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肿瘤血管生成肿瘤血管生成 及检测及检测重庆医科大学重庆医科大学病理教研室病理教研室叶秀峰叶秀峰人体肿瘤大部分为实体瘤人体肿瘤大部分为实体瘤(solidtumors)。实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成，。实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成，后者主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎后者主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎细胞及细胞外基质等成分。其中，血管和结细胞及细胞外基质等成分。其中，血管和结缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成血管生成(angiogenesis)和淋巴管生和淋巴管生成成(1ymphangiogenesis)实现的，并实现的，并在肿瘤的生长和扩散在肿瘤的生长和扩散(侵袭和转移侵袭和转移)中起中起重要作用。已有研究证明，肿瘤血管重要作用。已有研究证明，肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级、放射生成活跃程度对组织病理分级、放射治疗以及在预后判断上都有重要的评治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值。估价值。第一节第一节肿瘤血管生成的基本过程肿瘤血管生成的基本过程一、血管生成现象一、血管生成现象(一一)血管生成的概念血管生成的概念1945年年Algire提出了提出了“肿瘤血管生成肿瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或或“血管新生化血管新生化(neovasclarzation)”概念。对血管生成概念。对血管生成重要性的认识，特别是提出重要性的认识，特别是提出“肿瘤生长肿瘤生长依赖于血管生成依赖于血管生成”观点，始于观点，始于1971年年Folkman对肿瘤血管生成的研究报道。对肿瘤血管生成的研究报道。血管生成是指活体组织在已存在的微血管床血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生上芽生(sprouting)出新的以毛细血管为主的出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。血管系统的过程。有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成血管的过程即血管形成(vasculogenesis)(二二)血管生成的研究方法血管生成的研究方法鸡胚绒毛尿囊膜试验鸡胚绒毛尿囊膜试验角膜移植实验角膜移植实验开窗实验开窗实验动物移植瘤等在体模型动物移植瘤等在体模型三维胶分析法三维胶分析法细胞联合培养等离体模型细胞联合培养等离体模型 识别内皮细胞的免疫学标记物识别内皮细胞的免疫学标记物:第第8因子相关抗原因子相关抗原(factorrelatedantigenFAg)、CD3l、CD34、CDl05 血管生成因子血管生成因子:VEGF及其受体家族及其受体家族FGF家族及家族及其受体其受体 Ang和和Tie受体家族受体家族Angiotropin血小板源内皮细胞生长因子血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)二肿瘤血管生成的基本过程二肿瘤血管生成的基本过程(一一)血管生成的基本过程血管生成的基本过程血管生成的基本步骤是血管生成的基本步骤是血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡，导致内皮细胞激活，产生血管生成表型；衡，导致内皮细胞激活，产生血管生成表型；血管部位细胞外基质改变、基底膜降解，内血管部位细胞外基质改变、基底膜降解，内皮细胞芽生、增殖和迁移；皮细胞芽生、增殖和迁移；新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻及管腔；及管腔；新生血管管腔的贯通。内皮细胞凋亡、新生血管管腔的贯通。内皮细胞凋亡、脱离基底膜和血管壁细胞改变可能是血脱离基底膜和血管壁细胞改变可能是血管消退的主要病理学事件。管消退的主要病理学事件。(二二)肿瘤血管生成的过程肿瘤血管生成的过程1肿瘤生长的阶段性肿瘤生长的阶段性 无血管期无血管期(avascularphase)或称血管或称血管前期前期(prevascularphase)肿瘤直径不超过肿瘤直径不超过12mm 血管期血管期(vascularphase)肿瘤迅速生长并发生转移肿瘤迅速生长并发生转移 2.