土壤碳氮磷硫循环对温度的响应.pdf

第4期第45卷第4期2023年8月文章编号：1674-2869（2023）04-0423-06武汉工程大学学报Journal of Wuhan Institute of TechnologyVol.45 No.4Aug.2023微生物是驱动地球生物化学循环的主要力量，它们对环境中的碳、氮、磷和硫的新陈代谢、有机物降解、氮外流和磷流失产生了巨大的影响1。这些过程可能导致二氧化碳升高、温室气体排放、养分负荷和水消耗，同时地球相互作用圈的变化也会加剧这些影响。因此，全面了解微生物分类收稿日期：2023-04-13基金项目：国家自然科学基金（4207039）作者简介：曹冬冬，硕士研究生。E-mail:254581341qqcom*通讯作者：樊昊心，博士，副教授。E-mail:引文格式：曹冬冬，樊昊心.土壤碳氮磷硫循环对温度的响应 J.武汉工程大学学报，2023，45（4）：423-428.土壤碳氮磷硫循环对温度的响应曹冬冬，樊昊心*武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205摘要：温度是影响土壤中微生物介导的元素生物地球化学循环的重要因素。以广东省茂名市的稻田土壤为研究对象，利用高通量功能基因芯片对 71 种土壤元素循环相关的功能基因丰度进行测定并结合温度和培养时间等因子，研究了水稻土中微生物介导的碳、氮、磷、硫循环对温度的响应。结果表明：在检测的71 种碳、氮、磷、硫相关基因中，63%的功能基因的丰度在 35 的培养温度中显著升高，并且这种趋势伴随培养时间的增加而显著增加。其中氮循环中的氨氧化过程中的 amoA 基因对温度的响应最为明显，响应比分别为 35/15 的（12.79 1.82）和 35/25 的（8.44 1.79）。揭示了土壤碳氮磷硫循环关键功能基因丰度对温度的响应特征，也为温度变化引起土壤微生物元素化学循环变化趋势的理论研究提供了基础。关键词：土壤；温度变化；土壤微生物元素循环；高通量定量聚合酶链式反应中图分类号：X172文献标识码：ADOI：10.19843/ki.CN42-1779/TQ.202304020Temperature Responses of Microbial Carbon,Nitrogen,Phosphorus,andSulfur Cycles in SoilCAO Dongdong，FAN Haoxin*School of Environmental Ecology and Biological Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430205，ChinaAbstract：Temperature is an important factor influencing the microbially mediated nutrient cycles in soil.Inthis study，a paddy soil collected in Maoming City，Guangdong Province was selected as the research object.The effect of temperature on the abundance of 71 functional genes related to soil element cycling wasdetermined using high-throughput functional gene chips.The results show that among the 71 detected carbon，nitrogen，phosphorus，and sulfur cycling related genes，the abundance of 63%of functional genessignificantly increases at a cultivation temperature of 35 ，and this trend further increases with theprolongation of incubation time.Among them，the abundance of amoA gene involved in the nitrificationprocess in the nitrogen cycle shows the most significant response to temperature，with response ratios of（12.79 1.82）（35/15）and（8.44 1.79）（35/25）.The study reveals the response characteristicsof key functional gene abundance in soil carbon，nitrogen，phosphorus，and