涂膜粉碎法制备原花青素缓释微粒的研究.pdf

308 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期收稿日期：2022-10-09基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81660665）；云南省重大科技专项：调节肠菌代谢的绿色食品开发（编号：202102AE090031）；云南省科技厅基础研究计划中医联合专项重点项目（编号：202001AZ070001-011）；云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目（编号：202205AC160038）作者简介：王皎，硕士，实验员，研究方向：中药药剂学，E-mail:*通讯作者：王文苹，博士，教授，研究方向：天然产物相互作用与高效递释，Tel:[phone]，E-mail:涂膜粉碎法制备原花青素缓释微粒的研究王 皎1,2，彭苑哲1，普 青1，王文苹1,2,3*（1.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；2.云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500；3.云南省南药可持续利用重点实验室，云南 昆明 650500）摘 要：目的 考察涂膜粉碎工艺对原花青素载药微粒形态和性能的影响。方法 分别制备原花青素、乙基纤维素及载药微粒，观测微粒形成过程和形态粒径，比较其红外光谱图，并测定载药量、包封率和体外释放曲线。结果 随着乙基纤维素含量的增加，所得载药微粒更均匀；在载药量10%50%范围内其包封率均高于65%；载药高达48%的微粒仍显示缓释特征，释放机制为Fick扩散，但因粒径较小导致释放较原料稍快。结论 涂膜粉碎法简单、高效、可控，适于制备载药微粒。关键词：载药微粒；涂膜粉碎法；原花青素；高效递药；傅立叶变换红外光谱中图分类号：R943 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）04-0308-06DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.04.004Study on Preparation of Proanthocyanidin-loaded Sustained-release Microparticles by Casting MethodWANG Jiao1,2,PENG Yuan-zhe1,PU Qing1,WANG Wen-ping1,2,3(1.College of Pharmaceutical Science,Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.The Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology in University of Yunnan Province,Kunming 650500,China;3.Yunnan Key Laboratory of Southern Medicine Utilization,Kunming 650500,China)Abstract:Objective To investigate the influence of casting technique on morphology and properties of proanthocyanidin-loaded ethyl cellulose microparticles.Methods The microparticles of pure drug,ethyl cellulose(EC)and their mixture were prepared via the casting method.The formation process and morphology of microparticles were observed by microscope and scanning electron microscope,respectively.The obtained samples were determined on their drug loading capacity,encapsulation efficiency and in vitro release profiles,and the interaction between drug and carrier was analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy.Results The particle sizes were more uniform as EC content increased,and the entrapment efficiency was above 65%within the range of 