应激 甲基化修饰中图分类号:.文献标志码:文章编号:()(.):()().(.).(.).(.)(.).(.).(.)(.).(.)(.)(.).:第 期刘亮等:玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及 甲基化修饰相关基因表达的影响玉米赤霉烯酮()是霉菌毒素之一是由镰刀菌属的真菌产生的次生有毒代谢产物对动物具有类雌激素样作用 对谷类作物的污染风险最高在动物饲料中的低水平污染非常普遍而这一霉菌毒素在很低的剂量下即可影响动物健康其中最严重的是产生生殖毒性影响生殖健康导致家畜的生殖障碍 近年来的一些研究表明不同剂量的 在不同类型的细胞中具有不同的毒性机制 等的研究表明不同剂量 处理导致雄性异常精子数量显著增加活精子数量显著减少 雄性动物睾丸中的睾丸间质细胞()负责产生雄激素在雄性发育和生殖中起主要作用任何影响 功能和形态的毒素都可能导致生育能力不足或不育 因此 对雄性动物生殖系统包括对 的毒害作用已引起越来越多的关注甲基腺苷()是哺乳动物 最丰富的 修饰 已有研究表明 甲基化修饰在精子形成过程中起着重要作用其异常会使雄性生殖系统功能障碍 甲基化修饰动态调控在甲基转移酶()、甲基转移酶()、去甲基化酶 同系物()与 结合蛋白作用下完成 研究表明 的缺乏引起 水平升高导致小鼠睾丸功能障碍精子发生异常和凋亡生育能力受损目前国内外在 对雄性动物生殖系统及功能的毒性作用研究大多是在猪或小鼠等单胃动物上开展而对反刍动物的影响研究报道不多特别是 对湖羊等反刍家畜的 增殖和凋亡的影响研究未见报道 的生殖毒性是否通过影响睾丸中 表观遗传修饰而产生仍未可知 因此为进一步探索 对雄性反刍动物的生殖系统的影响本试验以湖羊 为研究对象通过检测 对细胞的增殖、凋亡以及氧化应激的影响探讨 的生殖毒性并通过检测 甲基化修饰相关基因表达情况探讨 对湖羊 表观遗传修饰的影响为湖羊生产中进行 毒性防控提供理论基础 材料与方法.细胞试验所用湖羊睾丸间质细胞()从 月龄雄性湖羊阉割所得的睾丸组织中分离获得所选湖羊健康、体况良好由启东瑞鹏牧业有限公司提供.主要试剂与材料玉米赤霉烯酮购自美国 公司胎牛血清和/培养基购自美国 公司 购自美国 公司细胞增殖检测()试剂盒购自江苏凯基生物公司 细胞检测试剂盒购自日本 公司反转录试剂盒购自南京诺维赞公司.细胞培养与试验分组用完全培养基(/含 胎牛血清青霉素链霉素混合液)培养 设置对照组(组加 )和 个试验组(分别加含、的.)每组设置 个重复 将所有细胞置于 、条件下培养 后检测细胞活性及凋亡相关基因 表达情况最终确定 试验浓度后进行试验.法检测细胞存活率用 完全培养基稀释 试剂至工作浓度 移除 孔板内试验处理后的培养基添加 工作浓度的 试剂溶液 培养 在 处用微孔板读取器测量光密度值.法检测细胞增殖用完全培养基调整培养后的 密度以每孔 细胞接种于 孔板进行 标记 前期进行预试验确定加入 的浓度为 培养箱孵育 去除培养基后每孔加 中性多聚甲醛固定 去除固定液后每孔加入 甘氨酸溶液室温孵育(中和固定液)洗涤细胞(每孔 含 的 次)去除洗涤液后每孔加 .室温孵育 每孔加入 反应混合物室温避光孵育 每孔加入.溶液室温避光孵育 进行核染色 使用荧光显微镜检测并统计分析 阳性细胞比例.检测细胞增殖与凋亡、氧化应激及 甲基化修饰相关基因的表达使用 法提取 总 检测 均一性后使用反转录试剂盒进行反转录合成 每个基因设置 个重复以 为内参基因 引物序列如表 所示 以反转录 为模板进行南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 反应体系():上、下游引物各.补加 .反应程序:预变性 变性 退火 个循环 采用 计算相关基因的相对表达水平表 引物序列 目的基因 引物对序列 ()产物长度/登录号 ./././././././././././././././.注:同系物 脱甲基酶基因 :甲基转移酶样 基因 :甲基转移酶样蛋白 基因 :包含区域 基因 :甲基腺苷 结合蛋白 基因 :增殖细胞核抗原基因 :相关 蛋白基因 :肿瘤蛋白 基因 :过氧化氢酶基因 :超氧化物歧化酶基因 :谷胱甘肽过氧化物酶基因 :肌动蛋白 基因 .