肿瘤血管的起源肿瘤血管的起源肿瘤中的血管可能有肿瘤中的血管可能有3种来源：种来源：血管生成血管生成:以两种方式发生以两种方式发生,一是肿瘤细胞团先处一是肿瘤细胞团先处于无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因子，于无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因子，从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿主组织从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿主组织已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退，然后再已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退，然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成 血管套叠性生长血管套叠性生长内皮祖细胞内皮祖细胞3肿瘤血管生成的过程肿瘤血管生成的过程 瘤细胞和巨噬细胞瘤细胞和巨噬细胞血管生成因子血管生成因子(VEGF等等)小血管毛细血管伸展小血管毛细血管伸展内皮细胞迁移形成毛细血管芽内皮细胞迁移形成毛细血管芽新生毛细血管形成并连通新生毛细血管形成并连通第二节第二节肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而且在生物学功能上也有其特殊性。且在生物学功能上也有其特殊性。一肿瘤微血管形态表现一肿瘤微血管形态表现肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织，但分布上并不均一。血管生成最活跃、微织，但分布上并不均一。血管生成最活跃、微血管密度最高的区域被称为所谓血管密度最高的区域被称为所谓“血管热点区血管热点区”(hotspots)，这也是进行肿瘤微血管密度测，这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域。很多肿瘤的微血管新生主要分定的选择区域。很多肿瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘。布在肿瘤生长活跃的边缘。肿瘤的新生血管分布上常常无规律，分支紊乱，肿瘤的新生血管分布上常常无规律，分支紊乱，管腔不规则，可表现为狭窄、扩张或扭曲。新管腔不规则，可表现为狭窄、扩张或扭曲。新生血管呈血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有生血管呈血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有一层内皮细胞；或管壁很厚，但结构上仍然不一层内皮细胞；或管壁很厚，但结构上仍然不完善。内皮细胞般比较幼稚，细胞间常有裂完善。内皮细胞般比较幼稚，细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可隙，且缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。直接与血管管腔相连。肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。不同类型肿瘤间质的血管没有本质区别，但在不同类型肿瘤间质的血管没有本质区别，但在形态和数量上却有不同。形态和数量上却有不同。生长活跃的恶性肿瘤常富于血管如内分泌肿生长活跃的恶性肿瘤常富于血管如内分泌肿瘤肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞瘤、瘤肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞瘤、胶质母细胞瘤和肝细胞癌等，而硬癌、软骨瘤胶质母细胞瘤和肝细胞癌等，而硬癌、软骨瘤和软骨肉瘤中血管甚少。和软骨肉瘤中血管甚少。不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶质不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮细胞母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮细胞呈不同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、肝细胞呈不同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、肝细胞癌等血管呈壁薄、明显扩张的血窦。癌等血管呈壁薄、明显扩张的血窦。