10%-50%of drug loading.The microparticles with the highest loading capacity of 48%still showed a sustained-release pattern and a drug release mechanism of Fick diffusion,but their smaller size induced a slightly faster release than pure drug.Conclusion The casting method is a simple,efficient and controllable technique for the preparation of drug-loaded microparticles.Key Words:drug-loaded microparticle;casting method;proanthocyanidin;efficient drug delivery;FT-IR食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期 309葡萄籽原花青素（PC）是由不同数量的儿茶素、表儿茶素单体聚合而成的多聚体，具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗辐射等药理作用；因结构中富含羟基，故抗氧化活性是维生素C的几十倍，是目前世界上公认的最有效的天然抗氧化剂，已在食品、药品和化妆品领域广泛应用1-3。但PC稳定性不佳，易受光照、温度、氧化剂等多重因素影响，且PC在胃肠道中不易吸收，口服生物利用度较低4，致使其应用受限。乙基纤维素（ethyl cellulose，EC）已广泛用作药物载体，其不溶于水，但在乙醇等有机溶剂中溶解性较高。EC具有无毒无害、廉价易得、富含羟基、易被改性、可生物降解、可塑性强等优点，可形成机械性能良好的韧性薄膜5。EC薄膜具有良好的热稳定性，即使在低温下仍保有一定的柔韧性。此外，还可通过一些简单的方法将EC制备成密度更小、力学性能更好的多孔聚合物微粒，粒径多为微米级，在药物的保存、运输、释放过程中起隔绝污染和破坏的保护作用，同时控制药物释放速度以改善药效6。EC在人体胃部酸性环境中也无法溶解，口服后能通过肠道排出，对人体无毒副作用。微粒是一种常见缓控释药物载体，其容纳范围广、释药行为可调，且能实现药物固态化和稳定化。其一般制法包括乳化-溶剂挥发、反溶剂沉淀、喷雾干燥或高压电纺丝工艺等，需特殊设备7；另有一种涂膜粉碎法，其操作简单、无需特殊设备和有机溶剂、物料利用率高，目前仅有少数报道涉及。因此本研究以EC为载体材料、PC为模型药物，采用涂膜粉碎法制备载药微粒，并初步考察工艺和药载比例对微粒形态、成型过程、载药量和包封率、相互作用、体外释放等的影响，为涂膜粉碎工艺的深入研究和推广利用提供参考。1 仪器与试剂1.1 仪器BCE224-1CCN十万分之一电子天平（北京赛多利斯）；T6新世纪紫外分光光度计（北京普析）；Great20傅立叶变换红外光谱仪（天津中科瑞捷）；TGL-16.5M高速冷冻离心机（上海卢湘仪）；MVE067464-60046-S Phenom飞纳台式扫描电镜（Thermo Fisher scientific）；THZ-100恒温培养摇床（上海一恒）；SG250HP超声波清洗器（上海冠特）；EU-KI-20TF纯水机（南京欧铠）；针头式过滤器（常德比克曼）。1.2 试剂PC（天津尖峰，批号：002-1905036-10）；EC（江西阿尔法高科药业，批号：20220210）；4-二甲基氨基肉桂醛（DMAC，上海麦克林）；氢氧化钠，磷酸二氢钾（天津风船）；盐酸（云南杨林工业开发区汕滇药业）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 PC测定方法用70%乙醇配制0.5 mg/ml PC溶液。精密量取1.00 ml PC溶液，用70%乙醇分别稀释4，5，6，8，10，18，40倍，分别取1 ml各浓度溶液和70%乙醇空白溶液，加DMAC显色剂83 ml，室温放置30 min，于644 nm处测定吸收值，以PC浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=6.4852C+0.0313，r2=0.9991。结果表明，PC在12.5125 g/ml浓度范围内线性关系良好。精密度试验RSD为0.39%，重现性试验RSD为1.75%，加样回收率在99.46%106.29%范围内，RSD为3.24%。2.2 微粒的制备采用涂膜粉碎法9：将PC、EC分别溶于80%乙醇溶液中，按药载比PC:EC=1:5，2:3，2:1混匀；将混合液涂布于水平洁净玻璃板上，室温下自然挥干，将膜刮下研细过100目筛，即得微粒样品，分别记为PE15、PE23、PE21，密封，置阴凉干燥处保存。同法分别制备空白微粒（EC-MP）和药物微粒（PC-MP）作为对照。