婴儿配方乳粉中VA、VD和VE混合标准物质的研制.pdf

研制婴儿配方乳粉中VA、VD和VE混合标准物质。选择与日常检测水平相当的乳粉，经过混匀、分装、真空密封制备了候选标准物质。采用固相萃取-二维液相色谱建立了一种测定婴儿配方乳粉中VA、VD和VE含量测定的通用方法，并将此法用于该标准物质的均匀性、稳定性检验及定值。定值采用同一检测方法8家实验室协作定值方式，并对标准物质的不确定度进行评估。采用该方法考察标准物质的均匀性和稳定性结果满足标准物质制备的要求。标准物质中VA、VD和VE含量定值结果及其扩展不确定度（k=2）分别为（4 9873.1）g/kg、（1041.59）g/kg和（901.3）mg/kg。该研究流程和结果符合标准物质定值的要求。该标准物质可用于相关检测实验分析方法的确认和过程质量控制。关键词脂溶性维生素；婴儿配方乳粉；标准物质；固相萃取-二维液相色谱中图分类号：O652.3 文献标识码：文章编号：1008-6145(2023)07-0001-06Preparation for mixed reference material of VA,VD and VE in infant formula milk powderNING Xiao,JIN Shaoming,LIU Tongtong,ZHAO Mei,CAO Jin(National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China)Abstract The reference material of VA,VD and VE in infant formula milk powder was prepared.The candidate reference materials were prepared by mixing,packaging and vacuum sealing of milk powder which was equivalent to the daily detection level.A general method for the determination of VA,VD and VE in infant formula milk powder was established by solid phase extraction column clean-up with two-dimensional liquid chromatography.The method was used to evaluate the homogeneity and stability of VA,VD and VE in the samples.The specified value was determined by using the same detection method in 8 laboratories,and the uncertainty of the reference material was evaluated.The results of homogeneity and stability of the samples by this method meet the requirements of reference material,and the specified values of VA,VD and VE(k=2)were(4 9873.1)g/kg,(1041.59)g/kg,(901.3)mg/kg,respectively.The development process and the result conformed to the reference material fixed value requirement.This reference materials can be used in relevant detection experiments for the confirmation of VA,VD and VE analysis method.Keywords fat-soluble vitamin;infant formula milk powder;reference material;solid phase extraction column clean-up with two-dimensional liquid chromatography维生素A、D、E（VA、VD、VE）均属于脂溶性维生素。这三种维生素对人体均有重要的作用，一但缺乏将导致一些疾病如夜盲、骨质疏松、易感染癌症等1。另一方面，该类脂溶性维生素不易通过尿液排出体外,容易在体内大量蓄积，因此VA，VD，VE摄入过量时，可能引起皮肤、骨骼、脑、肝等多种脏器组织病变，对人体健康造成巨大影响2。由于婴儿食物来源单一，相关维生素在乳粉中的含量直接影响doi:10.3969/j.issn.1008-6145.2023.07.001基金项目国家重点研发计划高通量液质联用检测方法及诊断试剂研发（2021YFC2401100）通信作者曹进，博士，研究员，从事理化分析收稿日期20230515引用格式宁霄，金绍明，刘彤彤，等.婴儿配方乳粉中VA、VD和VE混合标准物质的研制 J.