以恶性胶质瘤为例，肿瘤组织内新生血以恶性胶质瘤为例，肿瘤组织内新生血管的主要表现形式有管的主要表现形式有:梭形内皮细胞呈索状排列，枝状分布，有梭形内皮细胞呈索状排列，枝状分布，有或无明显的血管腔，呈原始、幼稚的微血管或无明显的血管腔，呈原始、幼稚的微血管内皮细胞增生、肥大，管腔狭小，呈现厚内皮细胞增生、肥大，管腔狭小，呈现厚壁血管壁血管内皮细胞增生，形成球形血管壁内血管内皮细胞增生，形成球形血管壁内血管呈现呈现“肾小球样结构肾小球样结构”；管腔大、管壁较薄的相对较大的微血管，管腔大、管壁较薄的相对较大的微血管，并形成血管心假菊形团结构；并形成血管心假菊形团结构；大量管壁退变和钙化的新生血管；大量管壁退变和钙化的新生血管；增生血管丛呈蛇形密集排列，形成肿瘤与瘤增生血管丛呈蛇形密集排列，形成肿瘤与瘤周组织间的血管屏障；周组织间的血管屏障；血管内皮区域性极度增生，呈片状的梭形细血管内皮区域性极度增生，呈片状的梭形细胞，构成胞，构成“假肉瘤化假肉瘤化”。二、肿瘤微血管的生物学特性二、肿瘤微血管的生物学特性低反应性低反应性高通透性高通透性低供氧能力低供氧能力 最近，最近，VogelsteinB和和KinzlerKW采用基因表采用基因表达的系列分析达的系列分析(serialanalysisofgeneexpressionSAGE)方法，比较研究了结直肠方法，比较研究了结直肠癌和正常肠黏膜血管内皮细胞的基因表达差异。癌和正常肠黏膜血管内皮细胞的基因表达差异。结果发现二者基因表达存在差异。他们得到结果发现二者基因表达存在差异。他们得到了了79种差异表达的转录子，其中种差异表达的转录子，其中TEM8仅表达仅表达于肿瘤内皮而不表达于黄体形成中的内皮细胞，于肿瘤内皮而不表达于黄体形成中的内皮细胞，提示肿瘤血管生成和生理状态下的血管生成有提示肿瘤血管生成和生理状态下的血管生成有明显不同。这一发现为血管生成的基础和临床明显不同。这一发现为血管生成的基础和临床研究提供了重要资料，也引起了血管生成和肿研究提供了重要资料，也引起了血管生成和肿瘤治疗研究者的重视。瘤治疗研究者的重视。第三节第三节肿瘤血管生成的调控机制肿瘤血管生成的调控机制肿瘤血管生成受多种血管生成因子肿瘤血管生成受多种血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的调控。肿瘤细的调控。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放部微环境发生变化的因素作用而合成和释放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成。大量血管生成因子从不同环节促进血管生成。组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子，组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子，对血管生成起抑制作用对血管生成起抑制作用。一、血管生成因子一、血管生成因子血管生成的始动需要血管生成因子。一系列血血管生成的始动需要血管生成因子。一系列血管生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏附分管生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏附分子及其抑制物，以及代谢性和机械性因子均参子及其抑制物，以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过程。与了血管生成过程。已知的血管生成因子有数十种，其中已知的血管生成因子有数十种，其中VEGF和和Ang家族是已知的、特异性作用于内皮细胞家族是已知的、特异性作用于内皮细胞的生长因子，在血管生成中作用可能也是最为的生长因子，在血管生成中作用可能也是最为重要的。重要的。(一一)VEGF及其受体家族及其受体家族1VEGF家族及其爱体家族及其爱体VEGF又称血管通透性因又称血管通透性因子子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，为分子量，为分子量3445kD的同源二聚体糖蛋白，属于碱性蛋白。的同源二聚体糖蛋白，属于碱性蛋白。VEGF基因通过转录水平的剪切，可产生基因通过转录水平的剪切，可产生5种变异种变异体，即体，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和和VEGFl21，分别由，分别由206、189、165、145和和121个氨基酸组成。个氨基酸组成。其中以其中以VEGF165最具特征性，其次是最具特征性，其次是VEGF121二者均为可溶性分泌蛋白，扩散力强，易于到达二者均为可溶性分泌蛋白，扩散力强，易于到达靶细胞。靶细胞。