sulfur cycles to temperature，providing a foundation for theoretical research on the trends of soil microbial element cycling caused bytemperature variations.Keywords：soil；temperature variation；soil microbial element cycling；high-throughput quantitativepolymerase chain reaction武汉工程大学学报第45卷组成和功能基因的多样性和丰度是更好地理解微生物介导的生物地球化学过程及其在当前全球变化中的关键作用2。其中碳循环主要包括碳降解途径的淀粉水解、半纤维素降解、纤维素降解、几丁质降解、果胶降解和木质素降解，碳固定途径的卡尔文循环、还原型三羧酸循环、还原型乙酰辅酶A循环和3-羟基丙酸双循环，甲烷代谢途径的产甲烷过程和甲烷氧化过程3。目前针对碳循环温度变化的研究较为充分，短期实验已经证明，土壤微生物呼吸速率随着温度升高呈指数增长，然而当土壤处于较长时间的高温条件下，微生物活性的增加将导致易分解碳的丧失4。氮循环主要包括氮固定、硝化作用、反硝化作用、氨化作用、厌氧氨氧化、同化氮还原和异化氮还原过程关于温度变化对土壤氮素循环的研究存在不确定性，大多数研究表明土壤氮素循环与温度息息相关，但也有部分实验表明温度对土壤氮素循环并无影响5。磷循环主要包括有机磷矿化、无机磷矿化、无机磷合成和无机磷增溶过程。硫循环主要包括硫酸氧化和还原过程，目前关于温度变化对磷循环和硫循环的研究报道较少。为了研究微生物的发育和功能多样性，并评估它们对环境变化的反应，独立于培养的分子技术已被广泛采用。常用的两种方法包括高密度16S 基因寡核苷酸微阵列 PhyloChip 和 16S rRNA基因片段的高通量测序，用于确定微生物群落组成结构6。此外，元测序技术（如鸟枪式元基因组学、元转录组学或它们的组合）可以用来确定新基因、系统类型、调节因子和代谢途径的功能特征。基于测序的元基因组学和基于杂交的微阵列技术已经在微生物生态学研究中成功应用。它们具有高基因覆盖率和分辨率，通常可以确定微生物群落中微生物类群和功能基因的相对丰度，使得可以进行环境样本之间的比较。相对丰度是微生物群落中特定分类群或基因的比例，能够检测到它们的增加或减少7-8。然而，相对丰度不能很好地评估微生物群落规模对分类群和基因丰度的影响。绝对丰度的量化，即功能基因或其转录本的拷贝数，对于评估微生物群落的功能能力和潜力至关重要。使用功能基因丰度信息而不是微生物多样性可以更好地预测氮循环过程。随着高通量微 生 物 元 素 循 环（quantitative microbial elementcycling，QMEC）芯片的开发，探究微生物元素化学循环得到快速发展，使得对生态系统中元素循环的认知得到不断加强9。因此，本试验基于高通量定量聚合酶链反应（quantitative polymerasechain reaction，qPCR）探究不同温度下的土壤微生物碳氮磷硫元素循环关键过程功能基因的变化趋势，为深入理解土壤关键微生物元素化学循环的温度响应特征提供科学依据。1实验部分1.1样品采集土壤样品采集于 2018年 11月，采样点为广东省茂名市茂南区（214231N，1104931E），采样现场如图1所示。该地区属于亚热带季风气候区，常年平均气温在 22.823.4 之间，最冷月份的平均气温为 15.116.3，极端低温为 0.5，最热月份的平均气温为28.328.7，极端高温为38.9。土壤样品随机选取 3个间隔不少于 10 m 的区域，采集 020 cm的表层土壤，将 3个区域的土壤样品混合均匀后低温运至实验室。通过孔径 2 mm 筛网去除土壤中的碎石、动植物残体等异物后，将大部分样品4 保存，用于后续培养试验。ba图1采样现场图：（a）现场环境，（b）采样点Fig.1Schematic diagrams of sampling site：（a）site environment，（b）sampling point1.2土壤基础理化性质测定土壤 pH 值由玻璃复合电极（LE438，MettlerToledo，中国）在土壤和水的质量体积比为 1 2.5的混合液中测定。土壤总碳（total carbon，TC）和总氮（total nitrogen，TN）通过元素分析仪（VarioMACRO cube，Elementar，德国）测定。土壤有机质（organic matter，OM）采用重铬酸钾比色法测定。土 壤 铵 态 氮（ammonium，NH4+）和 硝 态 氮（nitrate，NO3-）使用 2 mol/L KCl 溶液提取后，通过 连 续 流 动 分 析 仪（SAN+System，SkalarAnalytical B.V.，荷兰）测定。