2.3 微观形态取少量上述样品以双面导电胶固定于样品台上，喷金处理后置于扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）下观察其形态。结果见图1。由图1可知，PC原料呈皱缩粒子（图1A），个别为饱满球形、表面光滑，粒径约在1025 m范围内，大量粒子破裂、暴露出内部空心，壁厚约310 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期12 m；经醇溶挥干再粉碎后，PC形态发生显著改变（图1B），呈5080 m的疏松类球形微粒，由12 m球形或不规则粒子相互黏接、融合形成。EC本身为不规则颗粒、粒径较大（6070 m），表面粗糙、密布孔道、结构疏松（图1C）；经处理后，自发转变为均匀细小的球形微粒，直径约0.72 m、表面光滑，大量粒子密集排列、粘连成片（图1D）。当药物与辅料混合处置后，不同PC:EC比例所得样品含大量球形粒子、聚集成块片状（图1E、F、G）；样品中EC含量越高，则微粒粒径较小且均匀度更佳，其中PE15粒径为23 m，PE21粒径为310 m；随着PC比例增大，逐渐出现一些不规则块状物，其断面略粗糙，推测可能是在溶剂挥发过程中发生了相分离，形成微粒的同时产生块状物。还可能是因EC具有黏性，使载药微粒在干燥过程中形成粘连结块，在一定程度上影响微粒粒径分布。2.4 微粒形成过程的观测取少量药物、载体或二者混合溶液，滴至洁净载玻片上，置光学显微镜下，观察溶剂挥发过程中体系的动态变化，并录制视频，结果见图2。由图2可知，0 min时三者均有细小微粒浮动；PC在溶剂挥发过程中微粒沉积并逐渐聚集成片，形成药物富集区域，待溶剂挥干后PC聚集区更密集。溶剂挥发过程中EC无明显聚集，与0 min相比有明显的细小颗粒分散分布，2 min25 s时溶剂挥干，可看出溶剂挥干后有大量粒径约1 m的细小颗粒析出，终点时颗粒大部分呈均匀分布，少部分堆积。PE21在0 min出现稀疏的细小颗粒，1 min时与EC 3 min时现象类似，有密集细小颗粒均匀分布；随图2 PC、EC、PE21 挥发过程图（20）着溶剂挥发，发生相分离现象，呈现颗粒状和界限分明的沟壑状，可能是在此过程中EC包裹PC形成颗粒，而未被包裹的PC则以另一种形式存在，出现药物富集区。溶剂挥干后大部分区域呈均匀分布。2.5 载药量和包封率的测定准确称取5 mg微粒样品，加70%乙醇使其充分溶解并定容至10 ml，按2.1项下方法测定原花青素含量；按以下公式计算微粒的载药量和包封率，平行测定3次，结果见表1。图1 SEM下样品微观形态食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期 311表1 PE微粒的载药量和包封率（n=3）PE微粒载药量/%包封率/%PE1510.380.1365.700.83PE2335.130.4187.701.02PE2148.001.1774.231.81结果表明，PE微粒的包封率均较高，随着药物比例的增加，微粒载药量也在增加，但包封率先增后减。可能是因为EC具有黏性，使得载药微粒的载药量与包封率均较高。2.6 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）采用105 烘干5 h的溴化钾（KBr）混合研磨压片，扫描范围4000400 cm-1，分辨率4.0 cm-1，扫描信号累加次数为16次；分别对PC、PC-MP、EC、EC-MP、PC与EC物理混合物（PE-PM）、PE15、PE23、PE21进行扫描，并绘制FT-IR谱图，结果见图3。图3 FT-IR图谱由图3可见，PC在3356 cm-1处为其分子结构中酚羟基由氢键作用引起的伸缩振动，1606，1519，1445 cm-1处是苯环骨架中C=C的伸缩振动吸收峰；1281，1152，1108，1060 cm-1对应的吸收峰为PC分子结构C环的C-O-C的伸缩振动；PC-MP与PC的红外吸收特征基本一致。EC在3477和2984 cm-1处的吸收峰由其分子中的-OH和-CH2伸缩振动产生，-CH3弯曲振动形成1380 cm-1处的峰。EC-MP相应位置的吸收峰均减弱。物理混合物的红外图谱基本为PC和EC的叠加。载药微粒的红外谱图基本一致且与原花青素谱图类似，表明载药微粒里的化合物主要以原花青素为主，苯环骨架C=C的伸缩振动吸收峰红移，载药微粒谱图在3416 cm-1处有吸收峰，这可能是因为原花青素与载体物质产生了分子间作用力，形成了氢键，-OH伸缩振动蓝移变为O-H伸缩振动产生的。1606 cm-1处为PC的特征峰，在PE-PM图谱中的同一位置仍存在且强度增大，表明PC未被EC包裹并与其发生相互作用，与载药微粒相比，同一位置的峰仍存在但强度减弱，表明PC被EC包裹，且随PC的比例增加，1606 cm-1处的峰强度逐渐增大，表明有部分PC未被EC包裹，载药微粒可能会发生相分离现象。EC在3477，2984 cm-1处的吸收峰可为其特征峰，在PE-PM谱图中仍存在，但强度减弱，表明PC与EC物理混合时可能形成氢键，从而影响其强度。与载药微粒相比，同一位置的峰仍存在，但由于EC将PC包裹产生分子间作用力，使其强度更弱。