化学分析计量，2023，32（7）：1.NING Xiao,JIN Shaoming,LIU Tongtong,et al.Preparation for mixed reference material of VA,VD and VE in infant formula milk powderJ.Chemical Analysis and Meterage,2023,32(7):1.1化学分析计量2023 年，第 32卷，第 7 期婴幼儿健康。GB107652021 食品安全国家标准婴儿配方食品 及GB107672021 食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品 中均严格限定了这3种维生素的含量范围3-4。婴儿配方乳粉基质复杂，牛乳、脱盐乳清粉、乳清蛋白粉等牛乳分离提取物为主要蛋白原料，复配植物油和乳糖，是脂肪、碳水化合物的原料来源，形成了婴儿配方乳粉的主体原料，同时强化维生素、矿物质等一定量的营养强化剂5。产品生产过程中存在分布不均的风险，同时，其稳定性受环境影响较大。据宇盛好等统计的20152020年全国抽检婴幼儿配方乳粉结果6，这三种维生素指标不合格是存在的主要问题之一，因此，准确测定婴幼儿配方乳粉中VA，VD和VE的含量尤为重要。为监控实验室对三种维生素的检测能力，保证检测结果有效可靠，且具有溯源性、可比性和准确性，本实验室研制了婴儿配方乳粉中VA，VD和VE含量分析混合标准物质。采用固相萃取法取代国家标准7中的有机溶剂萃取法，并使用二维液相色谱法对目标溶液进行分析，省去正相制备步骤，简化样品处理流程，实现一次进样同时完成VA，VD和VE含量的测定，可以满足标准物质定值的要求。该标准物质可用于相关检测实验进行三种组分分析方法的同步确认、过程质量控制及分析仪器校准等工作。1实验部分1.1主要仪器与试剂液相色谱仪：U3000 型双三元液相色谱(2D-LC)系统，配有DAD检测器，美国赛默飞世尔科技公司。电子天平：XPE205 型，感量为 0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。维生素专用固相萃取柱：TUP-E76-2060型，天津诚轴生物科技有限公司。VA（视黄醇）对照品：纯度（质量分数）不小于98.7%，相对扩展不确定度为 1.77%（k=2），美国西格玛公司。VD3对照品：纯度（质量分数）不小于99.8%，相对扩展不确定度为 0.3%（k=2），德国DR.E公司。VE(D-生育酚)对照品：纯度（质量分数）不小于 98.2%，相对扩展不确定度为 2.0%（k=2），德国DR.E公司。无水乙醇、乙腈、甲醇：色谱纯，德国默克公司。1.2样品制备向乳粉企业采购分装前的成品乳粉（生产工艺为湿法喷雾制备，已定量加入维生素A、D、E）,混匀，包装。最终用棕色玻璃瓶带硅胶垫塑料盖包装，铝塑袋真空密封，共制备300瓶，每瓶净含量不少于20 g，保存条件：温度为（252），相对湿度为（6010）%。1.3VA、VD和VE含量测定方法1.3.1样品预处理精密称取婴儿配方乳粉5 g于250 mL锥形瓶中，加入20 mL温水（50）溶解后，加入抗坏血酸1.0 g，BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）0.1 g，无水乙醇50 mL，质量分数为50%的KOH溶液15 mL，在65 水浴中震荡皂化50 min。将上述皂化液冷却，用水-乙醇(体积比为 1 1)混合液转移定容至 100 mL，摇匀，以8 000 r/min转速离心5 min，取20 mL上清液，转移至TUP-E76-2060固相萃取柱（20 g/60 mL）中，用100 mL正己烷(含BHT，BHT的质量浓度为 50 mg/L)以约5 mL/min的流量洗脱，将洗脱液收集至旋蒸瓶中，使用旋蒸仪于40 旋蒸至约2 mL，将溶液转移至离心管中，用氮气吹干后准确加入2 mL甲醇复溶，经0.22 m微孔滤膜过滤，作为样品溶液。1.3.2定量方法所制备的乳粉中混合维生素标准物质中VA、VD和VE含量采用液相色谱法测定。流动相为乙腈-甲醇-水；将2D-LC系统的右泵作为一维分析泵，以赛默飞FOODKIT1 ADE-C18色谱柱(150 mm3.0 mm，3 m)为一维分析柱，流量为0.5 mL/min；将2D-LC系统的左泵作为二维分析泵，以赛默飞FOCDKIT1&2ADE-C18色谱柱(100 mm 4.6 mm，2.6 m)为二维分析柱，流量为0.8 mL/min；柱温30；检测波长分别为264 nm(VD)、296 nm(VE)和325 nm(VA)；进样体积为20 L。梯度洗脱条件见表1。1.4均匀性和稳定性检查根据CNASGL 03：能力验证结果的统计处理和评价指南 中关于均匀性、稳定性检验的要求进行试验及统计分析8。1.4.1均匀性检查随机抽取15份样品进行均匀性测定，每份样品做 2 次独立平行测定，对处理得到的待测液按随机顺序进样，采用单因素方差分析和F检验对样品的2宁霄，等：婴儿配方乳粉中VA、VD和VE混合标准物质的研制均匀性进行考察，当测定结果的F值小于F（1，2）时，认为样品为充分均匀的。1.4.2稳定性检验按照先密后疏的原则设置不同的采样时间点，采用同步稳定性评估方法进行稳定性分析。