双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对2型糖尿病小鼠糖代谢的影响.pdf

14Journal of Xiangnan University（Medical Sciences）Jun.2023 Vol.25 No.2双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对 2 型糖尿病小鼠糖代谢的影响李海龙，马文萱，谢兆涌，王建腾，高 天，杨 光*（石河子大学药学院，新疆 石河子 832000）摘 要：目的 探讨双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对 2 型糖尿病（T2DM）小鼠糖代谢的影响。方法 选取昆明小鼠 80 只，给予高脂饲料+10%蔗糖溶液喂养 2 周，采用四氧嘧啶 200 mg/kg 腹腔注射建立糖尿病小鼠模型，并将造模后小鼠的饮水更换为 25%蔗糖溶液。在四氧嘧啶腹腔注射后的第 7 天，测定小鼠餐后 2 h 血糖，以餐后 2 h 血糖水平 7.8 mmol/L 视为模型建立成功。造模成功后的小鼠分别给予 0.9%氯化钠溶液（模型组），二甲双胍（400 mg/kg）（二甲双胍组），二甲双胍联合双歧杆菌乳杆菌三联活菌片剂量低（1107 CFU/kg）（低剂量组）、中（2107 CFU/kg）（中剂量组）、高（3107 CFU/kg）（高剂量组）灌胃，连续 3 周后检测小鼠餐后 2 h 血糖，进行小鼠胰腺组织病理学检查及小鼠肠道菌群的丰富度分析。结果 给药后，与模型组比较，给药组餐后 2 h 血糖均下降（均 P0.05）；与二甲双胍组比较，高剂量组的餐后 2 h 血糖下降程度有统计学意义（P0.05）；高剂量组对 T2DM 小鼠的胰腺组织病理学评分与模型组比较有统计学意义（P0.05）；高剂量组小鼠肠道菌群 Chao1 指数高于低、中剂量组和二甲双胍组且具有统计学意义（P0.05）。结论 与单用二甲双胍比较，高剂量双歧杆菌乳杆菌三联活菌片（3107 CFU/kg）联用二甲双胍能增加小鼠肠道菌的丰富度，更好地保护小鼠胰腺组织，发挥调节 T2DM 小鼠糖代谢作用，从而控制血糖水平。关键词：双歧杆菌乳杆菌三联活菌片；益生菌；肠道菌群；2 型糖尿病；血糖中图分类号：R587.1 文献标志码：A 文章编号：1673-498X（2023）02-0014-06doi:10.16500/ki.1673-498x.2023.02.003Effect of bifidobacterium lactobacillus triple viable tablets combined with metformin on glucose metabolism in type 2 diabetes miceLi Hailong,Ma Wenxuan,Xie Zhaoyong,et al.(School of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)Abstract:Objective To investigate the effect of bifidobacterium lactobacillus triple viable tablet combined with metformin on glucose metabolism in type 2 diabetes mice.Methods 80 Kunming mice were fed with high-fat diet plus 10%sucrose solution for 2 weeks.The diabetes mice model was established by intraperitoneal injection of alloxan 200 mg/kg,and the drinking water of the mice was changed to 25%sucrose solution after modeling.On the 7th day after intraperitoneal injection of alloxan,the 2 h postprandial blood glucose levels of mice were measured,and a 2 h postprandial blood glucose level of 7.8 mmol/L was considered as a successful model establishment.After successful modeling,mice were given 0.9%sodium chloride solution(model group),metformin(400 mg/kg,metformin group),and a low dose of metformin combined with bifidobacterium lactobacillus triple viable tablets(1107CFU/kg)(low-dose combination therapy group),medium(2107CFU/kg)(medium-dose group of combination medication),high(3107CFU/kg)(high-dose group of combined drugs).After 3 consecutive weeks,the mice were tested for 2 h postprandial blood glucose,histopathological examination of the mouse pancreas and analysis of the abundance of intestinal flora in mice.Results After administration,收稿日期：2023-02-04基金项目：2021 年石河子大学大学生研究训练计划项目（SRP2021149）作者简介：李海龙，男，本科在读。*通信作者：杨 光，男，讲师，E-mail：。15湘南学院学报（医学版）2023 年 6 月第 25 卷第 2 期2 型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）是由胰岛素分泌和（或）利用缺陷引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病 1，全球约有 4.22 亿糖尿病患者，糖尿病严重威胁着人类健康，引起了全球的关注 2。糖尿病指空腹血糖值高于 6.1 mmol/L 或餐后 2 h 血糖值高于 7.8 mmol/L，同时伴随饮水增多、排尿增多、进食增多且体重消瘦的“三高一低”特征 3。近年来的研究 4 表明，2 型糖尿病与人体肠道菌群的组成和结构有关。白钰等 5 研究发现 T2DM 病人粪便中柔嫩梭菌类、肠球菌属、大肠埃希菌属高于健康组，但双歧杆菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属低于健康组，提示肠道菌群失调特别是双歧杆菌的减少可能与糖尿病发生发展相关。同时，肠道菌群的失衡可导致内毒素的增加，而引起炎症细胞因子的释放进而会导致氧化应激，从而导致胰岛细胞受损，最终导致糖尿病 6。直接口服双歧杆菌三联活菌，可补充肠道双歧杆菌丰度，调节肠道菌群，进而改善胰岛素抵抗和血糖水平 7。益生菌治疗糖尿病的一项重要机制是促进了肠道内的短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的产生，进而影响内分泌激素的分泌，调控体内血糖的水平 8。Yadav 等 9 的一项研究证实了某些益生菌通过增加丁酸的产生来诱导胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）分泌的作用机制，而 GLP-1 的增加不仅能促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，并且可以导致胃排空延迟，食欲和摄食量减少 10。因此，本研究以高糖高脂饮食联合四氧嘧啶诱导昆明小鼠 T2DM 为模型，利用不同剂量的双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍治疗 T2DM 小鼠，观察其对T2DM 小鼠糖代谢的影响。1 材料与方法1.1 药物双歧杆菌乳杆菌三联活菌片（内蒙古双奇药业股份有限公司，药物批号 2021011322），每克双歧杆菌乳杆菌三联活菌片含长双歧杆菌不低于 1.0107 CFU、保加利亚乳杆菌不低于 1.0106 CFU、嗜热链球菌不低于 1.0106 CFU。其中起主要作用的为长双歧杆菌，其余两种菌株为辅助菌种。1.2 动物昆明雄性小鼠 80 只，67 周龄，体质量（302）g，购自新疆维吾尔自治区动物研究中心，动物许可证号 SCXK（新）2016-0003。动物饲养于温度（232）、湿度 40%60%的环境中，自由饮水。1.3 试剂四氧嘧啶（Alloxan，ALX，南京都莱生物公司）、盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司）、0.9%氯化钠注射液（北京费森尤斯卡比医药有限公司）、蔗糖（芜湖沐晟食品有限公司）。基础饲料、高糖高脂饲料：66.5%（质量分数，后同）基础饲料、20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1%胆酸钠（南京市江宁区青龙山动物繁殖场）。无水乙醇、二甲苯、切片石蜡、HE 染色剂（上海跃腾生物技术有限公司）。1.4 仪器血糖仪（三诺生物传感股份有限公司）、血糖试纸（三诺生物传感股份有限公司）、分析天平、灌胃针、注射器、Leica RM2245 型半自动切片机（大连瀚高贸易有限公司）、Pannoramic MIDI 型组织切片扫描仪（大连瀚高贸易有限公司）。1.5 方法1.5.1 建立糖尿病小鼠模型 昆明小鼠适应性喂养1 周，随机选取 8 只小鼠作为空白组，给予基础饲料+正常饮水喂养；其余 72 只小鼠用于建模，给予高脂高糖饲料+10%蔗糖溶液。喂养前测量血糖作为基础血糖，喂养 2 周后，模型组每只小鼠用四氧嘧啶compared with the model group,the decrease in blood glucose at 2 hours after meal in the administration group was statistically significant(P0.05);compared with the metformin group,the high-dose group had a lower and statistically significant 2-hour postprandial blood glucose decrease(P0.05);the histopathology examination and histopathological