1.3试验设计取15 g（基于土壤干重）的新鲜土壤于120 mL棕色血清瓶中，通过添加离子水使土壤含水量维持 在 最 大 田 间 持 水 量（water holding capacity，WHC）的 60%，在 25 预培养 1 周后，分别在 15、25、35 的恒温培养箱中连续培养 28 d。每个温度处理设置 6个平行，分别于实验开始后的第 7 d424第4期和 28 d进行破坏性取样。测定不同培养温度下的土壤元素循环功能基因的相对丰度。1.4高通量qPCR检测方法1.4.1土壤 DNA提取采用 Fast DNATMSpin Kitfor Soil（MP Biomedicals，美国）从 0.5 g 土壤样品中提取 DNA，使用超微量分光光度计（NanoDrop2000，Thermo Fisher，美国）检测 DNA 浓度和纯度，将纯度合格的DNA样品-20 保存10。1.4.2分子标记物QMEC 是一种基于 qPCR 的芯片，包含71个微生物CNPS引物和1个细菌分类群引物，一次可对 72 个 DNA 样本或 24 个样本进行3个重复的并行定量11。QMEC共包含72对引物，这些引物分别为：1）编码碳降解过程的 apu、amyA、amyX、sga、iso-plu、abfA、manB、xylA、cdh、cex、naglu、chiA、exo-chi、pgu、glx、lig、mnp、pox；2）编码碳固定过程的 accA、aclB、acsA、acsB、acsE、frdA、cdaR、korA、mcrA、mct、pccA、rbcL、smtA；3）编码甲烷代谢过程的 mxaF、pqq-mdh、mmoX、pmoA；4）编码氮循环过程的 nifH、amoA1、amoA2、amoB、hao、nxrA、narG、nirK1、nirK2、nirK3、nirS1、nirS2、nirS3、nosZ1、nosZ2、ureC、hzo、hzsA、hzsB、nasA、napA、gdhA；5）编 码 磷 循 环 过 程 的 bpp、cphy、phnK、phoD、phoX、gcd、pqqC、ppk、ppx；6）编码硫循环过程的 apsA、dsrA、dsrB、soxY、yedZ以及细菌的16S rRNA（515F和907R）基因。1.4.3高通量 qPCR使用 16S rRNA 基因（F525/R907）作为内参基因，通过 HT-qPCR（SmartChipReal-time PCR system，WaferGen Biosystems，美国）定量检测 QMEC。芯片反应系统按照仪器手册说明制备。高通量 qPCR 反应体系为 50 L，包含 1 L的 Premix Taq（Takara，日本）、正向和反向引物各0.2 molL-1、DNA模板1 ngL-1、1 mgmL-1牛血清白蛋白溶液和无核酸水。扩增程序为初始变性10 min（95），然后40个循环30 s（95），退火30 s（58），延伸30 s（72）。每个引物组进行3 次重复反应，溶解曲线通过 WaferGen 软件自动生成。1.5数据统计与分析测定结果应考虑两项标准：1）多个溶解峰或扩增效率必须在 80%120%的范围内，2）阈值循环数（threshold cycle，Ct）应不高于 31。筛选后的数据根据式（1）计算功能基因相对丰度（Rgene），再根据式（2）对相对功能基因丰度（Ngene）进行标准化 处 理。最 后 使 用 实 时 荧 光 定 量 PCR（LightCycler480II，Roche，瑞士）测定 16S rRNA基因的绝对丰度（A16S rRNA），利用式（3）计算功能基因的绝对丰度（Agene）9：Rgene=10()31-Ct()103（1）Ngene=Rfunctional geneR16SrRNA（2）Agene=NgeneA16SrRNA（3）所有的数据分析和数据可视化均使用R-4.2.1和相应的程序包完成，单因素方差分析用于比较组间差异显著性。2结果与讨论2.1土壤基础理化性质茂名土壤基础理化性质见表1，土壤基础理化性质均以平均值标准差（MeanSD）表示。表1土壤基础理化性质Tab.1Soil basic physical and chemical properties地区茂名pH5.820.07有机质/(gkg-1)19.082.07总碳/(gkg-1)14.205.29总氮/(gkg-1)1.400.51铵态氮/(mgkg-1)14.326.46硝态氮/(mgkg-1)2.370.312.2不同温度下土壤元素循环功能基因的相关性分析在所有处理组的土壤样品中共检出52对分子标记物，其中编码碳降解过程的 amyX、cdh、exo-chi、ipu、naglu、pgu、pox；编码碳固定过程的 accA、acsB、frdA、pccA、rbcL；编码氮循环过程的 hao、hzo、hzsA、nas；编码磷循环过程的ppx；编码硫循环过程的dsrB均未被检测出。不同温度下土壤微生物元素循环的功能基因的情况如图2所示。