2.7 体外释放考察分别精密称取一定量的PC-MP、PE21于5 ml离心管中，加入3 ml释放介质（pH 6.8磷酸盐缓冲液），离心管置于恒温培养摇床内（370.5，100 r/min），分别于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h高速（10 000 r/min）离心5 min后，取上清（2.7 ml），同时补充同温等量介质，经0.22 m水系针头式微孔滤膜过滤，取续滤液 1 ml，按2.1项下方法测定PC含量，平行测定3次，据PC标准曲线计算浓度，根据以下计算累积释放量（Q）10，并以累积释放量对相应的时间作图，分别绘制体外释放曲线。其中，V0为释放介质总体积；Vi为释放介质置换体积；Ci为在第i个时间点取样时释放介质中的药物浓度；m为微粒所载药物总质量；n为取样次数，结果见图4。图4 原花青素缓释微粒累计释放曲线312 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期由图4可知，两者在12 h时均已释放80%，24 h释放较完全；PE21在0.5 h时释药略低于PC-MP，此后均较高；PE21在12 h内的释放呈典型的缓释特征，而PC-MP在2 h内快速释放50%之后，此后10 h内释药速率几乎恒定。0.5 h之前PC-MP是直接释放，PE21因缓释材料EC的存在使得释放减慢，0.5 h之后PC-MP释药速率低于PE21。PE21的粒径为310 m，PC-MP粒径1025 m，PE21粒径小、比表面积大，且EC具有黏性使载药微粒表面吸附有PC，0.5 h后，微粒表面吸附及靠近微粒外层的药物迅速释放，使得PE21在0.5 h后的释放较快，此后，因EC的存在出现缓释特征。2.8 模型拟合与释药机制分析为了进一步阐明不同药载比原花青素微粒的体外释药特性，探讨其释药机理，在上述结果的基础上，采用4种动力学模型对PC-MP、PE21的释放曲线进行拟合11，包括：零级动力学模型（Qt=kt）、一级动力学模型ln（1-Qt）=-kt、Higuchi模型（Qt=kt0.5）、Ritger-Peppas模型（Qt=ktn）。式中：为t时刻的累积释放分数；k为释放常数；Ritger-Peppas模型中的n值表示释放机制，n0.45为菲克扩散（Fick diffusion），n0.89为骨架溶蚀，当n值介于二者之间为非菲克扩散（结合扩散与骨架溶蚀作用）12。根据所得方程的相关系数R2，判断释放方程拟合的最佳模型。表2 原花青素缓释微粒体外释放的拟合结果模型PC-MPPE21拟合结果相关系数R2拟合结果R2零级动力学模型Qt=0.0235t0.7916Qt=0.0249t0.6071一级动力学模型ln（1-Qt）=-0.0893t0.9490ln（1-Qt）=-0.4552t0.9265Higuchi模型Qt=0.1425t0.50.9455Qt=0.1611t0.50.8235Ritger-Peppas模型Qt=0.0367t0.26110.9894Qt=0.1097t0.3580.9476由表2可知，零级动力学模型拟合结果最差，表明药物与微粒释放不是恒定的即非控释；一级动力学模型拟合效果仅次于Ritger-Peppas模型，且PC-MP的R2大于PE21，原因可能是累计释放曲线PC-MP在212 h阶段为一级动力学释放。原花青素微粒的体外释放最佳模型为Ritger-Peppas模型，两者n值均小于0.45，因此其释放机制为菲克扩散，属于非稳态扩散。3 讨论据图1结果推测生产PC时可能采用了喷雾干燥工艺，因而形成了大量中空球形粒子、且在快速固化过程中发生表面塌陷，这与文献报道中喷雾干燥过程中的条件、处方组成等多种因素造成可能造成微粒表面皱褶相符合13-14。而本文采用涂膜粉碎法制备微粒的过程中，将PC粒子复溶、自然挥干之后再粉碎，完全改变了PC原料药的原有形貌，与文献中采用涂膜粉碎法制备微胶囊的结果相似9，均呈现不规则的颗粒且粒径较大。比较EC涂膜粉碎法处理前后，EC粒子的形态改变更明显，从酥松块状物转变为成片的细小均匀微粒，此结果与EC的特性一致。此法操作简单，可用于制备微米级且密度更小、力学性能更好的聚合物微粒。以上可表明不同的制备工艺对粒子形态有极大影响。研究表明，当溶液中化合物浓度超过其无定形形式的溶解度时，就会在过饱和溶液中形成聚集体。在此浓度（通常为结晶溶解度的550倍）下，会超过化合物液体形式的混溶性极限，并发生液-液相分离（LLPS），从而形成初始为胶体大小的药物富集相15。因PC的极性比EC大，亲水性较EC好，在乙醇溶剂挥发剩余部分水时更易形成药物富集区；而EC不溶于水、极性小，在溶剂中乙醇挥发完之后产生相分离且比PC早，不易形成药物富集区；载药微粒因PC与EC发生相互作用形成分子间氢键，EC极性小于PC，且PC结构中有苯环不易变形，EC结构中无苯环易变形，在乙醇挥发之后EC不溶于剩余水分，使得EC包裹PC形成较规则且粒径较EC大的粒子，未被包裹的PC则形成药物富集区。还可能因EC具有黏性，可吸附PC形成药物富集区，在干燥过程中形成粘连结块。