唐古特大黄地上部分抗氧化活性研究.pdf

128青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY唐古特大黄（Rheum tanguticumMaxim.exBalf.）是廖科（Polygonaceae）大黄属（Rheum）多年生草本植物，又称“鸡爪大黄”，主产于青海、甘肃、西藏等海拔 2500m 以上的高寒、高海拔地区1。通过文献表明，其多糖2、黄酮类3、蒽醌类4、皂苷类5、鞣质类6、挥发油7等多种生物活性成分，具有通便、免疫调节、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗真菌、保肝、抗癌、保肾等多种药理活性8。过多的自由基对有机体具有负面影响，抗氧化剂的作用是中和生物细胞中的自由基，具有降低氧化应激的作用，因此，补充抗氧化剂是维持人体健康、预防和延缓疾病的重要途径。植物中具有天然抗氧化剂（类胡萝卜素、酚类、黄酮、花色素衍生物、不饱和脂肪酸、维生素等），含量高，抗氧化活性强，副作用小，在食品工程、医学和药学的各个领域中具有很高的研究、应用价值，探索和开发天然药物提取物中的抗氧化剂是当前研究热点之一9。天然产物抗氧化作用机制有两种，即氢原子供体机制（HAT）和单电子转移机制（SET）10。在 HAT 机理中，自由基会移除抗氧化剂上的一个氢原子从而转化成稳定物；在 SET 机制中，抗氧化剂向自由基提供电子，将氧化的中间体还原为稳定形式。HAT 和 SET 机理通常并存。通常使用不同的生物测定法来测定天然产物的抗氧化活性，例如对氧自由基吸收能力（ORAC）、总过氧化物自由基捕获抗氧化剂参数（TRAP）、铜离子还原抗氧化能力（CUPRAC）、DPPH 清除率、硫氰酸铁含量（FCT）和铁还原抗氧化能力（FRAP）的测定11，其中 2,2-二苯-1-吡啶肼（DPPH）自由基清除活性为 SET 机制，是常用的体外抗氧化活性测定基础实验10。DPPH 法具有低成本、易于操作、可重复性较好、室温下反应可自发进行的优点12，在天然产物抗氧化活性研究中应用广泛13。唐古特大黄的传统药用部位为地下部分，对唐古特大黄总生物资源二分之一以上的地上部分研究很少，本研究将对唐古特大黄地上部分进行基金项目:青海省自然科学基金面上项目(2019-ZJ-916)。作者简介:庞沁(1997-),女,硕士研究生,研究方向为应用植物学。E-mail:。*通信作者:孙士浩(1989-),男,讲师,主要从事天然产物研究。E-mail:。唐古特大黄地上部分抗氧化活性研究庞 沁 崔云斌 祁得胜 孙士浩*马建滨（青海师范大学生命科学学院青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室，西宁 810008）摘 要：目的：唐古特大黄为多年生草本植物，传统上将大黄植物的地上部分茎叶归为非药用部位，在采集药材时常被废弃。为了充分挖掘大黄资源的潜在价值，本研究以唐古特大黄的地上部分为研究对象，进行抗氧化活性的物质基础研究。方法：用醇提法对唐古特大黄地上部分进行提取，并通过大孔吸附树脂对样品进行初步分离，采用 DPPH 自由基清除实验对唐古特大黄地上部分醇提物及各组分进行自由基清除率验证，将活性较好的组分进行纯化。结果：唐古特大黄地上部分乙醇提取物有一定的抗氧化活性，Fr3、Fr4、Fr5、Fr6 四个组分的抗氧化活性最强。结论：唐古特大黄地上部分具有进一步应用开发的价值。关键词：唐古特大黄；地上部分；抗氧化活性中图分类号:R284;R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-9393(2023)03-0128-07129青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY抗氧化物质基础研究，为其他天然产物抗氧化活性物质基础研究提供借鉴，为唐古特大黄这一特色资源的深度研究和开发提供依据和支撑。1 材料1.1 实验材料唐古特大黄茎：采自青海省西宁市大通回族土族自治县（东经 101408，北纬 37439，海拔2881m），由青海师范大学马建滨教授鉴定。晒干后，再经烘箱以 45烘烤 24h，得到干样，粉碎后备用。95%乙醇（分析纯），江苏强盛功能化学股份有限公司；DPPH（色谱纯），默克股份两合公司；甲醇（色谱纯），默克股份两合公司；乙腈（色谱纯），默克股份两合公司；三氟乙酸（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸（色谱纯），上海广诺科技有限公司；大孔树脂（AB-8），北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器Bio-RadXMARK 全自动酶标仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；ME204/02 分析天平，梅特勒-托科多仪器（上海）有限公司；XOLD-DBF60F 热风循环鼓风干燥箱，南京先欧仪器制造有限公司；XO-18N 真空冷冻干燥机，南京先欧仪器制造有限公司；CA-111A 低温冷却循环泵，上海亚荣生化仪器厂；N-1210B 旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；NS4205 半制备高效液相色谱仪，江苏汉邦科技股份有限公司；LC-2030 高效液相色谱仪，岛津仪器有限公司；GM-0.33A 隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司。2 方法2.1 唐古特大黄地上部分乙醇提取物的制备取粉碎后的唐古特大黄地上部分干燥样品6.3kg，于 95%乙醇中以料液比 1:6 浸泡 3 天，过滤，收集滤液，重复四次，合并提取液，减压蒸发浓缩，将浓缩液合并烘干后得乙醇提取物 0.92kg。2.2 唐古特大黄地上部分乙醇提取物大孔吸附树脂分离用文献记载方法14对样品进行大孔树脂柱分离。将 400g 大孔树脂充分浸泡在 95%乙醇中，乙醇液面没过树脂，静置 24h，使其充分溶胀，再用纯水浸泡，将大孔树脂中的乙醇置换出来，直至无明显醇味即可使用。在柱底端铺一层脱脂棉两层纱布，防止填料漏出，将大孔树脂混合纯水倒入。采用逆流灌注法排气，将广口瓶连接橡胶管制成反冲装置，装纯水后连接玻璃柱出水口，对大孔树脂柱进行反冲，除去柱内气泡，重填柱内孔隙，以免气阻影响样品的吸附，待树脂沉落稳定即可使用。用纯水和低浓度乙醇（浓度 20%）充分溶解样品，减压过滤得到澄清大黄地上部分提取物溶液 2L，缓慢加到大孔树脂上方，打开阀门，以每小时 2 柱体积的速度上样，待溶液完全进入大孔树脂柱后停留 2h，使其充分吸附。再用纯水及20%、40%、60%、80%、95%梯度浓度的乙醇洗脱，最终用纯水洗脱得到 50L，用 20%乙醇洗脱得到 114L，用 40%乙醇洗脱得到 190L，用 60%乙醇洗脱得到 132L，用 80%乙醇洗脱得到 50L，用 95%乙醇洗脱得到 50L。这六个组分命名为Fr1Fr6，经干燥称重，得到组分重量 Fr1 为 68.32g、Fr2 为 18.18g、Fr3 为 29.86g、Fr4 为 21.71g、Fr5为 5.69g、Fr6 为 5.14g。2.3 用半制备液相色谱分离制备组分将各组分样品溶于乙醇后按照梯度稀释，在96 孔板上分别与避光配制后的 DPPH 溶液充分反应 20min，在紫外分光光度计下测定其吸光度，随后进行 IC50计算分析。根据组分 DPPH 清除率IC50值，用半制备液相色谱仪进一步分离唐古特大黄地上部分乙醇提取物 Fr3Fr6，分析条件为：色谱柱：ODSC18（20mm200mm）柱；流动相：0.2%甲酸水（A）、色谱乙腈（B）；洗脱程序：025min2%色谱乙腈；进样量：0.1mL；流速：20.0mL/min；紫外检测器波长：254nm；柱温：35。分离制备得到 13 个组分。Fr3制备条件：汉邦NS4205 反相-半制备型高效液相色谱仪；制备柱：ODSC18（20mm200mm）；流动相：0.2%甲酸水（A）、色谱甲醇（B）；洗脱程序：050min37%色谱甲醇；进样量：0.1mL；130青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY流速：20.0mL/min；紫外检测器波长：254nm；柱温：35（图 1）。图 1 Fr3 半制备液相色谱制备图Fr4制备条件：汉邦NS4205 反相-半制备型高效液相色谱仪；制备柱：ODSC18（20mm200mm）；流动相：0.2%甲酸水（A）、色谱乙腈（B）；洗脱程序：040min25%色谱乙腈；进样量：0.1mL；流速：20.0mL/min；紫外检测器波长：254nm；柱温：35（图 2）。图 2 Fr4 半制备液相色谱制备图Fr5制备条件：汉邦NS4205 反相-半制备型高效液相色谱仪；制备柱：ODSC18（20mm200mm）；流动相：0.2%甲酸水（A）、色谱乙腈（B）；洗脱程序：030min32%色谱乙腈；进样量：0.1mL；流速：20.0mL/min；紫外检测器波长：254nm；柱温：35（图 3）。图 3 Fr5 半制备液相色谱制备图Fr6制备条件：汉邦NS4205 反相-半制备型高效液相色谱仪；制备柱：ODSC18（20mm200mm）；流动相：0.2%甲酸水（A）、色谱乙腈（B）；洗脱程序：60%75%色谱乙腈；进样量：0.1mL；流速：20.0mL/min；紫外检测器波长：254nm；柱温：35（图 4）。图 4 Fr6 半制备液相色谱制备图上述组分冷冻干燥，称得重量。Fr31：271.72mg，Fr32：95.41mg，Fr33：203.5mg，Fr41：235.12mg，Fr42：92.56mg，Fr43：41.84mg，Fr44：195.69mg，Fr45：222.03mg，Fr51：163.74mg，Fr52：107.83mg，131青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGYFr53:130.04mg，Fr61：129.63mg，Fr62：84.55mg。2.4 DPPH 自由基清除率的测定样品溶于 50%乙醇中，配制成浓度为 2mg/mL的母液，按梯度稀释，浓度分别为 1000g/mL、500g/mL、100g/mL、10g/mL 和 1g/mL。将30L 不同浓度的样品溶液移至 96 孔板中，再加入 70LDPPH 溶液，重复三次。设置空白组（Ao，每个孔加入 100L50%乙醇）和对照组（Ac，每个孔加入 30L50%酒精和 70LDPPH）。在每个样品孔中加入 DPPH 溶液后，将 96 孔板置于避光条件下，振荡孵育 30min，使样品溶液与 DPPH自由基充分反应，然后在 517nm 波长下检测其吸光度。DPPH 清除率用以下公式计算：2.5 IC50值及抑制曲线计算 DPPH 清除率的平均值，用 IBMSPSSStatistics20 计算每个样品 DPPH 清除率平均值的IC50及 95%置信区间，并使用 GraphPadPrism9.5绘制相应的曲线。3 结果通过唐古特大黄的提取后测定了唐古特大黄地上部分乙醇提取物的 DPPH 清除率，计算其 IC50值并绘制抑制曲线（如图 5）。图 5 唐古特大黄地上部分乙醇提取物对 DPPH 的抑制率曲线在唐古特大黄总样抗氧化性测定良好的情况下，测定了大孔树脂分离后各组分 Fr1Fr6 的DPPH 最大半抑制浓度。结果表明，唐古特大黄地上部分提取物DPPH 自由基清除率中 Fr3、Fr4、Fr5、Fr6 在体外具有最强的抗氧化活性，DPPH 自由基的 IC50值分别为 25.34g/mL、51.51g/mL、88.79g/mL 和207.09g/mL（图 6）。