近年又发现其他一些与近年又发现其他一些与VEGF功能相似、结构功能相似、结构上有一定同源性的多肽因子，包括胎盘生长因子上有一定同源性的多肽因子，包括胎盘生长因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相关因子，相关因子，VEGF-relatedfactor，VRF)，VEGF-C(VEGF相关蛋白，相关蛋白，VEGF-relatedprotein，VRP)，以及，以及VEGF-DFIGF和和VEGF-E等成员，它们共同构成等成员，它们共同构成VEGF家族家族 VEGF受体包括受体包括VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1KDR)和和VEGFR-3(Flt-4)2VEGF及其受体的作用及其受体的作用:早期血管的形成需要早期血管的形成需要VEGF的调节，它们与内皮的调节，它们与内皮细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合，引起内皮细细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合，引起内皮细胞分裂和分化，并形成管腔样结构。胞分裂和分化，并形成管腔样结构。在胚胎发育过程中，在胚胎发育过程中，VEGF(主要是主要是VEGF-A)通过通过其受体其受体VEGFR-1(Flt-1)和和VEGFR-2(Flk-1KDR)促进内皮分化、增殖、迁移和原始血管形成促进内皮分化、增殖、迁移和原始血管形成.由新形成的内皮组装成管腔样结构需要由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR-1的表达和激活，而的表达和激活，而VEGFR-3的表达与内皮细胞形的表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关。成静脉或淋巴管有关。VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中发挥重要作用。生成中发挥重要作用。VEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达。有过表达。VEGF及其受体在肿瘤中的表达常与及其受体在肿瘤中的表达常与肿瘤分化程度密切相关肿瘤分化程度密切相关。大多数实体瘤大多数实体瘤VEGF基因均有过表达，基因均有过表达，VEGF165VEGF121两种两种VEGF最常见最常见。在在VEGF家族中，家族中，VEGF-C和和VEG-D既可诱导血管既可诱导血管生成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道，人生成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道，人体多种肿瘤细胞高表达体多种肿瘤细胞高表达VEGF-C。体内转基因实验也证实，肿瘤细胞体内转基因实验也证实，肿瘤细胞VEGF-C的高的高表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成。表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成。肿瘤组织中的肿瘤组织中的VEGF-C和和VEGF-D还来源于浸润的还来源于浸润的巨噬细胞。巨噬细胞。缺氧是包括胶质瘤细胞在内的许多细胞系产生缺氧是包括胶质瘤细胞在内的许多细胞系产生VEGF的一个强烈的诱导因子的一个强烈的诱导因子 离体条件下，葡萄糖缺乏亦是离体条件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因。表达的诱因。VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。肿瘤中诱生型一氧化氮合酶肿瘤中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平常与表达水平常与VEGF呈正相关，呈正相关，NO与与VEGF之间具有相互调节之间具有相互调节作用。作用。多种癌基因的激活通过上调多种癌基因的激活通过上调VEGF表达而诱导血表达而诱导血管生成，失活的抑癌基因管生成，失活的抑癌基因(如突变型如突变型p53基因基因)也参也参与了与了VEGF介导的血管生成过程。介导的血管生成过程。(二二)FGF家族及其受体家族及其受体1FGF家族家族目前研究最为深入的是碱性戒纤维目前研究最为深入的是碱性戒纤维细胞生长因子细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。bFGF和和aFGF在结构上是相关的，二者在结构上是相关的，二者之间有之间有53的序列同源。的序列同源。2FGF的分布和生物学作用的分布和生物学作用bFGF是体内分布是体内分布广泛的生长因子之一，可在不同肿瘤中表达，包广泛的生长因子之一，可在不同肿瘤中表达，包括膀胱癌、神经胶质瘤、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、括膀胱癌、神经胶质瘤、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细胞系都可以肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细胞系都可以合成它合成它。