本文采用涂膜粉碎法成功制备了载PC的EC缓食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期 313释微粒，结果表明通过改变药载比能方便有效地调节所得载药微粒的形态，进而影响其载药和释药性能，证实涂膜粉碎用于制备载药微粒高效便捷、可控性强。本研究为涂膜粉碎工艺推广用于其他活性成分制剂开发奠定了基础，也对微粒结构和性能的调控策略进行了有益探索。参考文献1 金波.葡萄籽原花青素复合微生态制剂的制备及安全性和有效性评价D.长春:吉林大学,2022.2 刘荣丽,钟碧萍,黄宏南,等.高效液相色谱法测定缓解视疲劳片中原花青素的含量J.食品与药品,2014,16(3):193-195.3 杨亚超,宁梦帆,菅蓁.烟台产区酒渣葡萄籽原花青素含量与抗氧化性研究J.现代食品,2022,28(9):173-175,184.4 冯占芹.原花青素/壳聚糖缓释微粒的构建及对大鼠放射性肺损伤的治疗作用D.潍坊:潍坊医学院,2015.5 方舟,黄凤林,罗来福,等.乙基纤维素用作药物载体的研究进展J.化工设计通讯,2019,45(8):204-205.6 刘梦实.多功能聚合物材料乙基纤维素微粒的制备及其对染料污水的催化降解性能研究D.兰州:西北民族大学,2022.7 姚清艳,王燕清,朱建华,等.微球制剂的研究进展J.食品与药品,2018,20(5):382-386.8 乔洪翔,任红,陈君,等.银杏叶制剂中原花青素含量测定方法比较J.海峡药学,2017,29(8):61-63.9 郭立华,陈野,李秀明,等.玉米醇溶蛋白微胶囊的制备及缓释性能J.食品研究与开发,2013,34(4):61-64.10 陈海珍,施江培,顾笑妍,等.“壳-核”型纳米粒的“壳”组成对克服口服生理屏障及生物利用度的影响J.中国中药杂志,2022,47(13):3475-3480.11 吕凤娇,蔡菊虹,陈西林,等.黄芩苷壳寡糖纳米粒的体外释放与模型J.泉州师范学院学报,2021,39(6):1-6.12 Cui Y,Zhao B,Xie F,et al.Study on the preparation and feasibility of a novel adding-type biological slow-release carbon sourceJ.J Environ Manage,2022,316:115236.13 He P,Davis S S,Illum L.Chitosan microspheres prepared by spray dryingJ.Int J Pharm,1999,187(2):53-65.14 亢思莹,顾宙辉,黄鑫.喷雾干燥技术在固体分散体制备中的应用J.药学与临床研究,2022,30(2):159-161.15 Trasi N S,Taylor L S.Taylor.Thermodynamics of highly supersaturated aqueous solutions of poorly water-soluble drugsimpact of a second drug on the solution phase behavior and implications for combination productsJ.J Pharm Sci,2015,104(8):2583-2593.响应面法优化双柏散中总黄酮的超声波萃取工艺刘建清，林水森，谢志新，谢娜娜（泉州医学高等专科学校 药学院，福建 泉州 362000）摘 要：目的 优化双柏散中总黄酮超声波萃取工艺。方法 以总黄酮提取率为评价指标，采用响应面法优化超声波萃取中乙醇浓度、液料比、超声温度及超声频率。结果 确定超声波萃取条件为乙醇浓度62%、液料比25、超声温度54，总黄酮提取率为8.8%。结论 该方法稳定、可靠、准确，可用于双柏散中总黄酮超声波萃取。关键词：双柏散；总黄酮；响应面法；超声波中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）04-0313-05DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.04.005Optimization of Ultrasonic Extraction Process of Total Flavonoids from Shuangbai Powder by Response Surface MethodologyLIU Jian-qing,LIN Shui-sen,XIE Zhi-xin,XIE Na-na(College of Pharmacy,Quanzhou Medical College,Quanzhou 362000,China)Abstract:Objective To optimize the ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Shuangbai Powder.收稿日期：2023-01-06基金项目：泉州医学高等专科学校校级课题（编号：XJK2013B）作者简介：刘建清，男，硕士，助教，研究方向：药物新剂型与新技术，E-mail: