水稻OsRIP基因家族的全基因组鉴定及其表达分析.pdf

张琪，刘爽，胡艳娟，等.水稻OsRIP基因家族的全基因组鉴定及其表达分析J.沈阳农业大学学报，2023，54（4）：385-395.沈阳农业大学学报，2023，54(4)：385-395Journal of Shenyang Agricultural Universityhttp：/DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2023.04.001收稿日期：2023-06-09基金项目：科技部国家重点研发计划项目(2017YFD0300107)；国家自然科学基金项目(32070642)第一作者：张琪（1994-），女，博士研究生，从事水稻分子生物学研究，E-mail：通信作者：王晓雪（1963-），女，博士，教授，博士生导师，从事水稻分子生物学研究，E-mail：水稻OsRIP基因家族的全基因组鉴定及其表达分析张琪，刘爽，胡艳娟，王晓雪（沈阳农业大学 水稻研究所，沈阳 110161）摘要：水稻(Oryza sativa)中RIP基因家族编码典型的E3泛素连接酶，在生长发育、逆境响应过程中发挥重要作用。利用水稻基因组数据，采用生物信息学方法鉴定了水稻中的RIP基因家族成员，鉴定到6个RIP家族基因，命名为OsRIP16，其编码区长度在9061086 bp之间，分布在5条染色体上，内含子数量为23个。水稻中RIP基因被分为3个亚家族，每个亚家族的内含子数量、基因结构、motif基本一致。蛋白结构域分析结果表明，在水稻中，RIP家族的所有成员均含有SINA和RING结构域。共线性分析显示，水稻与玉米存在最多的共线对，与拟南芥不存在共线对。对启动子顺式作用元件分析发现，RIP基因启动子区有多个非生物胁迫响应元件、光响应元件及激素响应元件。另外，还分析RIP基因家族在不同组织器官、不同发育时期及昼夜节律的表达模式，结果表明在根、茎及花器官中表达水平较高；OsRIP6在播种后83 d表达水平最高，而其他成员在播种后4869 d的表达处于较高水平；昼夜表达的分析结果显示，在光照后10 h该基因家族成员的表达水平较高。在ABA、JA激素和干旱胁迫、盐胁迫处理下，OsRIP15表达水平上调，OsRIP6在JA、盐胁迫和甘露醇模拟干旱胁迫时表达被抑制。对水稻OsRIP基因家族进行了全面的分析，为进一步揭示OsRIP基因的生物学功能奠定基础。关键词：水稻；RIP；基因家族；进化分析；表达分析中图分类号：S792.186文章编号：1000-1700（2023）04-0385-11文献标识码：A开放科学（资源服务）标识码（OSID):Genome-wide Identification and Expression Analysis of the OsRIP GeneFamily in RiceZHANG Qi,LIU Shuang,HU Yan-juan,WANG Xiao-xue（RiceResearchInstitute,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China）Abstract：The RIP gene family in rice(Oryza sativa)encodes a typical E3 ubiquitin ligase that plays an important role in growth anddevelopment,and in response to stress.In this study,we used rice genomic data to identify the RIP gene family members in rice usingbioinformatics methods,and identified six RIP family genes,named OsRIP1-6,with coding regions ranging from 906-1086 bp inlength and distributed on five chromosomes with 2-3 introns.The RIP genes in rice were divided into three subfamilies,and thenumber of introns,gene structure,and motif of each subfamily were basically the same.The results of protein structural domainanalysis showed that in rice,all members of this gene family contain SINA and RING structural domains.Synteny analysis showed thatthere were the most syntenic relationship with maize and no syntenic relationship with Arabidopsis.Analysis