桃叶珊瑚苷对膝骨关节炎小鼠的作用及机制实验研究.pdf

陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(S 2 0 2 1-J C-Y B-0 9 3 9)通讯作者:李治琴,E-m a i l:1 5 8 2 9 6 3 4 7 2 01 6 3.c o m桃叶珊瑚苷对膝骨关节炎小鼠的作用及机制实验研究夏红丽1,田俊斌2,李治琴1(1.西安市第三医院,陕西 西安7 1 0 0 2 1;2.西安交通大学第二附属医院,陕西 西安7 1 0 0 0 4)摘 要 目的:探讨桃叶珊瑚苷对膝骨关节炎(KOA)小鼠的作用及对细胞自噬和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P I 3 K/AK T/mT OR)信号通路的影响。方法:采用改良的H u l t h法制备膝关节KOA小鼠模型,随机分为模型组、桃叶珊瑚苷组、激动剂组、桃叶珊瑚苷+激动剂组,另设正常对照组,每组各1 0只。桃叶珊瑚苷组小鼠给予8 0m g/k g桃叶珊瑚苷灌胃;激动剂组小鼠腹腔注射0.5m o l/k g7 4 0 Y-P;桃叶珊瑚苷+激动剂组小鼠给予8 0m g/k g桃叶珊瑚苷灌胃,同时0.5m o l/k g7 4 0 Y-P腹腔注射;正常对照组和模型组小鼠分别灌胃和腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,1次/d,连续1 2周。采用HE染色和番红O-固绿染色观察软骨组织病理形态学变化,M a n k i n评分评估KOA严重程度。E L I S A法检测软骨组织中白细胞介素-6(I L-6)、I L-1和肿瘤坏死因子-(TN F-)水平。实时荧光定量P C R(R T-q P C R)法检测自噬相关基因(A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1、L C 3)、P I 3 K、AK T和mTO RmR NA水平。蛋白印迹法检测自噬相关蛋白、L C 3/、p-P I 3 K、p-AK T、p-mT OR蛋白水平。结果:与正常对照组比较,模型组关节软骨表面粗糙,细胞结构层次混乱、数量减少,潮线排列破坏严重;激动剂组软骨组织病变程度更重;桃叶珊瑚苷+激动剂组小鼠关节软骨表面稍光滑,细胞排列相对整齐、数量稍减少,潮线受损程度减轻;桃叶珊瑚苷组软骨组织病变程度明显改善。与模型组比较,桃叶珊瑚苷组M a n k i n评分、I L-6、I L-1和TN F-水平以及P I 3 K、AK T和mT ORmR NA水平降低,A t g 5、A t g 1 2和B a c l i n-1mR NA和蛋白表达升高,L C 3mR NA和L C 3/升高,p-P I 3 K、p-AK T和p-mT O R蛋白水平降低(均P0.0 5)。与桃叶珊瑚苷组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组M a n k i n评 分、I L-6、I L-1和TN F-水 平 以 及P I 3 K、AK T和mT OR mR NA水 平 升 高,A t g 5、A t g 1 2和B a c l i n-1mR NA和蛋白表达降低,L C 3mR NA和L C 3/降低,p-P I 3 K、p-AK T和p-mT OR蛋白水平升高(均P0.0 5)。与激动剂组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组M a n k i n评分、I L-6、I L-1和T N F-水平以及P I 3 K、AK T和mTO RmR NA水平降低,A t g 5、A t g 1 2和B a c l i n-1mR NA和蛋白表达升高,L C 3mR NA和L C 3/升高,p-P I 3 K、p-AK T和p-mTO R蛋白水平降低(均P0.0 5)。结论:桃叶珊瑚苷可改善KOA小鼠膝关节软骨病变,减轻炎症反应,其机制可能是通过抑制P I 3 K/AK T/mTO R信号通路诱导软骨细胞自噬。关键词 膝骨关节炎;桃叶珊瑚苷;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路;自噬;小鼠中图分类号:R2 8 5.5 文献标志码:A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0-7 3 7 7.2 0 2 3.0 9.0 0 8E f f e c t sa n dm e c h a n i s mo fa u c u b i no nk n e eo s t e o a r t h r i t i s i nm i c eX I A H o n g l i,T I ANJ u n b i n,L IZ h i q i n(X ia nN o.3H o s p i t a l,X ia n7 1 0 0 2 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c t so f a u c u b i no na u t o p h a g ya n dp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3-k i n a s e/p r o-t e i nk i n a s eB/m a mm a l i a n t a r g e t o f r a p a m y c i n(P I 3 K/AK T/mT O R)s i g n a l i n gp a t h w a y i nk n e eo s t e o a r t h r i t i s(KOA)m i c e.M e t h o d s:Ak n e eKOA m o u s em o d e lw a se s t a b l i s h e db ym o d i f i e d H u l t h m e t h o da n dr a n d o m l yd i v i d e di n t om o d e l g r o u p,a u c u b i ng r o u