吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制.pdf

中药有效成分研究吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制刘磊彭琴吴泽明黄欣慧张广献谭宇蕙(广州中医药大学基础医学院广州 )摘 要 目的 探讨吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制 方法以不同浓度的吴茱萸碱、二氯化钴()单独或联合处理人脐静脉内皮细胞()或人肝癌细胞()采用噻唑蓝()法检测细胞增殖水平变化/双染流式细胞术检测吴茱萸碱对 凋亡的影响采用 化学诱导法建立 体外模拟缺氧模型免疫印迹法()检测 的缺氧诱导因子()、代谢酶()和血管内皮生长因子受体()蛋白表达水平 结果 检测结果显示吴茱萸碱对、细胞增殖均有显著的抑制作用(.或.)半数抑制浓度分别为.、.流式细胞术结果表明吴茱萸碱可以诱导 凋亡(.)在常氧条件下吴茱萸碱对 的、蛋白抑制不明显但能显著下调 蛋白表达水平(.)可使 的 和 蛋白表达水平显著升高(.)且呈浓度依赖性而细胞增殖水平未见明显变化但 时细胞生存率明显升高 时细胞生存率明显降低(.)诱导 高表达条件下吴茱萸碱(.)能显著下调、和 的蛋白表达水平和细胞生存率(.)与吴茱萸碱组比较联合(吴茱萸碱)组、蛋白水平及细胞生存率均上调(.)而 不上调 结论 吴茱萸碱对 和 细胞增殖均有显著的抑制作用且诱导 凋亡在 模拟缺氧条件下吴茱萸碱可显著下调 的糖酵解(效应)其机制可能与独立下调 和 两条信号通路有关关键词 吴茱萸碱血管增生糖酵解缺氧诱导因子血管内皮生长因子受体中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()().()()().()/()()().(.).(.).(.).(.).(.).(.)(.).(.).().医药导报 年 月第 卷第 期 统计报告显示 年全球新发癌症约 万例癌症患者死亡 万例其中我国新增癌症病例约 万死亡病例 万 大多数癌症患者确诊时已进入进展期或者中晚期肿瘤已开始通过血行播散转移 肿瘤血管生成是肿瘤生长、进展和转移的重要因素抑制血管生成已成为临床批准的治疗方法然而目前却受到可选药少、疗效不足或耐药性的限制 由于肿瘤细胞迅猛增殖代谢水平高实体肿瘤中心区域容易出现缺血缺氧的状态而缺氧能促进血管增生诱导血管生成是肿瘤的十大特征之一其病理性血管增生是以新生毛细血管的形成为主而内皮细胞是构成毛细血管管壁的主要细胞其来源于内皮祖细胞增殖分化或自身的继续增殖分裂而内皮(祖)细胞增殖分化及迁移被证实是恶性肿瘤血管增生的重要环节 有报道指出内皮(祖)细胞增殖也像癌细胞一样依赖瓦伯格效应(即依靠大量糖酵解提供合成代谢和能量代谢的原料)因此通过调整内皮(祖)细胞代谢以抑制血管增生可能是抗癌的新策略吴茱萸碱()是吴茱萸的主要活性成分之一 现代研究发现 具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、保护心血管系统及神经等药理作用 本课题组前期已证实 对肝癌细胞的瓦伯格效应有显著的抑制作用那么 能否抑制血管内皮细胞的瓦伯格效应?是否通过影响内皮细胞糖代谢而抑制其增殖生长从而抗血管增生?这些尚不明确 本研究通过体外模拟人脐静脉内皮细胞()体内的缺氧状态观察常氧和缺氧下内皮细胞糖代谢相关酶的变化、的干预作用及相关信号通路变化探讨 抗血管增生的作用及机制 材料与方法.材料.细胞 购自广州浩玛生物科技有限公司(货 号:)人 肝 母 细 胞 肝 癌 细 胞 株()由广州中医药大学基础医学院生物化学实收稿日期 修回日期 基金项目国家自然科学基金资助项目()作者简介 刘磊()男江西宜春人在读硕士研究方向:中西医结合肿瘤防治与药理:.通信作者 谭宇蕙()女广东恩平人教授博士生导师研究方向:中西医结合肿瘤防治与药理电话:.验室长期保存.药物及试剂 购自成都曼思特有限公司(批号:)六水合氯化钴()购自上海麦克林生化科技有限公司(批号:)内皮细胞专用培养基购自广州浩玛生物科技有限公司(货号:)胎牛血清购自武汉普诺赛生命科技有限公司(批号:)高糖达尔伯克必需基本培养基()购 自 美 国 公 司(货 号:)噻唑蓝()试剂盒、二甲亚砜、/细胞凋亡检测试剂盒均购自广州瑞舒生物科技有限公司(货号分别为:、)聚 偏 二 氟 乙 烯()膜购自(货号:)山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均购自(批号:、)鼠抗 抗体、兔抗 抗体、兔抗 抗体均购自 公司(批号分别为、)兔抗 抗体购自 公司(批号:).仪器与设备 二氧化碳()细胞培养箱(美国 公司型号:)超净工作台(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司型号:)多功能酶标仪(公司型号:)流式细胞分析仪(美国 公司型号:)蛋白垂直电泳系统、蛋白转印系统(美国 公司)全自动化学发光图像分析系统(上海天能仪器有限公司型号:).方法.细胞培养将、细胞分别置于内皮细胞专用培养基、胎牛血清高糖 培养基中、饱和湿度条件下常规培养细胞密度达到 用含.乙二胺四乙酸()的胰酶消化、离心并收集细胞(离心率 离心 )加入内皮细胞专用培养基或 培养液制成单细胞悬液选取第 代细胞进行后续实验.法检测细胞增殖情况取对数生长期、细胞分别制成单细胞悬液均以每孔 个、细胞悬液 接种于 孔板培养 即细胞贴壁设置空白组(无细胞对照)、对照组(细胞对照)、实验组 和(或)实验组每孔加入不同浓度的(.、.、.、.、.)或(、)或二者联合 每个浓度梯度设置 个平行复孔 药物干预 避 光每孔加入 溶液 继续孵育 吸弃上清液后每孔加入二甲亚砜 避光震荡 酶标仪检测波长处 吸光度值(值)细胞存活率()(实验组空白组)/(对照组空白组)改良寇式法计算半数抑制浓度():()()/及 ().流式细胞术检测 细胞凋亡水平以每孔 个 接种至 孔板待细胞贴壁后设置对照组和 各浓度组 处理 用不含 的胰酶消化、离心细胞磷酸盐缓冲液重悬并离心细胞 次收集细胞制成单细胞悬液使用/双染料联合标记避光孵育 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.体外模拟缺氧模型建立 参照“.节”以(、)干 预 法检测 对细胞增殖的影响和参照“.”项(、和、)干预 检测 的 蛋白表达水平以选择合适浓度的建立体外模拟缺氧模型.检测以每孔 个 接种至 孔板待细胞贴壁后经 或(和)干预 使用 裂解液提取细胞内总蛋白 法测定总蛋白浓度加入 倍十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝 胶()上样缓冲液稀释为 倍工作液置于金属浴中加热 使蛋白变性 然后使用 凝胶电泳分离目的蛋白采用湿转法将目的蛋白转印至 膜上脱脂奶粉室温封闭 分别放入鼠抗 抗体、兔抗、抗体中(稀释)孵育过夜 经 缓冲液洗涤 重复 次后加入辣根过氧化酶()标记二抗室温孵育 缓冲液再洗涤 次后采用电化学发光法显影拍照并保存图像 使用 软件测量条带灰度值 作为内参分析目的蛋白相对表达水平.统计学方法 采用 .版统计软件进行数据分析.版软件进行柱状图绘制符合正态分布的计量数据以均数标准差()表示若同时符合方差齐性检验两组间均数比较采用独立样本 检验以.表示差异有统计学意义 结果.对、细胞增殖的影响 检测结果显示 对、细胞的增殖均有显著抑制作用(.或.)对、细胞 分别为.、.由此可见 对 抑制作用较对 细胞稍弱但抑制程度基本一致(图)与对照组比较 .与对照组比较.图 对、细胞活力抑制作用().().对 诱导凋亡的影响流式细胞术检测结果显示各组 作用浓度分别为、.、.、.凋亡率逐渐升高分别为.、.、.、.(.)见图.对 的、和 蛋白表达的影响 检测结果显示常氧条件下 对细胞的、效应的主要关键酶(内皮细胞主要表达的 的同工酶)没有明显下调作用但对 有明显的下调作用(.)(图).体外模拟缺氧模型的建立及 对 糖酵解代谢的影响不同浓度 干预 检测结果见图随着 浓度的增加 增 殖 有 所 增 加 作 用 浓 度 时 增殖活性没有受到明显影响也没有细胞毒性 明显促进生存率(.)时 生存率明显下降浓度过高出现细胞毒现象可能是体外医药导报 年 月第 卷第 期与对照组比较.图 对 细胞凋亡的影响().()与对照组比较.图 常氧条件下 对 的、和 蛋白水平的影响().()细胞的非特异性死亡但这么高的浓度才有抑制生长作用也说明 的细胞毒性很低 检测结果(图)显示常氧对照组 蛋白表达水平很低而随着 浓度的增加激活 表达明显增加(.)说明 诱导的高表达 的模型已成功建立 在 高表达条件下糖酵解关键酶 与 共同高表达且均随 浓度升高而升高(可显著提高 的表达但 明显影响生存率因此模拟缺氧模型的 合适浓度范围为 选择对 生存率影响较小又显著提高 蛋白表达的 来建立模拟缺氧模型.对内皮细胞代谢机制的影响 结果(图)显示在常氧条件下 组、蛋白没有明显改变而在 组即模拟缺氧模型组中、表达皆非常显著地升高(.)并且联合组()被 上调的、蛋白表达均受到 抑制(.)说明 在模拟缺氧条件下才抑制、在常氧下没有此作用 的激动剂 能上调 对 的作用(.)说明 对 的抑制是通过抑制 实现的在常氧条件下 蛋白表达在 组中明显下调(.)而在 组中明显升高说明能上调 表达在联合组中 蛋白表达仍受到 明显抑制(.)联合组与 组的抑制作用相差不大说明 不能逆转 对 的抑制 下调 不是通过 通 路 实 现 的 也 就 是 说 可 独 立 地 抑 制 信号通路 检测结果显示作用浓度为 时 增殖活性没有受到明显影响在 浓度为.时 增殖活性受到明显抑制(.)在模拟缺氧条件下.仍能抑制细胞增殖生长(.)但此抑制作用被 减弱即 能够逆转 对细胞增殖生长的抑制作用(.)说明 是通过 抑制 增殖生长 与对照组()比较.图 对 增殖和、蛋白表达的影响()().