of promoter cis-actingelements revealed multiple abiotic stress response elements,light response elements and hormone response elements.This study alsoanalyzed the expression patterns of the RIP gene family in different tissues and organs,different developmental periods and circadianrhythms,and the results showed that the expression levels were higher in root,stem and flower,OsRIP6 had the highest expressionlevel at 83 days after sowing,while the highest expression of other members was at 48-69 days after sowing.The analysis of diurnalexpression showed that the expression level of this gene family member was higher at 10 h after light.The expression levels ofOsRIP1-5 were up-regulated under ABA,JA,drought stress and salt stress treatments,wheareas OsRIP6 expression was suppressedunder JA,salt stress and mannitol treatment.This study provides a comprehensive analysis of the OsRIP gene family in rice and laysthe foundation for further revealing the biological functions of OsRIP genes.Key words：rice;RIP;gene family;phylogenetic analysis;expression analysis-沈阳农业大学学报第 54 卷在自然环境中，植物始终面临着很多与它们生存相关的生物与非生物胁迫。为了应对逆境，植物进化出不同的机制来调节自身的生长发育1-6。泛素(ubiquitin)是小分子量的蛋白质，含有76个氨基酸。蛋白质的泛素化(ubiquitination)是指在一系列酶的催化下，将泛素分子连接到靶标蛋白质的赖氨酸残基上的过程，是蛋白质翻译后修饰的重要形式，被多泛素化的蛋白质通过26S蛋白酶体降解7。这一过程在调节植物生长发育中扮演重要角色，同时也是调控植物对生物、非生物胁迫响应的重要机制之一5,7-8。水稻中的 RMD Interacting Proteins(OsRIP)基因家族含有Really Interesting New Gene(RING)-HC结构域和SEVEN IN ABSENTIA(SINA)结构域，是典型的E3泛素连接酶9-10。鉴定和分析水稻中RIP基因家族成员和编码蛋白质的理化特性、结构域和进化关系，分析其在激素和非生物胁迫处理后的表达模式，对深入研究水稻RIP基因家族在激素信号转导及非生物胁迫响应中的作用具有重要的理论和实践意义。蛋白质的泛素化(ubiquitination)是指在E1泛素激活酶(E1 ubiquitin-activating enzyme)、E2泛素结合酶(E2ubiquitin-conjugating enzyme)、E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligase)的催化下，将泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上，对蛋白质进行翻译后修饰的过程。被多泛素化的蛋白质通过26S蛋白酶体(26S proteasome system)降解，被称为泛素化介导的26S蛋白酶体降解途径7。E3泛素连接酶是决定底物特异性的关键酶，它能够将泛素分子与靶蛋白的赖氨酸残基结合，从而降解、调控靶蛋白11-13。目前在植物中已发现数百种E3泛素连接酶，共分为四种类型，分别为RING泛素连接酶、homologous to E6-AP carboxy terminus(HECT)泛素连接酶、U-box泛素连接酶以及Cullin-RING ligases(CRLs)泛素连接酶7,14-15。其中RING型E3泛素连接酶数量最多，在调节种子萌发、开花期、激素响应过程中发挥重要作用16-18，研究发现，Delayed Seed Germination 1(OsDSG1)是一种C3HC4型RING泛素连接酶，通过与Rice ABA Insensitive 3(OsABI3)相互作用，调节水稻生长发育。