整体而言，温度为 35 时，编码碳降解、碳固定、甲烷代谢和硫循环的功能基因的相对丰度都要显著高于15和25 （p0.05）。而氮循环中不同的功能基因对温度响应的表现则比较复杂。例如，培养 28 d后，培养温度为 15 的处理组中，编码氮循环基因中的 amoA2、hzsB、nirK 的相对丰度要显著高于 25和 35 的处理组（p0.01），而 nxrA基因在的相对丰度随温度的变化并不显著，其他氮循环基因相对丰度则是温度为35 时显著高于15 和 25 （p0.01）。磷循环中，phoX 和 gcd 基因的相对丰度在 15 和 25 的处理组中显著高于曹冬冬，等：土壤碳氮磷硫循环对温度的响应425武汉工程大学学报第45卷35 处理组（p 0.01），cphy基因相对丰度在所有处理组中无显著差异，其余编码磷循环的功能基因则是温度为35时显著高于15和25（p0.01）。综上所述，温度在35 时，编码碳氮磷硫循环的元素循环的绝大多数功能基因的相对丰度都显著高于其它两个温度，随着培养时间的增加这种显著相关性得到进一步增强，表明介导相关的碳氮磷硫过程的大多数微生物对温度存在着正的反馈响应，这种反馈有可能进一步加强碳氮磷硫元素循环，从而增加土壤活性。另一方面，发现碳循环过程的功能基因和氮循环、磷循环过程的有些功能基因的变化方向并不一致。在氮、磷循环中存在少量随培养温度增加而降低相对丰度的功能基因。这些基因尤其集中于氮素循环中的硝化过程和反硝化过程，这些发现和以往的研究结果相符12。这些结果表明，不同的元素循环过程的功能基因的丰度对温度的敏感性和响应规律存在差异，因此温度的改变可能会引起碳、氮、磷循环过程的解耦联。2.3不同温度下土壤微生物功能基因特征不同培养时间下（28、7 d）碳循环相关微生物功能基因丰度比值如图3（a，b）所示，除pmoA基因外，其它碳循环功能基因比值在 35 时都要高于15和25。具体而言，碳降解中的amyA、chiA、manB、sga 和 xylA，碳固定中的 aclB、acsA、acsE、mct 和smtA，甲烷代谢中的 pqq-mdh 都在 35 时功能基因丰度比值显著高于 15和 25 （p 0.05）。其它的功能基因在不同的培养温度之间无显著差异。如图 3（c）所示，氮循环相关的功能基因在35 处理组中 amoA1、amoB、gdh、nirS3、nosZ2基因丰度比值显著高于15和25 处理组（p 0.05）。其余氮循环相关基因在不同的培养温度之间无显著差异。另外，amoA2（细菌 amoA）基因随温度的增加相对丰度比值逐渐降低。不同温度下磷循环和硫循环微生物功能基因丰度比较如图 3（d）所示，磷循环中的 phnK 和phoD 以及硫循环中的 soxY都在 35 时功能基因丰度比值显著高于15和25 （p0.05）。其它功能基因在不同的培养温度之间无显著差异。综上所述，50%的碳循环基因丰度随培养时间的增加在 35 显著增加，表明温度升高能促进部分碳循环途径，而另一部分碳循环功能基因丰度则未呈现显著温度相关性。传统“碳质量-温度”假说，不同质量底物的分解需要不同的活化能，其对于温度提升敏感性表现出差异。因此，可以用来解释微生物碳代谢过程中的不同功能基因温度适应性差异。对于氮循环而言，氨氧化作用是影响整个氮循环的重要过程，其伴随培养时间和温度的变化趋势与其它氮循环功能基因变化趋势之间存在显著差异，并且 amoA1（氨氧化古菌amoA 基因）和 amoA2（氨氧化细菌 amoA 基因）基因的变化趋势相反，这可能与氨氧化细菌与菌氨氧化古菌在环境中的生态位差异有关，其中氨氧化古菌可以适应更广泛的温度范围，在高温环境中有较好的适应性。微生物介导磷循环和硫循环在 35 相对比值较高，也是因为驱动的微生物的能适应较高的温度导致的反映13。2.4土壤微生物非度量多维尺度分析非度量多维尺度分析（non-metric multidimen-sional scaling，NMDS）的土壤微生物功能的 多样性表明，不同培养时间及处理温度下土壤微生物关键元素功能基因的多样性存在显著差异（图4）。不同处理组的平行之间存着较好的聚类，沿着NMDS 1坐标轴温度为 35 的处理组与 15和 25 存着明显的分离趋势，沿着 NMDS 2 坐标轴不同的培养时间也存在一定的分离趋势。结果表明，温度和图2功能基因相对丰度热图Fig.2Heatmap of relative abundance of functional genes碳降解碳固定甲烷代谢氮循环磷循环硫循环287时间/d353535252525151515温度/353535252525151515abfAamyAapucexchiAglxligmanBmnpsgaxylAaclBacsAacsEkorAmcrAmctsmtAmmoXmxafpmoApqq-mdhamoA1amoA2amoBgdhAhzsBnapAnarGnifHnirK1nirK2nirK3nirS1nirS2nirS3nosZ1nosZ2nxrAureCbppcphyphnKphoDphoXppKgcdpqqCapsAdsrAsoxYyedZ42 0-2-4426第4期培养时间是影响土壤微生物的功能多样性的直接因素，其中供试土壤中微生物在 35 存在较高的生物活性。