图 6 Fr1Fr6 对 DPPH 的抑制率曲线132青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGYDPPH 自 由 基 清 除 率 表 明，化 合 物 Fr31、Fr32、Fr33、Fr43、Fr45、Fr52、Fr53、Fr62 在 体外具有较高的抗氧化活性，对 DPPH 自由基的 IC50值分别为 47.39g/mL、87.53g/mL、47.43g/mL、46.53g/mL、35.53g/mL、146.48g/mL、91.23g/mL和 74.55g/mL（图 7、图 8）。图 7 Fr311Fr431 对 DPPH 的抑制率曲线图 8 Fr441Fr621 对 DPPH 的抑制率曲线133青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGY4 结论与展望唐古特大黄的传统药用部位为地下部分（根），而占唐古特大黄总生物资源一半以上的地上部分通常被废弃，目前对该部分的相关研究也较少。本研究从唐古特大黄地上部分的乙醇提取物中，以大孔树脂分离得到 8 个抗氧化活性较好的组分，并采用 DPPH 清除率法验证了其体外抗氧化活性。结果表明，唐古特大黄地上部分乙醇提取物有一定的抗氧化活性，其中 Fr3、Fr4、Fr5、Fr6 的抗氧化活性显著，说明唐古特大黄地上部分醇提取物有较好的抗氧化活性，或许有望进行进一步的应用价值开发。参考文献:1MATTHEWOD.AnalysisofchemicalcomponentsandcioactivityevaluationoftheinflorescencestemofrheumtanguticumD.西南科技大学,2021.2李龙昱.基于MTT法研究唐古特大黄多糖对不同肿瘤细胞的抑制作用J.中国高原医学与生物学杂志,2019,40(3):180-183.3SHENN,CUIYL,XUWH.AnthraquinoneandflavonoidcompoundsfromgumofRheumtanguticumJ.ChemistryofNaturalCompounds,2021,57(3):521-522.4SHANGXF,ZHAOZM,LiJC,etal.InsecticidalandantifungalactivitiesofRheumpalmatumL.anthraquinonesandstructurallyrelatedcompoundsJ.IndustrialCropsandProducts,2019,137:508-520.5CHENY,COCKIE.RheumpalmatumL.rootextractsinhibitthegrowthofbacterialtriggersofselectedautoimmuneinflammatorydiseasesandpotentiatetheactivityofconventionalantibioticsJ.PharmacognosyCommunications,2022,12(3):109-119.6DENGRX.ChemicalconstituentsoftanninfromrootsofRheumpalmatumJ.ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2020:908-911.7张丙生,王树槐,宋根萍,等.大黄挥发油化学成分的研究J.中草药,1992,23(3):165-166.8WUDT,YUANQ,FENGKL,etal.FecalfermentationcharacteristicsofRheumtanguticumpolysaccharideanditseffectonthemodulationofgutmicrobialcompositionJ.ChineseMedicine,2022,17(1):79.9FORMANHJ,ZHANGH.Targetingoxidativestressindisease:promiseandlimitationsofantioxidanttherapyJ.NatureReviewsDrugDiscovery,2021,20(9):689-709.10TENAN,MARTNJ,ASUEROAG.Stateoftheartofanthocyanins:antioxidantactivity,sources,bioavailabilityandtherapeuticeffectinhumanhealthJ.Antioxidants(Basel,Switzerland),2020,9(5):451.11QUANW,HEW,QIEXJ,etal.Effectsof-cyclodextrin,wheyprotein,andsoyproteinonthethermalandstoragestabilityofanthocyaninsobtainedfrompurple-fleshedsweetpotatoesJ.FoodChemistry,2020,320:126655.12NAKAGAWASOYA,OHMURARYO,TOSHIMASAK.Changesinpolyphenols,anthocyanins,andDPPHradical-scavengingactivitiesinsweetpotato(IpomoeabatatasL.)duringtubergrowthJ.ScientiaHorticulturae,2021,284.13MUNTEANUIG,APETREIC.Analyticalmethodsusedindeterminingantioxidantactivity:areviewJ.InternationalJournalofMolecularSciences,2021,22(7):3380.14田金凤.