osdsg1基因功能缺失突变体的种子萌发延迟，耐盐和耐旱能力显著增强19。水稻中的SINA型E3泛素连接酶Flowering-Related RING Protein 1(FRRP1)与Rice Histine 2B(OsH2B)互作，通过影响Heading date 3a(Hd3a)的表达来调控水稻开花期20。近年来，RING型E3泛素连接酶在各种非生物胁迫响应中发挥的作用被广泛研究21-25。研究发现，含有 RING 结构域的 E3 泛素连接酶 Salt-induced RING finger protein 4(OsSIRP4)，可以使 Peroxisomalmembrane protein 11-1(OsPEX11-1)蛋白多泛素化降解，对盐胁迫起负向调节作用，过表达OsSIRP4的转基因植株表现出对盐敏感的表型26。C3HC4型RING泛素连接酶RING finger protein v6(OsRFPv6)通过调控Na+离子吸收影响水稻的耐盐性，是盐胁迫的正向调节因子12,26。SINA型E3泛素连接酶是RING型泛素连接酶的成员，它的特点是N端含有一个RING结构域，负责结合E2蛋白分子，对SINA型E3泛素连接酶活性具有决定性作用；C端含有一个SINA结构域，在动物和植物中高度保守27。SINA型E3泛素连接酶在调控植物的生长发育、逆境响应过程中发挥重要作用21,28-29。香蕉(Musa acuminata)中的SINA型E3泛素连接酶MaSINA1通过调节INDUCER of CBF Expression 1(MaICE1)的稳定性而对冷胁迫起着负向调节作用30。在玉米和水稻中，Salt-and Drought-Induced RING finger 1(SDIR1)超表达转基因株系耐旱性增强，进一步研究发现SDIR1通过调节其靶蛋白SDIR1-Interacting Protein 1(SDIRIP1)的稳定性来调控对盐和干旱的反应13。E3泛素连接酶在调控植物的生长发育、逆境响应过程中发挥重要作用，但对水稻中具有E3泛素连接酶活性的OsRIP基因家族的系统鉴定及在逆境响应过程中的作用未见详细报道。本研究鉴定了水稻RIP基因家族的所有成员，分析OsRIP蛋白质的理化性质、蛋白质的结构、保守基序、进化关系、分析OsRIP基因的染色体定位，共线性，启动子顺式作用元件、表达模式以及在非生物胁迫响应中的表达模式，为深入研究OsRIP在水稻生长发育和逆境响应过程中的生物学功能奠定基础。1材料与方法1.1水稻材料与处理用75的酒精处理沈农9816(SN9816)种子1 min，在30 的条件下浸种、催芽；将发芽的种子在14 h光照、10h黑暗的条件下培养2周。然后，将培养2周的幼苗分别用20 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、150 mmolL-1NaCl、100 mmolL-1甘露醇(mannitol)、用 100 M 脱落酸(abscisic acid,ABA)和 100 M 茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理幼苗，在处理后0，6，12 h后分别采样，-80 保存备用。386-第 4 期张琪等：水稻OsRIP基因家族的全基因组鉴定及其表达分析1.2方法1.2.1水稻OsRIP家族成员的全基因组鉴定在Ensembl Plants数据库(http:/plants.ensembl.org/index.html)下载各物种全基因组数据。利用保守结构域预测网站Pfam(http:/pfam.xfam.org/)和SMART(http:/smart.embl.de/)进行结构域分析，下载基因的隐马尔可夫模型，在不同物种的全基因组蛋白序列数据中检索，运用BLAST对数据库进行比对，将所得到的序列合并去掉重复，获取RIPs基因家族的备选成员，阈值设定为 E1e-5。将所有鉴定得到的候选基因序列提交到InterPro数据库(http:/www.ebi.ac.uk/interpro/)、SMART数据库以及 NCBI CDD-search数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)验证蛋白保守结构域。1.2.2OsRIP基因家族的特征分析利用ExPASy Proteomics Server网站(http:/web.expasy.org/protparam/)在线分析6个基因的氨基酸数、相对分子量、理论等电点、不稳定系数31。利用亚细胞定位预测网站PSORT Prediction(http:/psort1.hgc.jp/form.html/)进行蛋白定位分析。利用GSDS 2.0(http:/gsds.gao-lab.org/)绘制基因结构图。利用Mapchart软件工具进行OsRIP基因染色体位置可视化分析。1.2.3保守基序分析为了鉴定RIP蛋白家族中的保守基序，使用在线分析网站MEME(http:/meme-suite.org/)分析了OsRIP基因家族基序，基序数量设置为8个，其余参数默认。