结合上述结果较高的培养温度可能通过促进大部分参与土壤碳氮磷硫相关过程酶的酶活性从而加速土壤微生物化学循环过程14-15。0.10-0.1NMDS 2-0.500.5NMDS 1培养时间/d728温度/152535图4非度量多维尺度分析（NMDS）土壤微生物功能多样性Fig.4Non-metric multidimensional scaling（NMDS）plotillustrating diversity of soil microbial functional genes2.5温度变化对功能基因响应比的影响培养 28 d 后，不同温度下土壤微生物功能基因丰度比较结果如图 5 所示。在 25/15 条件下，不同功能基因之间无显著差异。在35/15 和35/25 条件下，仅氮固定相关 nifH基因的响应比小于1，而其他元素循环相关基因的丰度都大于 1，表明 35 温度条件有利于促进大多数功能基因丰度的增加。此外，在35/15 和35/25 条件下，不同功能基因间的响应比也存在一定的显著性差异，其中硝化作用相关功能基因的丰度受到温度变化的显著影响。其在35/15 的响应比最大为（12.79 1.82），在 35/25 的响应比最大为（8.441.79），与上述结果中的基因丰度比结果相互印证。510响应比碳降解碳固定烷代谢氮固定硝化作用反硝化作用氮固定其他氮循环磷循环硫循环510510bacAAAAAAAAAABCBCCCADBCBBBBCBCEACDDBCBCB注：不同大写字母表示不同温度处理组的差异显著性（p 0.05）图5不同温度之间的功能基因响应比：（a）25/15，（b）35/15，（c）35/25 Fig.5Response ratios of functional genes at differenttemperatures（a）25/15，（b）35/15，（c）35/25 注：不同大写字母表示不同温度处理组的差异显著性（p 0.05）图3不同处理组间微生物功能基因相对丰度的变化：（a）碳降解过程，（b）碳固定和甲烷代谢过程，（c）氮循环过程，（d）磷循环和硫循环过程Fig.3Changes of microbial functional genes abundance between treatments for（a）carbon degradation，（b）carbon fixation and methane metabolism，（c）nitrogen cycling，and（d）phosphorus cyclingand sulfur cycling642028/7 d基因丰收比bppcphyphnKphoDphoXppKgcdpqqCapsAdsrAsoxYyedZ处理组15 25 35 a54321028/7 d基因丰收比baclBacsAacsEkorAmcrAmctsmtAmmoXmxafpmoApqq-mdhabfAamyAapucexchiAglxligmanBmnpsgaxylAamoA1amoA2amoBgdhAhzsBnapAnarGnifHnirK1nirK2nirK3nirS1nirS2nirS3nosZ1nosZ2nxrAureC功能基因功能基因功能基因功能基因2010028/7 d基因丰收比54321028/7 d基因丰收比cd碳降解磷循环甲烷代谢硫循环氮循环AAAB BAAAAAAAABBAABBAA ABBBCABBBBBBAAAAAABBBBAAAAAAABBAAAAAAAAABBAAAAAAAAABBABAABBAAAAAAABBAABABAAAAAAAAAABBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABBBBAAABCAA曹冬冬，等：土壤碳氮磷硫循环对温度的响应427武汉工程大学学报第45卷3结论土壤微生物碳磷硫关键过程中功能基因整体受到温度变化的影响显著。其中，63%的功能基因的丰度在 35 的培养温度中显著升高，并且这种趋势随培养时间的增加而显著增加。氮循环中的氨氧化过程中的 amoA 基因的对温度的响应与其他基因相比最为明显，响应比分别为35/15 的（12.791.82）和35/25 的（8.441.79）。而氮循环过程中的氮固定过程功能基因nifH 是唯一随温度增加而丰度下降的基因。因此，土壤微生物碳磷硫关键过程对温度的响应存在一定的趋异性，可能引起土壤元素循环过程的解偶联，从而影响土壤元素循环的平衡。