检测细胞增殖、凋亡及氧化应激相关蛋白表达用放射性免疫沉淀法使用蛋白裂解液 含苯甲基磺酰氟()和磷酸酶抑制剂各 和 提取 组湖羊 总蛋白 用 法检测蛋白浓度后在 、的条件下进行蛋白变性再在 恒定电压下进行 电泳 蛋白上样量 蛋白大小指示标记物()(变性后蛋白标准样品前、后都添加)用转膜仪 恒压转膜 用封闭液(脱脂奶粉)常温下封闭 封闭完成后用 溶液洗 次加一抗 下孵育过夜 洗 加二抗室温下孵育 洗 使用显影液孵育后显影拍照 使用 软件对条带进行灰度分析 试验所用抗体信息见表 表 抗体相关信息 抗体名称 货号 .来源 稀释比例 ()()().数据的处理及统计分析每个试验重复 次利用 .统计软件对试验数据进行单因素方差分析和差异显著性检验所有结果均用平均数标准差表示 结果与分析.暴露对湖羊 活性及凋亡相关基因表达的影响如图 所示随着 浓度的升高湖羊 活性逐渐降低 与对照组()相比 处理的湖羊 活性极显著降低且最低(.)在 和 处理下 的 第 期刘亮等:玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及 甲基化修饰相关基因表达的影响 基因的相对表达水平与对照组相比显著下降(.)其中 处理 相对表达水平最低 处理时 基因的相对表达水平与对照组相比极显著上升(.)因此确定 进行后续试验图 玉米赤霉烯酮()暴露对间质细胞()活性及凋亡相关基因表达的影响 ()().:对照组 .下同 .图 ()处理对湖羊 增殖及相关基因和蛋白表达的影响 ().试验结果(蓝色为细胞核红色为 阳性细胞)().不同处理 阳性细胞比例 .增殖相关基因 的相对表达情况 、.增殖相关蛋白 相对表达情况 .对湖羊 增殖及相关基因表达的影响为了探讨 对湖羊 增殖的影响采用 法检测湖羊 增殖情况 结果如图、所示:处理组细胞增殖数量极显著小于对照组(.)通过 和 法检测湖羊 的 基因和 蛋白表达情况 结果如图、所示:结果如图 和、所示:与对照组相比 处理组 基因相对表达水平和 蛋白相对表达水平均极显著降低(.)南 京 农 业 大 学 学 报第 卷.对湖羊 凋亡的影响为了探讨 对湖羊 凋亡的影响用 和 法检测湖羊 凋亡相关基因及其蛋白相对表达水平 结果如图 所示:与对照组相比 处理组促凋亡相关基因 和 相对表达水平极显著升高(.)和 基因相对表达水平显著升高(.)抗凋亡基因 相对表达水平显著降低(.)和 蛋白相对表达水平极显著升高(.)蛋白表达水平、/比值显著降低(.)表明 通过调控凋亡相关基因 和蛋白表达促进湖羊 凋亡的发生图 ()处理对湖羊 凋亡的影响 ().湖羊 促凋亡基因、和抗凋亡基因 的相对表达情况 、.湖羊 促凋亡蛋白、()和抗凋亡蛋白 及/的相对表达情况 ()/.对湖羊 氧化应激的影响采用 检测湖羊 氧化应激相关基因、相对表达情况(图 和)处理组 基因相对表达水平显著高于对照组(.)和 的相对表达水平极显著高于对照组(.)采用 法检测湖羊 氧化应激相关蛋白 表达情况结果如图、所示:与对照组相比 处理组 蛋白表达水平极显著升高(.)图 ()处理对湖羊 氧化应激相关基因和蛋白表达的影响 ().氧化应激相关基因、的相对表达情况 、.蛋白相对表达情况 .对湖羊 的 甲基化修饰相关基因表达的影响 检测湖羊 甲基化修饰相关基因表达结果(图)显示:与对照组相比 处理组湖 第 期刘亮等:玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及 甲基化修饰相关基因表达的影响羊 的 和 基因相对表达水平极显著升高(.)基因相对表达水平显著升高(.)基因相对表达水平显著降低(.)基因相对表达水平显著升高(.)