眼镜蛇粉对小鼠H22肝癌细胞移植瘤的抑制作用及免疫功能的影响.pdf

目的 观察眼镜蛇粉及其水提液对小鼠H22肝癌细胞移植瘤的抑制作用以及小鼠免疫功能的影响。方法 取60只小鼠随机分成模型组、环磷酰胺组（0.015 g/kg）和蛇粉混悬液高剂量组（3.75 g/kg）、低剂量组（1.88 g/kg）以及蛇粉水提液高剂量组（20 g/kg）、低剂量组（10 g/kg），每组10只；通过小鼠右侧腋下无菌接种H22肝癌细胞悬液建立小鼠H22肝癌细胞移植瘤模型，灌胃给药结束后取出瘤块称重，计算肿瘤抑制率。另取72只小鼠随机分成空白组、模型组和蛇粉混悬液高剂量组、低剂量组以及蛇粉水提液高剂量组、低剂量组（药物剂量同上）；除空白组外，各组小鼠隔天腹腔注射环磷酰胺溶液（50 mg/kg）建立免疫抑制模型，灌胃给药结束后眼眶静脉丛取血测定吸光度值，取肝脏和脾脏称重，按公式计算免疫器官指数、胸腺指数、碳廓清指数和吞噬指数。结果 通过比较，蛇粉混悬液高、低剂量，蛇粉水提液高、低剂量均能显著抑制肝癌细胞移植瘤的生长（P0.01或P0.05），并呈现一定量效关系，肿瘤抑制率分别为69.06%、49.81%、56.42%、41.51%；蛇粉混悬液高剂量、蛇粉水提液高剂量均能显著提高免疫抑制小鼠胸腺指数（P0.01或P0.05）；蛇粉混悬液高剂量，蛇粉水提液高、低剂量均能显著提高免疫抑制小鼠巨噬细胞碳廓清指数（P0.01或P0.05）；蛇粉混悬液高、低剂量，蛇粉水提液高、低剂量均能显著提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬指数（P0.05）。结论 眼镜蛇粉及蛇粉水提液对小鼠H22肝癌细胞移植瘤有抑制作用，与增强小鼠免疫反应具有相关性。关键词：眼镜蛇；肝癌；肿瘤抑制；免疫功能中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：2095-4441（2023）04-0058-04引文格式：张文涛，邱华，禤继斌，等.眼镜蛇粉对小鼠H22肝癌细胞移植瘤的抑制作用及免疫功能的影响J.广西中医药大学学报，2023，26（4）：58-61.收稿日期：2023-03-06第一作者简介：张文涛，硕士，实验师，研究方向：中药抗肿瘤*通信作者：黄丽贞，女，硕士，高级实验师，研究方向：中药药理学；E-mail：肝癌的发生率在我国全部恶性肿瘤中位居第 4位，致死率高居第2位1。临床上针对癌症治疗以手术、放疗、化疗等方法为主，随着我国中医药的不断发展，中药及中药有效成分在抗肿瘤方面的作用被证实及其作用机理被阐明，中药治疗联合西医治疗起到协同增效作用，在肿瘤治疗领域得到广泛认可2-3。眼镜蛇 Naja naja（Linnaeus）具有通经络、祛风湿、强筋骨的功效，可用于治疗风湿关节痛、脚气病等4。研究表明，眼镜蛇毒具有抗肿瘤5、抗炎镇痛6、影响凝血功能7、体外抑菌8等药理活性，蛇胆具有镇咳祛痰9、抗菌消炎10等药理活性，但眼镜蛇其它部位药理作用未见相关报道。因此本文将通过现代药理学研究方法对眼镜蛇粉进行抗肝癌作用及对免疫功能影响的研究，为眼镜蛇药用价值的开发提供科学依据。1材料1.1动物SPF级昆明种（KM）小鼠，体质量1822 g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。广西中医 582023 年 第 26 卷 第 4 期广西中医药大学学报药大学实验动物中心资质号：SYXK桂2019-0001。饲养环境：室温2030，相对湿度60%80%。1.2药物眼镜蛇粉由广西金圣堂生物医药科技有限公司提供，为眼镜蛇科动物眼镜蛇Naja naja（Linnaeus）除去内脏、鳞片和头部的干蛇段粉碎而成，将蛇粉制备成超微细粉，用纯水配成浓度为 0.25 g/ml、0.125 g/ml的混悬液。另取眼镜蛇粉200 g，加15倍纯净水浸泡2 h，加热煮沸2 h，过滤，滤渣加10倍量水，加热煮沸1 h，过滤，合并滤液，浓缩至生药量为1 g/ml、0.5 g/ml的水提液。1.3细胞株H22细胞购于江苏凯基生物技术股份有限公司，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在细胞培养箱中培养。