()讨论 世纪 年代德国生物化学家 发现与正常细胞比较快速增殖的腹腔积液肿瘤细胞以惊人的高速率消耗葡萄糖但它并不是完全用于氧化生成 和 而是以乳酸的形式分泌并堆积为主这种现象被称为瓦伯格效应即指癌细胞无论有氧还是无氧均可进行大量的糖酵解 有学者提出除肿瘤细胞外大量糖酵解适用于所有的增殖细胞 由于肿瘤细胞恶性增殖肿瘤中心区域严重的缺氧状态是大多数实体肿瘤普遍存在的现象这导致了肿瘤细胞代谢的改变肿瘤细胞可通过稳定缺氧诱导因子并诱导其下游靶基因的激活包括血管内皮生长因子()、代谢关键酶基因 等当大量分泌的促血管生成因子超过抗血管生成因子占据主导地位时血管内皮细胞迅速地从分裂的休眠状态中被唤醒同时开始大量地增殖、迁移同样需要高速率的糖酵解来满足其生物合成和能量需求而增殖、迁移的内皮细胞逐渐形成管状样的病理性血管 目前抑制血管生成以饥饿肿瘤已成为临床批准的有效治疗方法其中最经典的是阻断/通路以抑制新生血管的生长几乎在所有内皮细胞上都有表达 它主要通过与 结合后激活下游一系列的细胞信号通路导致内皮细胞增殖、迁移以及肿瘤新生血管的形成 因此建立体外模拟缺氧模型对于研究内皮细胞的代谢非常有必要目前常用的有物理和化学 种缺氧模型其中物理缺氧模型是最好的选择但由于其需要昂贵的仪器设备和更为严谨的操作而限制了推广应用 而以 化学诱导法建立的体外模拟缺氧模型在常氧条件下就能够稳定细胞内 蛋白的表达因此也得到了普遍的认可 目前已有报道指出 对多种类型的肿瘤细胞刺激的敏感性和耐受性不同因此需要确定对 增殖影响较小又能显著激活 蛋白表达的合适浓度以建立体外模拟缺氧模型 是中药吴茱萸的主要药效成分 吴茱萸始载于神农本草经列为中品中华人民共和国药典记载:吴茱萸性热味辛、苦有小毒归肝、脾、胃、肾经功效:散寒止痛降逆止呕 由吴茱萸、黄连组成的左金丸源自朱丹溪的丹溪心法主治肝胃不和中医临床多用于消化系统疾病而消化系统肿瘤多伴有肝胃不和证 本课题组前期已证实 对多株人肝癌细胞有明显抑制增殖生长、抑制瓦伯格效应和诱医药导报 年 月第 卷第 期 与对照组比较.与 组比较.、.与 组比较.、.与对照组比较.、.与 组比较.、.与 组(.、.)比较.、.、.图 模拟缺氧条件下 对 的、蛋白表达及生存率的影响().(.).()导凋亡作用并能明显抑制小鼠肝癌移植瘤生长和延长荷瘤小鼠生存期 有研究证明 可以下调人结直肠癌 中、基因和蛋白的表达还可以降低移植瘤组织中 连环蛋白、蛋白的表达和、的水平 尽管目前对肿瘤血管增生与内皮细胞代谢、效应的关系已有不少文献报道但 通过抑制内皮细胞代谢抗血管增生未见文献报道本研究结果表明 对 的 为.故选择低于 的 浓度进行后续实验 常 氧 条 件 下 对 的、没有明显下调作用提示 对正常血管内皮细胞代谢没有影响 检测结果表明在 作用浓度 时 增殖活性没有受到明显影响也没有细胞毒性同时 检测结果显示 的 蛋白表达水平显著高于常氧对照组这表明以 化学诱导模拟缺氧模型建立成功 与 共同高表达且均随 浓度升高而升高说明 的高表达能促进内皮细胞的糖酵解并选择模拟缺氧模型的 作用浓度为 仅在模拟缺氧模型中有下调 的作用只影响 高表达的血管内皮细胞的糖酵解 研究表明阻断 可使 增殖和迁移能力减弱抑制了移植瘤中肿瘤血管的生成及诱导肿瘤血管正常化在血液系统中毛细血管内皮细胞的糖酵解速率更快、增殖能力更强并且在血管分支形成的过程中其糖酵解速率还会进一步提高 因此 在 模 拟 缺 氧 条 件 下 可 能 下 调 进而抗肿瘤血管增生 不能逆转 下调 的作用说明虽然 能影响 表达但 抑制 不是必须通过 通路实现的即 可能分别独立地抑制、这两条信号通路 综上所述本研究显示 可能通过 和 通路抑制内皮细胞的瓦伯格效应及增殖从而抗肿瘤血管增生参考文献 .:.():.():.():.():.:.():.():.:.:.():.():.():.().():.():.():.():.:.():.医药导报 年 月第 卷第 期