其功能具有多样性，可促进内皮细胞的有丝分裂、其功能具有多样性，可促进内皮细胞的有丝分裂、趋化性和迁移，刺激内皮细胞产生胶原酶降解基趋化性和迁移，刺激内皮细胞产生胶原酶降解基底膜，诱导来源于中胚层和神经外胚层细胞的增底膜，诱导来源于中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化。殖和分化。bFGF也表现出亲神经性行为，促进神也表现出亲神经性行为，促进神经元的存活和分化。经元的存活和分化。bFGF和和aFGF均与肝素有很强的亲和力，研究表均与肝素有很强的亲和力，研究表明这种高亲和力对于明这种高亲和力对于FGF与细胞表达的受体结合与细胞表达的受体结合是非常重要的是非常重要的。3FGF受体受体bFGF的生物学作用是通过与其特的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受体异性的细胞表面受体FGF受体受体(FGFreceptors，FGFR)结合而介导实现的。已经识别结合而介导实现的。已经识别4种种FGFR，包括包括FGFR-1(flg)、FGFR-2(bek)、FGFR-3和和FGFR-4。FGFR-1在在bFGFFGFR系统中的作用最大。正系统中的作用最大。正常脑神经元和胶质细胞中常脑神经元和胶质细胞中FGFR-1的表达呈现明显的表达呈现明显的异质性，即组织中有些细胞呈现的异质性，即组织中有些细胞呈现FGFR-1阳性，阳性，有些则显示阴性；血管内皮细胞亦是如此有些则显示阴性；血管内皮细胞亦是如此。(三三)AngiotropinAngiOtropin是一个含铜离子的是一个含铜离子的45kD核酸与核酸与多肽的聚合物。将多肽的聚合物。将angiotropin加入到已汇合的毛加入到已汇合的毛细血管内皮细胞培养基中，它以剂量依赖方式刺细血管内皮细胞培养基中，它以剂量依赖方式刺激内皮迁移并快速排列成管样结构，这种效应对激内皮迁移并快速排列成管样结构，这种效应对内皮细胞是特异的。由于它是巨噬细胞产生的化内皮细胞是特异的。由于它是巨噬细胞产生的化学调节剂，所以它可能启动炎症和伤口愈合中的学调节剂，所以它可能启动炎症和伤口愈合中的血管生成过程。血管生成过程。（四）血小板源内皮细胞生长因子四）血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)PD-ECGF是一个酸性是一个酸性45kD单链多肽。单链多肽。它是内皮细胞特异的有丝分裂素，能刺激人和它是内皮细胞特异的有丝分裂素，能刺激人和猪的内皮细胞增生。用猪的内皮细胞增生。用PD-ECGF转染肿瘤细胞，转染肿瘤细胞，其裸鼠移植瘤血管密度明显增加。其裸鼠移植瘤血管密度明显增加。(五五)其他血管生成因子其他血管生成因子Ang和和Tie受体家族受体家族 EGFTGF粒细胞集落刺激粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSFGMCSF)(七七)降解基底膜的相关物质降解基底膜的相关物质血管基底膜的降解是血管生成过程中的重要事血管基底膜的降解是血管生成过程中的重要事件，只有基底膜降解之后，内皮细胞才能迁移入件，只有基底膜降解之后，内皮细胞才能迁移入周围组织并形成血管芽周围组织并形成血管芽。基底膜的降解是一复杂过程，涉及一系列酶的作基底膜的降解是一复杂过程，涉及一系列酶的作用，这些酶包括基质金属蛋白溶酶、尿激酶型纤用，这些酶包括基质金属蛋白溶酶、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子维蛋白溶酶原激活因子(urokinase-typeplasminogen,u-PA)；丝氨酸蛋白酶；丝氨酸蛋白酶(serineproteases)、细胞外蛋白体、细胞外蛋白体(proteasome)、糖苷、糖苷酶酶(endoglycosidases)、组织蛋白酶、组织蛋白酶(cathepsins)和多形核白细胞丝氨酸蛋白酶和多形核白细胞丝氨酸蛋白酶(serineproteinase)。u-PA的作用涉及肿瘤的血管生成与侵袭过程。的作用涉及肿瘤的血管生成与侵袭过程。U-PA使纤维蛋白溶酶原转为纤维蛋白溶酶使纤维蛋白溶酶原转为纤维蛋白溶酶,后者能降后者能降解基质蛋白并激和几种基质金属蛋白酶解基质蛋白并激和几种基质金属蛋白酶。(八八)细胞外基质和基质黏附受体细胞外基质和基质黏附受体在血管生成型中不但需要细胞因子与相应受体在血管生成型中不但需要细胞因子与相应受体的结合，细胞外基质的结合，细胞外基质(extraceIlularmatrix,ECM)也起着重要作用。也起着重要作用。内皮细胞独自在接受生长因子的刺激时只表现增内皮细胞独自在接受生长因子的刺激时只表现增生，而在有细胞外基质的条件下，内皮细胞才能生，而在有细胞外基质的条件下，内皮细胞才能形成管腔样结构。形成管腔样结构。