1.2.4系统发育分析将基因家族成员用MEGA软件进行序列比对，以最大释然法(Maximum Likelihood)构建进化树。用进化树美化软件EvolView(https:/www.evolgenius.info/evolview-v2/#login)生成进化树。1.2.5顺式作用元件分析基于水稻基因组数据，使用TBtools软件提取OsRIP基因家族上游 2000 bp(起始密码子ATG之前)序列作为顺式作用元件分析序列。使用在线分析网站PlantCARE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用元件的分析32。1.2.6表达模式分析用在光照14 h和黑暗10 h条件下生长2周龄的沈农9816(SN9816)的幼苗，在胁迫和激素处理前后采样。提取样品的总RNA，最后反转录为cDNA，进行quantitative RT-PCR(qRT-PCR)。qRT-PCR所用引物如表1。微阵列数据来自水稻表达谱数据库RiceXPro(https:/ricexpro.dna.affrc.go.jp/)。用50 M ABA 和100 M JA处理水稻四叶老苗0，1，3，6，12 h；进行3次生物重复，用处理后的幼苗进行微阵列分析。用TBtools绘制热图33。基因名称Gene nameOsRIP1OsRIP2OsRIP3OsRIP4OsRIP5OsRIP6正向引物序列(5-3)Forward primer sequenceCTGAATCGCTTGAGCTACCCTGCCCTTATGCTGGTTCTGATGTGCTGTGGTGGGTGATATTACATGGCGTTCCTGAGGTTGATCCTGTTCCGCATTCACCCACACCCAGCATTCACCAAA反向引物序列(5-3)Reverse primer sequenceGCAGAAGTACTGCCCAAAGCACTGCCCGAAACAATGGAACTAGACTGGTGCCATCCCAAGTTCTTGTGGCTGTCCCTGATCCACCTTCTCGAGAGCAAGAGGCTTGCATCCGGAACATAG表1引物列表Table 1The list of primer sequences2结果与分析2.1水稻中OsRIP基因家族的鉴定及蛋白的理化性质分析OsRIP1是E3泛素连接酶，具有SINA保守的结构域9。为了鉴定水稻中OsRIP基因家族的成员，本研究利用有保守的SINA结构域的OsRIP1，检索水稻全基因组，共有 6个编码SINA结构域的基因，进一步利用InterPro、SMART和NCBI数据库对水稻中OsRIP蛋白家族进行了鉴定，结果发现，在水稻中共存在6个OsRIP蛋白，分别命名为OsRIP16(图2A)。本研究利用ExPASy Proteomics Server 网站分析了OsRIP家族蛋白质的氨基酸数、相对分子量、理论等电点(isoelectronic point,PI)、不稳定系数，并通过 PSORT Prediction网站预测了该蛋白家族的亚细胞定位。结果表明，OsRIP理论等电点在6.267.51，其中只有OsRIP5的PI值大于7，为碱性蛋白质，其余5个成员的PI值小于7，为酸性蛋白质(表2)。不稳定系数除OsRIP6外均大于40，表明该基因家族编码的蛋白大多为不稳定蛋白。OsRIP家族CDS编码区的长度在9061086 bp，氨基酸(amino acid,aa)数量在301361 aa，相对分子量在34.1387-沈阳农业大学学报第 54 卷39.2 kDa。亚细胞定位预测的结果为OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3、OsRIP4、OsRIP6定位在细胞质中，而OsRIP5在细胞核、细胞质和质膜上均有分布(表2)。图1OsRIP基因在染色体中的定位Figure 1Location and distribution of OsRIP genesin chromosomes基因名称Gene nameOsRIP1OsRIP2OsRIP3OsRIP4OsRIP5OsRIP6序列号Locus IDOs02t0293400Os05t0238200Os01t0234900Os02t0128800Os03t0356414Os07t0659800编码区长/bpCDS length105010861044927906909氨基酸长度/aaAmino acid length349361347308301302分子量/kDaMolecular weight38.239.243.234.734.134.4等电点Isoelectronic point6.266.616.596.667.516.92不稳定系数Instability index44.3541.7942.9243.2741.9136.01亚细胞定位Subcellular localizationCytoCytoCytoCytoNuc,Cyto,PMCyto表2水稻OsRIP基因家族成员及其编码蛋白的理化性质Table 2OsRIP gene family members and physicochemical properties of the encoded proteins in rice注：Cyto.