score analysis of the mouse pancreas showed that the combination of high-dose of drugs had the best protection on the pancreatic tissue of T2DM mice;the Chao1 index of intestinal microbiota in the high-dose group of mice was higher than that in the low and medium dose groups and the metformin group,with statistical significance(P0.05).Conclusion Compared with metformin alone,high-dose bifidobacterium lactobacillus triple viable tablets(3107 CFU/kg)combined with metformin can increase the abundance of intestinal flora in mice,better protect mouse pancreatic tissue,and play a better role in regulating glucose metabolism in T2DM mice,thus controlling blood glucose levels.Key words:bifidobacterium lactobacillus triple viable tablets;probiotics;intestinal flora;Type 2 diabetes;blood glucose16Journal of Xiangnan University（Medical Sciences）Jun.2023 Vol.25 No.2（5000 r/min，10 min，4）收集细菌细胞。细菌细胞用无菌预冷的盐水溶液洗涤两次，梯度稀释法用于确定菌浓度。用 Chao1 指数评估样本中的物种总数，即菌群的丰富度。1.6 统计学分析采用 SPSS 26.0 软件进行数据处理，所有实验数据以（xs）表示，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学分析，P0.05）。2.2 高糖高脂饮食结合四氧嘧啶对小鼠的影响模型组饲养箱内垫料潮湿，是排尿增多的表现。四氧嘧啶注射后 1 周，模型组小鼠的平均餐后 2 h 血糖升高至 9.186 mmol/L，高于空白组的 6.518 mmol/L（P0.05)；四氧嘧啶注射 4 周后模型组小鼠平均餐后2 h 血糖升高到 11.363 mmol/L，高于空白组的 6.513 mmol/L（P0.05），而高剂量组的病理学评分与模型组比较有统计学意义（P0.05），说明不同剂量组对保护胰岛组织的能力存在差异，以高剂量组保护最好（图 5）。2.3 双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对T2DM 小鼠餐后 2 h 血糖的影响给药后，与模型组比较，给药组餐后 2 h 血糖的下降（P0.05）；双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍的低、中、高剂量组餐后 2 h 血糖均低于二甲双胍组，仅高剂量组的餐后 2 h 血糖下降程度与二甲双胍组比较有统计学意义（P0.05）（图 2）。四氧嘧啶造模模拟糖尿病发生阶段体重显著下降（2131 天）；第三阶段：糖尿病得到初步控制体重回升（3359 天）。在 3359 天，与模型组比较，给药组2 型糖尿病小鼠的体质量增加（P0.05）（图 3）。表 1 空白组和模型组餐后 2 h 血糖比较（x s）组别四氧嘧啶注射后 1 周GLU/（mmol/L）四氧嘧啶注射 4 周GLU/（mmol/L）空白组6.5181.1306.5130.865模型组9.1861.421*11.3631.409*注：与空白组比较，*P0.05，*P0.01。图 3 小鼠体质量变化趋势注：*与模型组比较，P0.05；#与二甲双胍组比较，P0.05。图 2 双歧杆菌对小鼠餐后 2 h 血糖的影响2.4 双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对体质量的影响给药小鼠的平均体重分为三个阶段。第一阶段：高脂饮食构建肥胖小鼠模型（119 天）；第二阶段：A.空白组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.联合用药低剂量组；E.联合用药中剂量组；F.联合用药高剂量组。注：图中灰色为胰腺组织的形态和大小。图 4 小鼠胰腺病理学切片（400）ADBECF18Journal of Xiangnan University（Medical Sciences）Jun.2023 Vol.25 No.23 讨论T2DM 会导致体质量下降、高血糖和高脂血症，而胰岛素抵抗是 T2DM 发展的主要原因。已经发现补充益生菌可以恢复这种异常状态 12。特别是胰岛素敏感性降低是 T2DM 的典型特征，以往研究发现口服糖耐量与胰岛素敏感性呈正相关，反映了胰岛 细胞的功能和调节血糖的能力 13。益生菌可降低体内胰岛素水平，改善胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗 14。