二、缺氧对血管生成的诱导作用二、缺氧对血管生成的诱导作用缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的重要刺缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧诱导激因素。缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧诱导因子因子-1、-2(hypoxiainducingfactor-l，-2，HIF-1HIF-2)和和NF-B,其中以其中以HIF-l在血管生成在血管生成中的作用最为重要。中的作用最为重要。在肿瘤组织中，缺氧一方面可导致瘤细胞死亡，在肿瘤组织中，缺氧一方面可导致瘤细胞死亡，另一方面也刺激残留瘤细胞上调血管生成因子的另一方面也刺激残留瘤细胞上调血管生成因子的表达。表达。第四节第四节血管生成的有关检测方法血管生成的有关检测方法一一.肿瘤血管生成的体内研究动物模型肿瘤血管生成的体内研究动物模型肿瘤血管生成体内研究的生物试验模型肿瘤血管生成体内研究的生物试验模型主要有动物主要有动物(大鼠，兔等大鼠，兔等)眼角膜囊眼角膜囊(眼前房眼前房)、地鼠颊囊、裸鼠外耳皮下和鸡胚绒毛尿、地鼠颊囊、裸鼠外耳皮下和鸡胚绒毛尿囊膜囊膜(CAM)等四种动物模型。国内学者对这等四种动物模型。国内学者对这四种模型均有研究。有研究认为四种模型均有研究。有研究认为CAM是研是研究血管生成较好的实验模型，其方法简便究血管生成较好的实验模型，其方法简便二成本低，仪器设备条件要求不高，易于二成本低，仪器设备条件要求不高，易于操作，便于推广；并可用于进行大样本研操作，便于推广；并可用于进行大样本研究，或用于影响血管生成的因素或药物的究，或用于影响血管生成的因素或药物的筛选和评价。因此，特将筛选和评价。因此，特将CAM试验方法作试验方法作简单介绍：简单介绍：鸡胚绒毛尿囊膜鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验实验:(1)鸡胚准备和接种组织：选择北京白鸡种鸡胚准备和接种组织：选择北京白鸡种蛋，洗净，用蛋，洗净，用l：1000苯扎溴铵苯扎溴铵(新洁尔灭新洁尔灭)液浸泡液浸泡3分钟，置分钟，置378土土05培养箱中培养箱中孵育。鸡胚发育第孵育。鸡胚发育第7天，蛋壳消毒后，标记天，蛋壳消毒后，标记制作制作2cmX3cm左右观察窗。接种组织视研左右观察窗。接种组织视研究目的而定，一定要在接种当日取材，充究目的而定，一定要在接种当日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成分清洗除去血污和粘液，再剪成12mm组组织小块。织小块。(2)组织接种：在制备鸡胚观察窗的次日，即组织接种：在制备鸡胚观察窗的次日，即鸡胚发育第鸡胚发育第8天进行组织接种。每个鸡胚可天进行组织接种。每个鸡胚可接种接种57个组织小块于接种部位个组织小块于接种部位CAM表面，表面，再用透明胶纸封好，继续孵育。再用透明胶纸封好，继续孵育。(3)接种组织的收获与观察：接种组织的收获与观察：组织接种后每组织接种后每12小时观察一次，到组织接种第小时观察一次，到组织接种第11天天(鸡胚鸡胚发育第发育第18天天)收获接种组织，取出鸡胚，置收获接种组织，取出鸡胚，置接种组织连同周围的接种组织连同周围的CAM于解剖显微镜下于解剖显微镜下观察，并用观察，并用10甲醛固定保存，部分组织甲醛固定保存，部分组织可作石蜡切片，用作血管生成研究的免疫可作石蜡切片，用作血管生成研究的免疫组化染色等。组化染色等。(4)CAM的血管生成表现：组织接种的血管生成表现：组织接种24小时小时后，后，CAM血管开始向接种组织生长，随培血管开始向接种组织生长，随培养时间的延长，血管数目及直径均明显增养时间的延长，血管数目及直径均明显增加；第加；第2天，新细小血管直接趋向组织；天，新细小血管直接趋向组织；第第3天，新生血管形成以接种组织为中心，天，新生血管形成以接种组织为中心，1020条放射状血管网；尔后，条放射状血管网；尔后，CAM血管血管继续明显增加。非接种部位与接种部位比继续明显增加。非接种部位与接种部位比较，较，CAM血管数目少，大血管与小血管呈血管数目少，大血管与小血管呈脉样均匀分布；而接种部位的脉样均匀分布；而接种部位的CAM血管在血管在接种组织周围弥散样增加，以组织为中心接种组织周围弥散样增加，以组织为中心向周围呈放射状分布，在首向周围呈放射状分布，在首先与组织发生先与组织发生联系的区域联系的区域CAM血管更多。第血管更多。第4天，可见天，可见新生细小新生细小CAM血管生长形成中、粗血管，血管生长形成中、粗血管，并在中、粗血管继续分支出细小血管，形并在中、粗血管继续分支出细小血管，形成新的血管网。成新的血管网。CAM血管管腔结构清晰，血管管腔结构清晰，可区别动、静脉。可区别动、静脉。