实验温度选择(252)，相对湿度选择为(6010)%，进行储存稳定性实验。将样品分别在上述条件下存放，于 1、3、6、12个月后分别抽取3份样品,每份样品检测2次。以均匀性检测结果为长期稳定性0点，采用回归分析评定样品的稳定性。1.5定值参 考 JJF 134320129和 ISO GUIDE 35:201710，采用同一方法多家实验室联合定值的方式，稳健的统计方法定值。选择8 家行业领域经验丰富且经国家认证的检测实验室或检测中心，分别向每个定值实验室提供样品5 份，每个样品分别平行测定 2 组数据。各定值机构提供 10 组测量数据。回收定值检测结果后，对每一组独立测量结果采用格拉布斯（Grubbs）检验进行离群值检验，采用狄克森（Dixon）检验对组间数据进行离群值检验。剔除离群值后，采用 Kolmogorov-Smirnor（KS）检验对所有数据进行正态分布检验。在符合正态分布的情况下，计算出各实验室检测结果中位值的中位值，该总体中位值即样品的定值结果，同时进行定值的不确定度评定并给出最终结果。2结果与讨论2.1定量分析条件的优化由于VA和VE光敏性较强，遇光极易分解，因此婴儿配方乳粉制备工艺中需要通过乙酸酯化并微胶囊化处理，从而减少这三种类脂溶性维生素在运输和储存过程中的流失。在定量分析中，样品需经过皂化处理，才能将VA、VD、VE溶解出来。国家标准方法11采用有机溶剂萃取法进一步净化皂化液，由于该方法易出现两相界面乳化现象，导致目标组分在从皂化液转移到萃取液的过程中产生损失，且光敏性强的目标组分在萃取液浓缩过程中极易见光分解，从而该方法回收率较低12-16。笔者采用固相萃取柱净化皂化液，减少了复杂操作导致的目标组分损失。考虑到乳粉中VD含量低，为实现与VA、VE的同步检测，需通过大容量的固相萃取柱富集。通过对比，最终选择规格为 20 g/60 mL 的 TUP-E76-2060维生素专用固相萃取柱。该固相萃取柱采用特殊工艺处理的硅藻土填充而成，具有最大的比表面积和均衡的表面活性，可给样品提供一个理想的液液分配支撑表面。实验验证结果表明，样品快速通过亲水材料筛板后，水和无机盐等杂质被保留，弱极性物质被正己烷洗脱下来。2.2样品的均匀性和稳定性考察2.2.1均匀性检验结果按1.4.1进行均匀性检测，采用单因素方差分析方法对样品测定结果进行数据统计。三种维生素含量测定结果列于表2（“组内1”“组内2”表示两个平行操作样品），F检验分析结果列于表3。结果显示：样品的 F 计算值小于 F 临界值，表明样品均匀性良好。表1梯度洗脱条件一维分离时间/min022151520202525262626.526.532乙腈/%50501001000010010010000甲醇/%0001001000005050水/%5050000005050二维分离时间/min02255991010212123233123132乙腈/%60600006060601001006060甲醇/%404010010010000004040水/%0000404040000表2婴儿乳粉样品中三种维生素质量分数测定结果序号123456789101112131415VA/（gkg-1）组内14 9494 9824 9434 9894 9724 9675 0214 9604 9755 0055 0034 9775 0074 9605 008组内24 9544 9914 9794 9575 0194 9934 9934 9895 0074 9894 9894 9544 9654 9434 969组内均值4 9524 9874 9614 9734 9964 9805 0074 9754 9914 9974 9964 9664 9864 9524 989VD/（gkg-1）组内111194111049710210910496102991119611293组内295102941091011071041019898106110110112106组内均值103981021079910510710397100103111103112100VE/（mgkg-1）组内1889092929090929290919391919391组内2909291889289909089909290889289组内均值8991929091909191909192918992903化学分析计量2023 年，第 32卷，第 7 期2.2.2稳定性检验结果按1.4.2进行稳定性考察，结果见表4。对表4检测结果以时间-质量分数做线性拟合，并进行回归方差分析，结果见表5。结果表明，在95%的置信水平下，斜率的P0.05，说明样品在考察期限内稳定性良好。2.3定值结果及离群值检验按照1.5方法发放协作定值样品，统一采用1.3定量方法，联合8家行业领域经验丰富且经国家认证的检测实验室协作定值，实验室分别编号为 AH，各协作单位定值检测结果见表6。采用格拉布斯(Grubb s)检验，对 8 个实验室内检测结果进行离群值检验。采用狄克森(Dixon)检验对实验室间检验结果的一致性进行评价。在95%的置信水平，均无离群值。计算各协作定值单位结果的中位值，并对各协作定值单位中位值结果做二次中位值计算，作为指定值。最终VA、VD和VE含量定值结果分别为4 987 g/kg、104 g/kg和90 mg/kg。