参考文献1 VAN DER HEIJDEN M G A，BARDGETT R D，VAN STRAALEN N M.The unseen majority：soilmicrobes as drivers of plant diversity and productivityin terrestrial ecosystemsJ.Ecology Letters，2008，11（3）：296-310.2 BARDGETTRD，VANDERPUTTENWH.Belowground biodiversity and ecosystem functioningJ.Nature，2014，515（7528）：505-511.3 KIRSCHBAUM M U F.The temperature dependenceof organic-matter decomposition-still a topic of debateJ.Soil Biology and Biochemistry，2006，38（9）：2510-2518.4 WIEDER W R，BONAN G B，ALLISON S D.Globalsoil carbon projections are improved by modellingmicrobial processes J.Nature Climate Change，2013，3：909-912.5 KUYPERS M M M，MARCHANT H K，KARTAL B.The microbial nitrogen-cycling network J.NatureReviews Microbiology，2018，16（5）：263-276.6 FENG W T，LIANG J Y，HALE L E，et al.Enhanceddecompositionofstablesoilorganiccarbonandmicrobialcatabolicpotentialsbylong-termfieldwarmingJ.Global Change Biology，2017，23（11）：4765-4776.7 张洁洁，Anders，陈显轲，等.基于 QMEC 分析的青藏高原不同类型冰川前缘地土壤微生物功能潜力J.环境科学，2023，44（1）：512-519.8 李宁，李丽红，米文强，等.荧光定量 PCR测定粗品肝素钠 DNA提取液中反刍基因及猪基因的浓度 J.化学与生物工程，2021，38（1）：65-68.9 ZHENG B X，ZHU Y G，SARDANS J，et al.QMEC：a tool for high-throughput quantitative assessment ofmicrobial functional potential in C，N，P，and Sbiogeochemicalcycling J.ScienceChina-lifeSciences，2018，61（12）：1451-1462.10 李小玥，姚槐应，葛超荣.人工养殖南美白对虾中副溶血弧菌的分离鉴定及抗生素耐药性分析 J.武汉工程大学学报，2022，44（6）：658-663.11 LI Z，ZENG Z，TIAN D，et al.Global patterns andcontrolling factors of soil nitrification rateJ.GlobalChange Biology，2020，26（7）：4147-4157.12 XU X，LIU X，LI Y，et al.High temperaturesinhibited the growth of soil bacteria and archaea butnot that of fungi and altered nitrous oxide productionmechanisms from different nitrogen sources in anacidic soil J.Soil Biology and Biochemistry，2017，107：168-179.13BAHRAM M，HILDEBRAND F，FORSLUND SK，et al.Structure and function of the global topsoilmicrobiomeJ.Nature，2018，560（7717）：233-237.14 DELGADOBAQUERIZOM，BISSETTA，ELDRIDGE D J，et al.Palaeoclimate explains aunique proportion of the global variation in soilbacterialcommunities J.NatureEcologyandEvolution，2017，1（9）：1339-1347.15 CHEN X，TANG J，JIANG L，et al.Evaluating theimpacts of incubation procedures on estimated Q10values of soil respiration J.Soil Biology andBiochemistry，2010，42（12）：2282-2288.本文编辑：张瑞428