1.4试剂胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：21100201）；RPMI1640培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20220106）；PBS缓冲液（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20220125）；环磷酰胺一水合物（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C13640176）；印度墨汁（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：1224D021）；无水碳酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160516）。1.5仪器洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1F）；倒置显微镜（Nikon CorPoration，型号：Model EcliPse Ts2）；低速台式离心机（湘仪离心机仪器有限公司，型号：TDZ4-WS）；二氧化碳培养箱（New Srunswick，型号：Galaxy 170S）；电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：BSA224S；多功能酶标仪（瑞士 TECAN 公司，型号：Infinite M200 Pro）。2实验方法2.1H22肝癌移植瘤模型的建立将H22肝癌细胞株接种于小鼠腹腔内，7 d后取生长良好的H22肝癌腹水型荷瘤小鼠，将其颈椎脱臼处死，在无菌条件下抽取乳白色腹水，在显微镜下进行细胞计数，用生理盐水稀释成1.0107CFU/ml。以每只小鼠0.2 ml接种于小鼠腋窝皮下，制备H22肝癌移植瘤模型11。2.2肿瘤抑制作用取60只小鼠随机分成6组，即模型组、环磷酰胺组（0.015 g/kg）、蛇粉混悬液高剂量组（3.75 g/kg）、蛇粉混悬液低剂量组（1.88 g/kg）、蛇粉水提液高剂量组（20 g/kg）、蛇粉水提液低剂量组（10 g/kg），每组10只，雌雄各半。除模型组及环磷酰胺组灌胃给予生理盐水（NS）外，各组动物空腹灌胃给予相应药物，给药容积为 15 ml/kg。每天灌胃给药 1次，连续21 d。第22 d按2.1项方法制备H22肝癌移植瘤模型。接种后，环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺溶液（浓度为0.75 g/L，给药体积为20 ml/kg），其余各组均腹腔注射等剂量生理盐水，每日1次，同时各组均按上述方法继续灌胃10 d，末次给药后第2 d，小鼠予颈椎脱臼处死，迅速解剖取出瘤块称重，计算抑瘤率。肿瘤抑制率（%）=（模型组平均瘤重-药物组平均瘤重）/模型组平均瘤重100%。2.3对小鼠免疫器官指数的影响取72只小鼠随机分为空白组、模型组、蛇粉混悬液高剂量组（3.75 g/kg）、蛇粉混悬液低剂量组（1.88 g/kg）、蛇粉水提液高剂量组（20 g/kg）、蛇粉水提液低剂量组（10 g/kg），每组12只，雌雄各半。各组灌胃给药，空白组、模型组灌胃给予NS，其余各药物组灌胃给予相应的药物，给药容积为20 ml/kg，每天1次，连续21 d，第22 d开始，除空白组外，其余各组小鼠隔天腹腔注射环磷酰胺溶液建立免疫抑制模型，剂量为50 mg/kg，注射容积为10 ml/kg，空白组按同等条件注射 NS，同时各组均继续灌胃给药，持续7 d。末次给药1 h后，各鼠称重后处死，剪取脾脏及胸腺称重，按公式计算免疫器官指数。免疫器官指数：脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g）；胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）。2.4对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响小鼠分组与给药方法同2.3项，末次给药1 h后，各小鼠尾静脉注入 10%印度墨汁（10 ml/kg），注入墨汁后 2 min（t1）、10 min（t2）于小鼠眼眶静脉丛取血，用移液枪吸取20 l加到2 ml 0.1%的Na2CO3溶液中混匀，于600 nm处测定吸光度值（OD），取血后立即处死小鼠，取肝脏和脾脏称重，按公式计算碳廓清指数（K）和吞噬指数（）。K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）；=体质量/（肝质量+脾质量）K1/3。2.5统计学处理数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用t检验（方差齐）或 Dunnetts检验（方差不齐），P0.05为差异有统计学意义。