炎症与胰岛素抵抗之间的交叉联系研究证实 T2DM损害胰腺，导致体内的炎症 15，而益生菌可以通过提高免疫力和修复受损的胰腺来降低胰岛素抵抗 16。双歧杆菌是人体常见益生菌，包括4个常见菌种：婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。陈玲玲等 17 研究发现 T2DM 患者肠道双歧杆菌数量显著减少，TNF-、血清脂多糖水平显著升高。而肠道双歧杆菌数量减少与 T2DM 的发生和发展有直接联系 18。双歧杆菌三联活菌片是一种口服的活菌制 剂，成分为双歧杆菌、粪肠球菌及嗜酸乳杆菌，其进入肠道后在肠道表面形成一道微生物膜来阻断致病菌的黏附生长，纠正肠道菌群失调，重建微生态屏障 19-20。同时双歧杆菌三联活菌胶囊一方面能够通过调节糖脂能量代谢来提高胰岛素的敏感性和糖耐量，另一方面能够促进胰岛细胞 Bcl-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表达，下调胰岛细胞 Bax 的表达，从而保护胰岛 细胞，避免胰岛 细胞的凋亡，抑制胰岛内的炎性反应，减轻胰岛的损伤，有助于胰岛功能的恢复 21。Bauer等 22 发现高脂饮食会降低乳酸菌的丰度，T2DM 治疗药物二甲双胍可以通过增加乳酸菌的丰度调控血糖水平，同时补充益生菌能强化其降糖作用，以达到治疗效果。Liao 等 23 研究发现乳酸杆菌的丰度可调节部分肠道菌群，进而影响肠道吸收葡萄糖的重要转运蛋白来调节具有降糖作用的 DPP-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制剂，能够显著改善高脂饮食小鼠的肠道菌群失调，且进一步实验结果表明无菌小鼠在高脂一段时间后移植人体粪便菌群，与移植未经处理的 T2DM 患者肠道菌群的小鼠相比，通过粪便菌群移植 DPP-4 抑制剂干预后 T2DM 的小鼠血糖代谢情况得到明显的改善，这说明健康的肠道菌群在T2DM 的治疗中可能也发挥着重要的作用。传统 T2DM 造模是高脂高糖饮食喂养 46 周再加小剂量链脲佐菌素一次性给药的方法。通过口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance Test，OGTT)来判断模型是否为 2 型糖尿病，而且 OGTT 也是临床诊断糖尿病最常用的实验，但是糖尿病造模及药物干预过程中，需频繁测血糖，鉴于 OGTT 操作复杂，并不适用于长期频繁监测以评价模型稳定性。因此，本实验选择造模后餐后 2 h 血糖大于 7.8 mmol/L 作为模型成功的标准 11，利用高糖高脂饮食联合四氧嘧啶腹腔注射的方法建立了 T2DM 小鼠模型。造模成功后，灌胃双歧杆菌乳杆菌三联活菌片和二甲双胍干预小鼠糖尿病发展，检测小鼠餐后 2 h 血糖并对小鼠的胰腺进行病理学检查，通过对小鼠粪便细菌培养分析小鼠肠道菌群，分析双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对 2 型糖尿病小鼠糖代谢的调节作用。从本实验数据看，四氧嘧啶注射后，随着病程发展，模型组小鼠血糖上升、血糖代谢紊乱程度愈发地严重，与模型组比较，给药组小鼠餐后 2 h 血糖下降有统计学意义（P0.05）。二甲双胍发挥了抑制血糖升高、调节血糖代谢的效果，与单用二甲双胍比较，联合用药高剂量组可以显著降低糖尿病小鼠血糖水平（P0.05），联合用药中、低剂量组与二甲双胍组相比有下降趋2.6 双歧杆菌乳杆菌三联活菌片联合二甲双胍对小鼠肠道菌群多样性的影响与模型组相比，空白组，高、中、低剂量组，二甲双胍组的 Chao1 指数均升高（P0.05）；用药组中，低、中剂量组，二甲双胍组的 Chao1 指数均低于高剂量组（P0.05）（图 6）。注：*与模型组比较，P0.05。图 5 胰腺切片的病理组织学评分注：*与模型组比较，P0.05；#与二甲双胍组，低、中剂量组比较，P0.05），说明药物的药效与剂量相关，当双歧杆菌乳杆菌三联活菌片的应用剂量达到一定量后（3107 CFU/kg）会协同二甲双胍发挥更好的降糖效果，从而更好地调节 T2DM 小鼠的糖代谢；从病理切片及胰腺组织病理学评分结果看，模型组胰腺组织内分泌部胰岛细胞形态出现核固缩现象、细胞数目减少等，二甲双胍可以一定程度上缓解 T2DM 小鼠的胰腺病变，而二甲双胍联用双歧杆菌乳杆菌三联活菌片均能更好地发挥保护胰岛的作用，主要体现在胰岛细胞形态和数量的改善，其中高剂量组的缓解作用较中、低剂量组强，能更好地保护胰腺的内分泌功能；通过对小鼠肠道菌群 Chao1 指数分析，二甲双胍及二甲双胍联用高、中、低剂量的双歧杆菌乳杆菌三联活菌片都会改善小鼠肠道菌的丰富度，尤其是高剂量组改善明显。同时，给予降糖处理后小鼠体重有所回升，说明对于小鼠的代谢状态有所 缓解。综上所述，与单用二甲双胍比较，高剂量双歧杆菌乳杆菌三联活菌片（3107 CFU/kg）联用二甲双胍能增加小鼠肠道菌的丰富度，更好地保护小鼠胰腺组织，更好地发挥调节 T2DM 小鼠糖代谢作用，从而控制血糖水平，缓解糖代谢紊乱。参考文献：1 葛均波,徐永健,王辰.内科学 M.9 版.北京:人民卫生出版社,2018:725-748.2 Xu Y,Wang L M,He J,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults J.JAMA,2013,310(9):948-959.3 曾立,向荣,张运良,等.黄精多糖对糖尿病小鼠的降血糖作用及机制 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