细胞质；Nuc.细胞核；PM.细胞质膜。Note：Cyto.cytoplasm；Nuc.nucleus；PM.plasma membrane.2.2OsRIP基因家族的染色体定位利用Mapchart软件分析了OsRIP基因在染色体上的位置，结果显示，在水稻的12条染色体上只有1，2，3，5，7染色体上分布着OsRIP基因，在2号染色体上有OsRIP1和OsRIP4两个基因，他们之间的间隔为9.6 Mb，并不是串联重复基因。在1，3，5，7号染色体分别只含有1个OsRIP基因(图1)。2.3基因结构分析基因结构的多样性是研究基因家族功能和进化的重要依据。本研究利用MEGA-X软件绘制水稻中OsRIP基因家族的系统发育进化树，并将这6个蛋白分为了3个亚家族，其中OsRIP1，OsRIP2，OsRIP3为第亚家族，OsRIP5、OsRIP6为第亚家族，OsRIP4为第亚家族(图2A)。本研究利用GSDS网站分析了基因结构进行，发现基因家族成员含有34个外显子和23个内含子(图2B)。与系统发育进化树相结合分析发现其内含子与外显子的分布可能与进化关系有关，第亚家族均含有2个内含子，3个外显子；而第、亚家族含有3个内含子和3个外显子(图2A,图2B)。不同的蛋白质结构域通常具有不同的功能。本研究利用Pfam数据库分析了OsRIP蛋白质的结构域，结果发现，所有OsRIP蛋白质C端含有SINA结构域，N端为RING-HC结构域(图2C)。OsRIP蛋白序列比对的结果表明，SINA和RING-HC结构域在水稻中是保守的(图2D)。2.4水稻OsRIP蛋白保守基序分析本研究利用MEME网站分析了OsRIP基因家族保守基序(motif),分析发现，OsRIP蛋白质共有8个基序，含有1550 aa 的氨基酸序列(表3)。为进一步揭示OsRIP蛋白进化与保守基序的关系，本研究利用TBtools绘制了OsRIP系统进化、保守基序分析图。结果表明，亲缘关系越近的蛋白，motif的数量和位置越相似。OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3蛋白亲缘关系更近，它们均含有8个motif，且分布位置、顺序相对一致，N端均为Motif 8，C端均为Motif 7(图3)。Motif 7、Motif 8为第亚家族OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3特有的。OsRIP4、OsRIP5、OsRIP6只有6个Motif，OsRIP5、OsRIP6在同一亚家族，motif的种类、数量和位置完全一致。Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5及Motif 6在OsRIP家族所有成员中均存在。以上结果表明OsRIP基因家族Motif高度保守。2.5进化分析本研究在Ensembl Plants数据库下载了水稻、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)和小麦(Triticum aestivum)的全基因组数据。利用保守结构域预测网站 Pfam 和Chromosome length Mb05101520253035407.4Chr.1Chr.2Chr.3Chr.5Chr.7OsRIP6OsRIP2OsRIP5OsRIP1OsRIP4OsRIP31.511.113.68.427.8388-第 4 期张琪等：水稻OsRIP基因家族的全基因组鉴定及其表达分析SMART分析OsRIP1结构域，下载基因的隐马尔可夫模型，在不同物种的全基因组蛋白序列数据中检索，运用BLAST对数据库进行比对，阈值设定为 E1e-5。将所有鉴定得到的RIP候选基因序列提交到InterPro数据库、SMART数据库以及 NCBI数据库验证蛋白保守结构域，每个蛋白都包含SINA这一保守的结构域。结果发现，RIP蛋白在不同物种中的数量分别为：玉米中10个，大豆中40个，大麦中27个，小麦中72个，拟南芥中17个。为了分析RIP家族各成员之间的进化关系，利用MEGA软件构建了一个系统发育进化树。水稻中的OsRIP5、OsRIP6分布在第组，OsRIP4、OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3在第组，但OsRIP4与OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3距离较远(图4)。通过统计与水稻中OsRIP基因在同一组中的其他物种中的同源基因的数量发现，小麦、玉米中同源基因的数量最多，分别为15个和8个。