3实验结果3.1眼镜蛇粉及其水提液对H22肝癌细胞移植瘤的抑制作用与模型组比较，CTX组，蛇粉混悬液高、低剂量，蛇粉水提液高、低剂量均能显著抑制 H22肝癌细胞移植瘤的生长（P0.01 或 P0.05），并呈现一定量效关系，肿瘤抑制率分别为81.51%、69.06%、49.81%、56.42%、41.51%。见表1。592023，Vol.26 No.4Journal of Guangxi University of Chinese Medicine3.2眼镜蛇粉及其水提液对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响与空白组比较，模型组脾脏指数与胸腺指数显著降低（P0.01），提示免疫抑制模型建立成功；与模型组比较，蛇粉混悬液高剂量组、蛇粉水提液高剂量组胸腺指数均显著升高（P0.05或P0.05），见表2。3.3眼镜蛇粉及其水提液对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响与空白组比较，模型组碳廓清指数、吞噬指数均显著降低（P0.05）。与模型组比较，蛇粉混悬液高剂量组与蛇粉水提液高、低剂量组碳廓清指数均显著升高（P0.05 或 P0.01）；蛇粉混悬液高、低剂量组与蛇粉水提液高、低剂量组吞噬指数均显著升高（P0.05）。结果见表3。表1各组小鼠瘤重及肿瘤抑制率的比较（xs）组别模型组CTX组蛇粉混悬液高剂量组蛇粉混悬液低剂量组蛇粉水提液高剂量组蛇粉水提液低剂量组n101010101010剂量（g/kg）0.0153.751.882010瘤重（g）1.060.460.200.060.330.150.530.250.460.320.620.24肿瘤抑制率（%）81.5169.0649.8156.4241.51注：与模型组比较，P0.05，P0.01表2各组免疫抑制小鼠免疫器官指数的比较（xs）组别空白组模型组蛇粉混悬液高剂量组蛇粉混悬液低剂量组蛇粉水提液高剂量组蛇粉水提液低剂量组n121212111211剂量（g/kg）3.751.882010脾脏指数3.870.802.300.682.640.532.750.692.460.672.760.58胸腺指数1.820.670.720.261.080.320.840.321.050.380.990.39注：与空白组比较，P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01表3各组免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能指标的比较（xs）组别空白组模型组蛇粉混悬液高剂量组蛇粉混悬液低剂量组蛇粉水提液高剂量组蛇粉水提液低剂量组n111112121210剂量（g/kg）3.751.882010碳廓清指数0.0400.0070.0330.0070.0410.0060.0390.0070.0420.0090.0410.007吞噬指数6.650.556.100.656.710.636.840.636.840.756.770.55注：与空白组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05，P0.014讨论据研究报道，动物类中药富含蛋白质和多肽等成分12，可通过诱导肿瘤细胞凋亡及自噬13，抑制肿瘤新血管生成14，调节机体免疫功能15等多种途径发挥抗肿瘤作用。本研究以眼镜蛇去除磷片头及内脏部位制备的蛇粉混悬液与蛇粉水提液为研究对象，利用小鼠H22肝癌细胞移植瘤模型，观察其抗肝癌作用，602023 年 第 26 卷 第 4 期广西中医药大学学报结果显示蛇粉混悬液高、低剂量，蛇粉水提液高、低剂量的肿瘤抑制率分别为 69.06%、49.81%、56.42%、41.51%，提示蛇粉混悬液与蛇粉水提液可抑制肝癌细胞移植瘤的生长，并呈现一定的量效关系。肝癌的发生与发展与机体免疫功能密切相关，肝癌患者免疫功能随着病程进展而降低16，为了进一步观察蛇粉混悬液及水提液对免疫功能的影响，通过对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液建立免疫抑制模型开展实验。环磷酰胺作为小鼠免疫抑制模型常用药物，能够抑制免疫功能17-18。胸腺与脾脏均是机体重要淋巴器官，是机体发生免疫反应的主要场所，对机体免疫功能产生重要作用，胸腺指数和脾指数的高低反映了免疫功能的强弱19。巨噬细胞的吞噬功能属于机体非特异性免疫功能之一，当对小鼠尾静脉注射印度墨汁后，肝、脾等器官巨噬细胞通过吞噬碳粒，而使其在血浆中的浓度下降，碳粒清除率可间接反映巨噬细胞吞噬功能，巨噬细胞吞噬功能强弱也在一定程度上反映机体免疫功能的强弱20。