2.4定值不确定度的评定2.4.1样品协作定值引入的不确定度计算各协作定值单位结果的中位值，记为Ni。以这些中位值的中位值作为指定值，记为X。计算N1，N2Ni与X之差的绝对值，记为Qi。Q1，Q2Qi的中位值记为Q。各定值实验室结果及统计见表6。协作定值的不确定度按式(1)计算，结果见表6。uD=sQ 2n(1)式中：uD协作定值的标准不确定度；n协作标定的实验室数量；sQ正态分布的标准偏差，sQ=Q/0.674。协作定值的相对标准不确定度按式(2)计算，结果见表8。uDrel=uDX(2)式中：uD,rel协作定值的相对标准不确定度；X各实验室报告值的中位值。2.4.2样品均匀性引入的不确定度均匀性引入的不确定度及相对不确定度分别按式(3)、式(4)计算，结果见表7。ubb=ems-inn2vin4(3)式中：ubb均匀性引入的标准不确定度；n每份样品平行测定的次数；ems-in组内的均方差；vin组内自由度。ubbrel=ubbm(4)式中：ubb,rel均匀性引入的相对标准不确定度；m均匀性检验数据的平均值。表4稳定性考察组分质量分数测定结果目标组分VA/（gkg-1）VD/（gkg-1）VE/（mgkg-1）放置时长/月136121361213612测定值4 994，5 018，4 970，4 987，4 943，5 0104 953，4 999，5 006，4 989，4 981，5 0175 002，5 021，4 953，5 009，4 989，4 9804 959，5 012，5 012，4 991，4 974，4 98299，94，101，101，94，10097，113，97，112，105，9696，96，105，97，105，11098，98，102，103，112，9792，92，92，90，89，9288，89，92，90，88，9392，93，88，91，89，9090，91，89，90，89，93平均值4 9874 9914 9924 9889810310210291909190表3婴儿乳粉样品中三种维生素含量测定方差分析结果目标组分VAVDVE差异源组间组内总计组间组内总计组间组内总计方差8 1196 25814 3765275561 083312852自由度141529141529141529标准差580417383722F值1.391.021.19P值0.270.490.37F 临界值2.422.422.42表5稳定性检测回归方差分析结果目标组分VAVDVE项目截距斜率截距斜率截距斜率回归系数4 9860.461010.0391-0.04标准误差3.020.491.520.250.330.05t 值1 648.80.9466.80.13279.6-0.74P 值4.910-100.427.410-60.901.010-70.51下限95.0%4 976-1.1097-0.7590-0.21上限95.0%4 9952.021060.82920.134宁霄，等：婴儿配方乳粉中VA、VD和VE混合标准物质的研制2.4.3样品稳定性引入的不确定度将样品稳定性检验结果按时间质量分数做线性拟合，所得拟合直线的残差为斜率不确定度，如式(5)。按式(6)、式(7)分别计算样品稳定性引入的标准不确定度和相对标准不确定度，结果见表7。s(b1)=s i=1n(xi-x)2(5)式中：s(b1)斜率b1的不确定度；s 回归直线残留平均标准偏差。ults=s(b1)t(6)式中：ults样品稳定性引入的标准不确定度；s(b1)样品稳定性考察直线拟合斜率的标准不确定度；t样品的有效期（稳定性考察期）。ultsrel=ultsm(7)式中：ults,rel样品稳定性的相对标准不确定度;m所有稳定性检验测定结果的平均值。2.4.4合成不确定度以定值、均匀性、稳定性引入的不确定度分量合成标准物质定值的相对标准不确定度，按式(8)计算。按式(9)计算标准物质的合成标准不确定度，结果见表7。uCRMrel=(uDrel)2+(ubbrel)2+(ultsrel)2(8)uCRM=uCRMrelX(9)按95%的置信区间，取k=2，按式(10)计算标准物质的扩展不确定度，VA、VD和VE结果分别为3.10、1.59和1.30。UCRM=kuCRM(10)式中：uCRM标准物质的标准不确定度；UCRM标准物质的扩展不确定度；k包含因子。2.5婴儿配方乳粉标准物质的定值结果经过均匀性检验，12个月内的3个月次的稳定性检验和8家实验室协作定值，最终确定婴儿配方乳粉标准物质中VA、VD和VE含量定值结果及其扩展 不 确 定 度(k=2)分 别 为(49873.1)g/kg、(1041.59)g/kg和(901.3)mg/kg。3结语通过优化样品处理及检测方法，建立了婴儿配方乳粉中VA、VD和VE含量同步分析标准物质的二维液相色谱定值方法，该方法利用固相萃取方式，省去了有机溶剂液液萃取的繁杂步骤，实现了三种脂溶性维生素的同步检测，在提升方法的准确率及灵敏度的基础上，提高了效率，适用于大批量样品的同时测定。用此法检验标准物质的均匀性和稳定性，均满足要求；且多家实验室联合定值方式，也再次验证该方法具备重现性、可靠性和准确性。通过该方法制备的婴儿配方乳粉基体标准物质可用于日常食品质量控制、检测方法的开发及实验室能力验证等领域，也为其他基体标准物质的制备提供了参考。