(5)CAM血管生成实验模型的用途：血管生成实验模型的用途：CAM血血管生成模型用于血管生成的研究，可取得管生成模型用于血管生成的研究，可取得两方面结果：两方面结果：检测评价接种物刺激检测评价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促进因子、抑制因子的活性和作血管生成促进因子、抑制因子的活性和作用的检测，如肿瘤血管生成的研究等；用的检测，如肿瘤血管生成的研究等；对接种物，如肿瘤组织、自身的血管生成对接种物，如肿瘤组织、自身的血管生成进行研究，用于分析不同组织的血管生成进行研究，用于分析不同组织的血管生成活性和作用，如肿瘤组织有引发新生血管活性和作用，如肿瘤组织有引发新生血管生成的作用生成的作用.对照对照抗血管生成药物作用以后抗血管生成药物作用以后尽管血管生成的体内动物模型研究更为接近尽管血管生成的体内动物模型研究更为接近人体的生理状态，使研究结果更为可靠，人体的生理状态，使研究结果更为可靠，但但Kathryn等认为仍有一些不足之处，如操等认为仍有一些不足之处，如操作繁琐，耗时过长；另外，在该类模型中，作繁琐，耗时过长；另外，在该类模型中，血管生成物必须植入眼角膜囊、颊囊、或血管生成物必须植入眼角膜囊、颊囊、或绒毛尿膜囊使之诱导血管生成，难免产生绒毛尿膜囊使之诱导血管生成，难免产生人为因素诱导的血管生成；血管生成促进人为因素诱导的血管生成；血管生成促进因子、抑制因子等需要从多聚载体中释放因子、抑制因子等需要从多聚载体中释放出来；操作方法和测定其结果的技术较为出来；操作方法和测定其结果的技术较为复杂。由于这些不利之处，最近，复杂。由于这些不利之处，最近，Kathryn等又建立了一种新的血管生成模型等又建立了一种新的血管生成模型:二二.人胎盘血管培养实验人胎盘血管培养实验(体外体外)Kathryn等认为不但既往的体内血管生成实等认为不但既往的体内血管生成实验研究模型有上述不足之处，而体外的血验研究模型有上述不足之处，而体外的血管生成实验研究也主要是内皮细胞的长期管生成实验研究也主要是内皮细胞的长期培养，将内皮细胞置于细胞外基质环境，培养，将内皮细胞置于细胞外基质环境，或者暴露于各种血管生成刺激因子，使之或者暴露于各种血管生成刺激因子，使之诱导其血管形成。诱导其血管形成。该类体外实验研究，有很多人为因素影响，该类体外实验研究，有很多人为因素影响，不能代表体内生理反应，因为内皮细胞在不能代表体内生理反应，因为内皮细胞在生长因子存在的条件下培养了很长一段时生长因子存在的条件下培养了很长一段时间，已被激活。因此，有必要建立一类与间，已被激活。因此，有必要建立一类与体内生理反应有关的血管生成实验方法，体内生理反应有关的血管生成实验方法，尤其是与人类血管生成有关的血管生成实尤其是与人类血管生成有关的血管生成实验。验。于是，于是，Kathryn等建立了一种新的人血管等建立了一种新的人血管生成模型。从自愿选择剖腹产手术生成模型。从自愿选择剖腹产手术24小时小时之内的人胎盘顶端表面截取约长之内的人胎盘顶端表面截取约长25cm，直径为直径为l2mm的表浅血管，洗去血污，浸的表浅血管，洗去血污，浸入入Hank平衡盐溶液中。平衡盐溶液中。培养在培养在48孔培养板中进行，可在孔中分别加入各孔培养板中进行，可在孔中分别加入各种血管生成因子，再加种血管生成因子，再加l99培养基，将血管片段在培养基，将血管片段在凝固前迅速加入培养孔中央，理想的是使血管片凝固前迅速加入培养孔中央，理想的是使血管片段悬浮于培养胶中。然后将培养板置段悬浮于培养胶中。然后将培养板置37保湿孵保湿孵育培养育培养1421天，每周换培养基天，每周换培养基2次。用减数成次。用减数成相系统计；算原来血管条生成的血管索数量，每相系统计；算原来血管条生成的血管索数量，每隔一天计数新生长形成的微血管条数，由此描绘隔一天计数新生长形成的微血管条数，由此描绘微血管生长曲线。微血管生长曲线。用免疫组化、流式细胞仪、电镜等分别检测了用免疫组化、流式细胞仪、电镜等分别检测了CD34，Weibel-Palade小体标志物等，小体标志物等，证实新证实新生血管中含有内皮细胞。该实验模型不生血管中含有内皮细胞。该实验模型不需要加需要加外源性生长因子，并用该模型检测研外源性生长因子，并用该模型检测研究了究了aFGF、bFGF，三种，三种VEGF异构体及其受异构体及其受体体在原代血管生长及子代新生血管形成中的作用。在原代血管生长及子代新生血管形成中的作用。结果表明该模型是筛选人类血管生成潜在结果表明该模型是筛选人类血管生成潜在激激活增强因子和抑制因子行之有效的体外实验活增强因子和抑制因子行之有效的体外实验模型。模型。三三.肿瘤微血管密度计数肿瘤微血管密度计数(MVD)用用F因子单克隆抗体在组织切片上进行因子单克隆抗体在组织切片上进行免疫组织化学染色免疫组织化学染色,血管内皮细胞呈棕黄色血管内皮细胞呈棕黄色。MVD计数按计数按Weidner等的方法并加以改动，等的方法并加以改动，先在低倍视野内找到先在低倍视野内找到MVD最高的区域，然最高的区域，然后在高倍视野内计数微血管的数目。分辨后在高倍视野内计数微血管的数目。