大麦中的同源基图2OsRIP家族基因结构和保守结构域分析Figure 2Analysis of gene structure and conserved domains of OsRIP family基序MotifMotif 1Motif 2Motif 3Motif 4Motif 5Motif 6Motif 7Motif 8序列SequenseTFNHRYVKSNPREVENATWMLTVFHCFGQYFCLHFEAFQLGMAPVYMAFLWEGTPRSIRDSHRKVRDSHDGLIIQRNMALFFSGGDRKELKLRVTGRIWKCPVCTNSMYPPIHQCQNGHTLCSTCKARVHNRCPTCRQELGDIRCLALEKIFPYYSKIKHEAQCSFRPYNCPYAGSECAVAGDIPFLVAHLRDDHKVDMHRFMGDENEARNYTYSLEVGGNAESLELPCKYCSLGCEQQTPDGACIPNLCSMDMDSVECLSLPDSS氨基酸数目Number of amino acid5050505021151515表3OsRIP蛋白的基序信息Table 3The motifs information of OsRIP proteins图3OsRIP基因家族保守基序Figure 3Conserved motif of OsRIP gene familyABCDOsRIP2OsRIP3 OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4 50100020003000400050006000NUTRCDSRING-HCSINA050100 150 200250 300350 400 450RING-HCSINAOsRIP2OsRIP3OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4OsRIP2OsRIP3OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4OsRIP2OsRIP3OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4OsRIP2OsRIP3OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4OsRIP2OsRIP3OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4Motif 8Motif 3Motif 6Motif 4Motif 1Motif 5Motif 2Motif 753450400350300250200150100500389-沈阳农业大学学报第 54 卷因有4个，而拟南芥中有2个，且距离较远。这些结果表明，水稻中OsRIP基因和玉米、小麦中的同源基因进化关系较近，而与拟南芥中的同源基因进化关系较远。图4RIP基因家族系统发育树Figure 4Phylogenetic trees of RIP gene family2.6共线性分析为了进一步研究RIP蛋白在水稻中系统进化机制，分析水稻和其他物种中RIP的线性关系，本研究分析了水稻中OsRIP与玉米、小麦、大麦、大豆、拟南芥的基因共线性。结果显示，水稻中的OsRIP蛋白与玉米之间存在最多的同源基因共线对，一共为9个；与大麦之间存在5个共线对，与大豆和小麦之间分别存在3个共线对(图5)。说明玉米、大麦、小麦、大豆的RIP蛋白和水稻中的OsRIP进化关系更近。与拟南芥之间不存在共线对，也就是说RIP蛋白在水稻和拟南芥这两个物种间进化关系较远。进一步分析发现，1号染色体上的OsRIP3与其他物种间都存在共线对(图5)，这表明在进化过程中，RIP3在RIP家族中有重要作用。2.7顺式作用元件分析在调控基因功能的过程中，启动子活性起着至关重要的作用，为了解RIP的调控机制，本研究分析了OsRIP基因家族启动子区域的顺式作用元件。选取OsRIP上游2000 bp的序列，用PlantCARE网站分析其顺式作用元件，结果表明，在所有OsRIP基因的启动子区都发现了逆境相关的转录因子结合元件，如厌氧诱导元件、低温响应元件(图6A)，这表明RIP家族可能受非生物胁迫诱导表达。此外，在OsRIP基因的启动子区还发现了光响应元件、脱落酸(ABA)响应的顺式元件ABA response element(ABRE)和CGTCA-motif和TGACG-motif茉莉酸甲酯(MeJA)响应的顺式元件(图6A)。为了研究OsRIP是否被ABA、MeJA激素诱导表达，本研究以用100 M ABA和100 M JA处理水稻幼苗，进行qRT-PCR。结合RiceXPro数据库的数据和qRT-PCR数据，结果表明，OsRIP1-5在ABA、JA处理6 h和12h被诱导表达，OsRIP6在ABA处理时表达水平上调，而JA处理时表达水平下调，这表明OsRIP6被ABA诱导表达，被JA抑制表达(图6)。390-第 4 期张琪等：水稻OsRIP基因家族的全基因组鉴定及其表达分析2.8OsRIP基因表达模式分析基因表达的特异性通常与其功能相关，为了研究OsRIP基因家族在水稻生长发育过程中的作用，本研究利用RiceXPro数据库中的微阵列数据检测了OsRIP基因的表达模式。结果发现，OsRIP基因在所有器官和组织中都有表达，未见明显的组织特异性表达(图7)。