玄参和黄连的化学成分分离及其生物活性研究D.西南大学,2013.134青海科技202303成果视窗青海科技INGHAI SCIENCE AND TECHNOLOGYStudy on Antioxidant Activity of Aboveground Part of Rheum TanguticumPangQin,CuiYunbin,QiDesheng,SunShihao,MaJianbin（KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationonQinghai-TibetPlateau,CollegeofLifeSciences,QinghaiNormalUniversity,Xining810008,China）Abstract:Objective:Rheum Tanguticumisaperennialherb.Traditionally,theabovegroundpartofRheum Tanguticumisclassifiedasnon-medicinalparts,whichareoftenabandonedinthecollectionofmedicinalmaterials.InordertofullyexplorethepotentialvalueofRheum Tanguticumresources,thisstudytooktheabovegroundpartofRheum Tanguticumastheresearchobjecttoconductamaterialbasisstudyonantioxidantactivity.Methods:TheabovegroundpartofRheumTanguticumtwasextractedbyalcoholextractionmethod,andthesamplewaspreliminicallyseparatedbymacroporousadsorptionresin.ThefreeradicalscavengingrateofthealcoholextractandeachcomponentofRheum TanguticumwasverifiedbyDPPHradicalscavengingexperiment,andtheactivecomponentwaspurified.Results:TheethanolextractsfromabovegroundpartsofRheum Tanguticumhadcertainantioxidantactivities,andtheantioxidantactivitiesofFr3,Fr4,Fr5andFr6werethestrongest.Conclusion:TheabovegroundpartofRheum Tanguticumhasthevalueoffurtherapplicationanddevelopment.Keywords:Rheum Tanguticum;Abovegroundpart;Antioxidantactivity（上接第 55 页）Development of an Integrated Testing Vehicle for Electrical Performance Standards and Defects of On-site Components in Photovoltaic Power PlantsLiWanganshun1,GuoHaogang2,LiChangen3,WangZhuo1,ZhuGuangtai1（1.QinghaiTech-CreationRenewableEnergyCo.,Ltd,Xining810000,China;2.GsolarPowerCo.,Ltd,Xi an710000,China;3.ChinaNorthwestWaterConservancy&HydropowerEngineeringConsultingCompany,Xi an710000,China）Abstract:Basedonthecurrenttestingneedsandactualsituationofon-sitesolarcellmodulesinphotovoltaicpowerplants,anintegratedtestingvehiclefortheelectricalperformancestandardsanddefectsofon-sitemodulesinphotovoltaicpowerplantshasbeendeveloped.Thistestingvehicleintegratesthreetestingtechnologies,namelysolarcellmoduleelectricalperformance(I-V),latentdefects(EL),infraredthermalimaging,andcanachievestandardtestingconditionsonsiteinphotovoltaicpowerplants,quicklydetectsolarcellmodulepower,latentdefects,andinfraredthermalimaging,andprovideauthoritativetestingreports.Keywords:Photovoltaicpowerplant;Electricalperformancestandardstate;Infraredthermalimaging;Implicitdefects;Integrated;Inspectionvehicle