分辨不清或染色模糊的细胞不计入结果，单个不清或染色模糊的细胞不计入结果，单个的棕黄色内皮细胞或细胞簇作一个血管计的棕黄色内皮细胞或细胞簇作一个血管计数，但肌层较厚及血管腔面积数，但肌层较厚及血管腔面积8个红细胞个红细胞直径的血管不计数。计直径的血管不计数。计5个视野的个视野的IMVD，取其平均值作为取其平均值作为IMVD。四四.肿瘤血管生成调控因子的检测肿瘤血管生成调控因子的检测以以VEGF为例为例,根据实验条件和需要可以从蛋白根据实验条件和需要可以从蛋白质水平或核酸水平进行检测质水平或核酸水平进行检测:(一一)免疫组织化学检测免疫组织化学检测用用VEGF单克隆抗体在组织切片或细胞爬片单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上进行免疫组织化学染色上进行免疫组织化学染色,肿瘤细胞胞浆呈棕黄肿瘤细胞胞浆呈棕黄色色。培养的子宫内膜癌细胞培养的子宫内膜癌细胞VEGF阳性表达阳性表达培养的脑星形细胞瘤细胞培养的脑星形细胞瘤细胞VEGF阳性表达阳性表达培养的脑星形细胞瘤细胞培养的脑星形细胞瘤细胞VEGF阳性表达阳性表达(二二)Westernblot基本原理基本原理:免疫印迹又称免疫印迹又称Western印迹印迹(Westernblot)，与，与DNA的的Southern印迹技术相对应，印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体至一种固相载体(通常为通常为NC膜膜)，然后用探，然后用探针检测特异性组分。不同的是，针检测特异性组分。不同的是，Westernblot所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。行放射性标记。Westernblot的过程分四阶段的过程分四阶段a.蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定b.SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE）c.蛋白质的电转移蛋白质的电转移(转膜转膜)d.靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测(杂交杂交)1.蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定A.样品的制备样品的制备组织的处理方法：组织的处理方法：组织洗涤后加入组织洗涤后加入3倍体积预倍体积预冷的冷的PBS，0研磨，加入研磨，加入5STOPbuffer，180W，6mins，0超声波破碎，超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。加入离心，取上清。加入-ME(9.5ml加入加入0.5ml)，溴酚蓝（，溴酚蓝（9.5ml加入加入0.5ml）煮沸）煮沸10min，分装后于，分装后于-20保存，保存，用时取出，直接溶解上样。用时取出，直接溶解上样。细胞的处理方法细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入细胞培养瓶内加入5STOPbuffer，收集，收集，180W，6mins，0超声波破碎，超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。加入离心，取上清。加入-ME(9.5ml加入加入0.5ml)，溴酚蓝（，溴酚蓝（9.5ml加入加入0.5ml）煮）煮沸沸10min，分装后于，分装后于-20保存，用时取出，保存，用时取出，直接溶解上样。直接溶解上样。分泌蛋白的提取分泌蛋白的提取：直接收集分泌液，加入直接收集分泌液，加入-ME、溴酚蓝制样。、溴酚蓝制样。B.蛋白的定量方法蛋白的定量方法:a.双缩脲法：双缩脲法：b.Lowry法：法：c.紫外吸收法紫外吸收法:e.Bradford比色法：比色法：2.SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE）A：实际操作：实际操作做胶前的准备做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。和架子。2)检查是否有新鲜的，足量检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有，没有立刻重配。立刻重配。3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。制胶，电泳制胶，电泳1）装好架子。）装好架子。2)按照按照配方配制分离胶。配方配制分离胶。在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。集。3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。待分离胶凝集后，配制浓缩胶。倒好浓缩胶后插入预先准备好的梳子。倒好浓缩胶后插入预先准备好的梳子。4)待胶凝集好后，上样，电泳。上层胶用待胶凝集好后，上样，电泳