但是，OsRIP家族不同的基因表达水平差异较大，其中OsRIP1、OsRIP2与OsRIP3在根中表达水平较高；OsRIP1与OsRIP4和OsRIP6在茎中表达水平较高；OsRIP3、OsRIP4和 OsRIP6在花器官中有较高水平的表达。对不同时期 OsRIP 基因的表达水平分析发现，OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3、OsRIP4在播种后的4869 d，表达水平均处于整个生育期相对高的水平，OsRIP6在播种后83 d达到表达水平最高值。由于OsRIP基因的顺式作用元件中含有光响应元件，对其昼夜的表达模式进行了分析，结果发现，在给光后10 h OsRIP基因表达水平最高，这一结果表明OsRIP基因能够被光诱导表达(图7C)。参与调控非生物胁迫的基因往往被非生物胁迫诱导表达，因此，本研究进一步检测了OsRIP基因家族在150 mmolL-1NaCl、20PEG、100 mmolL-1甘露醇等胁迫下的表达模式。结果发现，OsRIP1-5均能够被盐、PEG、甘露醇不同程度的诱导表达。其中，在盐处理下，OsRIP5被诱导表达水平最高，在PEG和甘露醇模拟干旱处理下，OsRIP4被诱导表达水平最高。而 OsRIP6与其他成员的表达模式不同，只有在PEG处理6 h被诱导表达，在12 h时表达水平降低，而盐、甘露醇胁迫处理后均使OsRIP6的表达被抑制(图8)。图5水稻、玉米、大麦、小麦、大豆、拟南芥中RIP家族基因的共线性关系Figure 5Syntenic relationships of RIP gene family in rice,maize,barley,wheat,soybean,Arabidopsis.ABCDEO.sativaZ.maysO.sativaH.vulgareO.sativaG.maxO.sativaA.thalinanaO.sativaT.aestivumChr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.12Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.12Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.12Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.12Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.12Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.6Chr.71234567891011121314151617181920391-沈阳农业大学学报第 54 卷3讨论与结论3.1水稻中的OsRIP的功能具有多样性泛素蛋白酶系统积极参与调节植物对非生物胁迫的响应，RING型E3泛素连接酶调控植物对干旱胁迫、盐胁迫等非生物胁迫的抗性。本研究是在水稻基因组中，鉴定到6个具有SINA结构域的OsRIP基因，对其基因结构和结构域分析结果显示，该基因家族的内含子数量在23个。有研究表明内含子的数量与在发育过程中环境的适应能力相关，没有内含子或内含子较少是植物进化的结果34-35，OsRIP基因家族的内含子数量不同，表明RIP在进化上的进程和生物学功能可能不同。其染色体定位结果表明，6个基因分布在5条染色体上，没有串联重复基因，这一结果表明OsRIP可能起源于不同的祖先，具有进化的多样性。有研究表明OsRIP5（OsIDS1）调控水稻的抗旱性10，而另一个研究则证实了OsRIP1-6的六重突变体表现出严重的生长发育缺陷的表型9。这些结果均说明了OsRIP家族在水稻中的功能具有多样性。3.2光、ABA、JA及非生物胁迫诱导OsRIP的表达基因的时空表达通常与基因功能相关36，OsRIP家族的基因在水稻的各个时期以及各个器官均有表达，表明其基因家族可能参与调控水稻发育的多个进程。启动子顺式作用元件的分布和类型决定了基因的表达与功能37，为了更多的了解调控OsRIP表达的机制，对启动子顺式作用元件进行了分析，结果显示ABRE、G-Box、ARE、CGTCA-motif等响应光、激素和非生物胁迫的顺式作用元件，在OsRIP的启动子区中大多都有存在，因此猜测OsRIP可能与光响应、激素响应及胁迫的耐受性相关。结合转录组数据及定量RT-PCR结果发现OsRIP家族中ABA、JA激素处理能够诱导OsRIP15基因的表达；同时OsRIP15也能够被盐、甘露醇、PEG诱导表达，这图6OsRIP启动子顺式作用元件分析(A)及ABA、JA处理下的表达模式(BC)Figure 6The cis-acting elements in the promoters of OsRIP(A)and expression of OsRIP under ABAJA treatment(BC)OsRIP2OsRIP3OsRIP1OsRIP6OsRIP5OsRIP4ABC502004001000120014006008001600180020003脱落酸响应Abscisic acid responsiveness厌氧诱导Anaerobic i