实验结果显示，蛇粉混悬液、蛇粉水提液均能明显提高免疫抑制小鼠胸腺指数，提高免疫抑制小鼠巨噬细胞碳廓清指数和吞噬指数，提示眼镜蛇粉与蛇粉水提液对提高免疫功能具有一定作用。综上所述，眼镜蛇粉及蛇粉水提液对小鼠H22移植瘤有抑制作用，与增强小鼠免疫反应具有相关性。参考文献1林丽珠，肖志伟，黄学武，等.原发性肝癌中西医结合诊疗实践回眸 J.中医肿瘤学杂志，2020，2（1）：5-9.2曹毛毛，陈万青.中国恶行肿瘤流行情况及防控现状 J.中国肿瘤临床，2019，46（3）：145-149.3袁选举，邓守恒.中医药在治疗恶性肿瘤中的研究进展 J.时珍国医国药，2019，30（9）：2232-2234.4广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准第二册 M.南宁：广西科学技术出版社，1996：231-232.5孙王宏，陈柳，冯相鑫，等.中华眼镜蛇膜毒素12对膀胱癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响 J.中国现代医学杂志，2019，29（19）：1-7.6俞玲，张根葆，孙淑萍.皖南地区眼镜蛇毒活性组分外用镇痛的效应及机制研究 J.中国临床药理学与治疗学，2018，23（1）：1235-1239.7许林，魏颖，徐书静，等.中华眼镜蛇毒对大鼠凝血功能的影响 J.中国实验动物学报，2022，30（3）：316-325.8黄智，何冬凌，廖明.广西眼镜蛇、银环蛇和五步蛇蛇毒的体外抑菌作用 J.中国微生态学杂志，2019，31（10）：1135-1139.9曹妍，李婷，常安琪，等.蛇胆中胆汁酸类化学成分分析 J.中国中药杂志，2021，46（1）：130-138.10张丹，林培英，肖柳英，等.三蛇胆川贝末抑菌消炎及免疫调节作用研究 J.中药药理与临床，2000，16（1）：39.11徐淑云，卞如廉，陈修.药理实验方法学 M.3版.北京：人民卫生出版社，2002：1756-1765.12陈银芳，章常华，魏学鑫，等.动物药中蛋白质、氨基酸检测分析研究进展 J.时珍国医国药，2017，28（1）：186-189.13HUANG H L，ZHANG Y L，CHEN W F，et al.Effects ofaqueous extracts of gecko on stemness of hepatocellular carcinoma J.China Journal of Chinese Materia Medica，2017，42（20）：3990-3995.14LI X，CHEN C，DAI Y，et al.Cinobufagin suppresses colorectal cancer angiogenesis by disrupting the endothelial mammalian target of rapamycin/hypoxia-inducible factor 1a axis J.Cancer Sci，2019，110（5）：1724-1734.15陈茂华，李艳华，赵云，等.金头蜈蚣多糖抗肝癌作用及机制研究 J.时珍国医国药，2018，29（6）：1338-1340.16GONG Y，WU J，LI S T.Immuno-enhancement effects of Lycium ruthenicum Murr.Polysaccharide on cycloPhosPhamide-induced immunosuPPression in mice J.Int J Clin ExPMed，2015，8（11）：20631-20637.17龚蕾，郎茜，马莎，等.单次大剂量和多次小剂量环磷酰胺腹腔注射对小鼠免疫抑制模型的影响 J.中国畜牧兽医，2021，48（10）：3787-3794.18田艳，刘青青，田海霞，等.益生菌缓解环磷酰胺所致小鼠兔疫功能低下 J.中国免疫学杂志，2020，36（15）：1805-1808.19ZHAN Y，WANG L H，LIU G Y，et al.The Reparative effectsof human adipose-derived mesenchymal stem cells in thechemotherapy-damaged thymusJ.Stem Cells Dev，2019，28（3）：186.20唐耿秋，严寒静，倪石寿，等.铁皮石斛口含片、泡腾片对小鼠免疫功能影响的研究 J.时珍国医国药，2020，31（2）：324-326.（编辑陈明伟/蒙健林）61