参 考 文 献1 OMAR KARLSSON，ROCKLI KIM，ANDREAS HASMAN，et al.Consumption of Vitamin-A-Rich Foods and Vitamin A Supplementation for Children under Two Years Old in 51 Low-and Middle-Income Countries J.Nutrients，2022，14（188）：1.2 ZHANG Yanhai，LIN Yikan，YANG Xinlei，et al.Fast determination of vitamin A，vitamin D and vitamin E in food by online SPE combined with heart-cutting two dimensional Liquid 表6婴儿配方乳粉中三种维生素协作定值结果目标成分VA/（gkg-1）VD/（gkg-1）VE/（mgkg-1）实验室编号ABCDEFGHABCDEFGHABCDEFGHNi4 9594 9894 9844 9915 0015 0014 9774 96110510510498108102991069190919189909190X4 98710490Qi28.02.502.5040014.514.59.5026.00.70.20.36.33.82.35.31.30.20.10.80.11.00.80.20.4Q12.01.80.3sQ17.82.60.4表7定值的标准不确定度计算结果目标成分VA/（gkg-1）VD/（gkg-1）VE/（mgkg-1）标准不确定度协作定值1.120.160.03均匀性0.870.870.06稳定性0.630.729.05合成1.550.800.665化学分析计量2023 年，第 32卷，第 7 期Chromatography J.Journal of Food Composition and Analysis，2021，101：103 983.3 中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准婴儿配方食品：GB107652021 S.北京：中国标准出版社，2021.4 中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品：GB10767-2021S.北京：中国标准出版社，20215 LIANG Y，ZHOU T.Recent advances of online coupling of sample preparation techniques with ultra high performance liquid chromatography and supercritical fluid chromatography.J J Sep Sci，2019，42：226.6 宇盛好，李亦奇，彭少杰.我国婴幼儿配方食品抽检不合格项目的分析 J.上海预防医学，2021，5（33）：366.7 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E 的测定：GB 5009.822016 S.北京：中国标准出版社，2016.8 中国合格评定国家认可委员会.能力验证样品均匀性和稳定性评价指南：CNASGL03 S.北京：中国质检出版社，2006.9 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.标准物质定值的通用原则及统计学原理：JJF 13432012 S.北京：中国质检出版社，2012.10 International Organization for Standardization.Reference MaterialsGuidance for Characterization and Assessment of Homogeneity and Stability：ISO GUIDE 35：2017 S.11 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品中维生素A、D、E的测定：GB 5009.822016S.北京：中国标准出版社，2016.12 黄百芬，张京顺，王梦莉，等.二维高效液相色谱法同时测定菜肴中维生素A、D和E J.卫生研究，2023，52（2）：272.13 李莲，黄柳霞，罗雪婷.二维液相色谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中的维生素A、D、E J.海南师范大学学报（自然科学版），2023，36（1）：46.14 翟洪稳，马红玉，马俊美，等.在线固相萃取-二维液相色谱法同时测定特殊医学用途配方食品中维生素A、D、E的含量 J.食品科学，网络首发地址：https：/ 郑华艳，姜艳喜，华家才，等.特殊医学用途婴儿配方乳粉营养素稳定性研究 J.中国乳品工业，2022，50（12）：23.16 赵晓童，李晓敏.乳制品中脂溶性维生素检测的前处理方法研究进展 J.食品安全质量检测学报，2022，13（21）：6 876.6