图 ()处理下与 甲基化修饰相关基因的相对表达水平 ()讨论 具有类雌激素样作用对动物生殖系统具有很大的毒害作用能导致雄性动物生殖器官损伤、血清睾酮水平下降以及精子数量和质量下降 而体外培养的睾丸间质细胞可以用来检测 对雄性动物生殖系统的毒性 等对鼠的 睾丸间质细胞系的研究发现 处理可降低 的活率在本研究中通过 法检测发现 会造成湖羊 活性降低 检测显示 会减少湖羊 增殖并抑制与细胞增殖相关基因 的表达这些结果均说明了 会抑制湖羊 的增殖 这与 等用高浓度 处理大鼠 细胞和 等在猪卵泡上的研究结果一致细胞凋亡是在进化过程中保存下来的先天过程它允许细胞系统灭活破坏和处置自身成分从而导致细胞最终死亡 基因家族、基因家族以及 基因均跟细胞凋亡有关其中 是抗凋亡基因而、和 属促凋亡基因 当促凋亡基因相对表达水平升高抗凋亡基因相对表达水平下降时会促进细胞的凋亡 在本试验中经 处理的湖羊 的、基因相对表达水平较对照组显著上升、基因极显著升高而 基因相对表达水平显著低于对照组说明 对湖羊 的凋亡有促进作用 蛋白 端的 位点磷酸化修饰后形成()蛋白可导致 蛋白稳定和激活进而调控一系列靶基因如 基因决定细胞命运的走向引起细胞凋亡 在本试验中 处理后的湖羊 中()蛋白表达水平与对照组相比无显著差异说明 蛋白磷酸化对本试验细胞凋亡相关基因相对表达水平没有影响有研究表明细胞凋亡与氧化应激有关且 通过诱导机体脂质过氧化产生毒性反应 本试验通过测定、基因和 蛋白的表达揭示 对湖羊 的氧化损伤作用 基因的主要功能是将过氧化氢分解成水和氧气过氧化氢对于细胞来说是一种有害的物质 是催化 还原的多种同工酶的总称 的表达可以减少氧自由基的产生使得细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰维持细胞的正常生理功能 编码的酶是一种在线粒体中发现的主要抗氧化酶上述 种基因的表达均可以降低细胞内氧化应激水平因此它们的表达水平可以间接衡量细胞氧化应激的程度 在本试验中 会导致、基因的相对表达水平极显著升高 基因的相对表达水平显著升高说明 能够造成湖羊 的氧化损伤这也可能是 促进湖羊 凋亡、抑制湖羊 增殖的原因之一 是真核细胞中最丰富的 内部修饰物 修饰影响 代谢的多个方面从 加工、核输出、翻译到衰变这种 修饰可能具有以前未被认识到的调节作用可能会影响各种细胞过程 越来越多的研究表明 调节基因表达进而调节细胞自我更新、分化、侵袭和凋亡等细胞过程 修饰的形成和生物学功能由甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白介导 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷是去甲基化酶对已发生 修饰的碱基进行去甲基化修饰而 和 是甲基化转移酶催化 上腺苷酸发生 修饰 等研究发现缺乏 的雄性小鼠的 中总体 水平升高引起细胞凋亡从而使生育能力受损 可抑制细胞增殖诱导细胞凋亡而 可增加 中 修饰抑制细胞增殖 阅读蛋白 增强细胞质中 衰变而 可在 翻译的初始阶段发挥着重要作用两者通过介导辅助才能在细胞中发挥作用 已有研究表明/与细胞氧化应激相关 因此细胞中编码以上蛋白的基因表达水平的改变可以说明 甲基化修饰程度在细胞中的改变 在本试验中 会造成湖羊 的 基因相对表达水平升高 基因相对表达水平显著升高 基因相对表达水平显著降低 和 基因相对表达水平极显著升高 说明 可通过改变相关基因表达来调控细胞 甲基化修饰程度从而在其对湖羊 毒性中发挥作用 后续还需要进一步探究 甲基化修饰以及甲基化酶基因在 对动物毒害中的分子机制综上 会导致湖羊 活性下降抑制湖羊 增殖促进湖羊 凋亡 诱导的湖羊 氧化损伤是其毒性作用之一而 甲基化修饰可能在 对湖羊 的毒性作用中发挥作用参考文献:.():.:.():.:.():.(/):.:.:.李晓晗陈婧钟翔等.甲基化在病毒感染中的作用研究进展.南京农业大学学报():.:./.():().():.():.:.:.():./.():.():.():.():.():.():.?.():.():.():.:.(/):.第 期刘亮等:玉米赤霉烯酮对湖羊睾丸间质细胞毒性及 甲基化修饰相关基因表达的影响 .():.许晴雨许静怡蔡沛蓉等.去乙酰化酶 在玉米赤霉烯酮致小鼠睾丸间质细胞氧化损伤中的调控作用.畜牧与兽医():.():().()(.):.():.():.:.():.():.:.():.():.().():.():.():.():.:.():.():.何波周小枫蒋瑶等.甲基化修饰 在动物中的研究进展.畜牧与兽医():.():().责任编辑:周广礼