p,a g o n i s tg r o u p,a n da u c u b i n+a g o n i s tg r o u p,a n dn o r m a l c o n t r o l g r o u pw a ss e tu p,w i t h1 0m i c e i ne a c hg r o u p.T h em i c e i nt h ea u c u b i ng r o u pw e r eg i v e n8 0m g/k ga u c u b i nb yg a v a g e,t h em i c e i na g o n i s tg r o u pw e r e i n t r a p e r i t o n e a l l y i n j e c t e dw i t h0.5m o l/k g7 4 0 Y-P,t h em i c e i n t h e a u c u b i n+a g o n i s t g r o u pw e r eg i v e n8 0m g/k ga u c u b i nb yg a v a g ea n d0.5m o l/k g7 4 0 Y-Pb yi n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n,t h em i c ei nt h en o r m a lc o n t r o lg r o u pa n dt h em o d e l g r o u pw e r eg i v e n i n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o na n d i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o no f t h es a m ev o l u m eo f0.9%s o d i u mc h l o r i d es o l u t i o n,o n c ead a yf o r1 2w e e k s,r e s p e c t i v e l y.T h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fc a r t i l a g et i s s u ew e r eo b s e r v e db yHEs t a i n i n ga n ds a f f r o nO-s o l i dg r e e ns t a i n i n g,a n dt h es e v e r i t yo fKOAw a se v a l u a t e db yM a n k i ns c o r e.T h e l e v e l so f I L-6,I L-1a n dT N F-i nc a r t i l a g e t i s s u ew e r ed e t e c t e db yE L I S A.T h emR NAl e v e l so f a u t o p h-a g y-r e l a t e dg e n e s(A t g 5,A t g 1 2,B a c l i n-1,L C 3),P I 3 K,AK Ta n dmT ORw e r ed e t e c t e db yR T-q P C R.T h ep r o t e i n l e v-e l so f a u t o p h a g y-r e l a t e dp r o t e i n s,L C 3/,p-P I 3 K,p-AK T,a n dp-mT ORw e r ed e t e c t e db yW e s t e r nb l o t.R e s u l t s:C o m p a r e dw i t ht h en o r m a l c o n t r o l g r o u p,t h e a r t i c u l a r c a r t i l a g e s u r f a c eo f t h em o d e l g r o u pw a s r o u g h,t h e c e l l s t r u c-t u r ew a sd i s o r d e r l y,t h en u m b e r o f c e l l sw a s r e d u c e d,a n d t h e t i d e l i n e a r r a n g e m e n tw a s s e r i o u s l yd a m a g e d.T h ep a t h-05112 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a lo l o g i c a l c h a n g e so f c a r t i l a g e t i s s u e i na g o n i s tg r o u pw e r em o r es e v e r e.T h ea r t i c u l a rc a r t i l a g es u r f a c eo fm i c e i nt h ea u c u b i n+a g o n i s tg r o u pw a ss l i g h t l ys m o o t h,t h ec e l l sw e r er e l a t i v e l yo r d e r l ya r r a n g e d,t h en u m b e ro fc e l l sw a ss l i g h t l yr e d u c e d,a n dt h ed a m a g ed e g r e eo f t h e t i d e l i n ew a sa l l e v i a t e d.T h ep a t h o l o g i c a l c h a n g e so f c a r t i l a g e t i s s u e i nt h ea u c u b i ng r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yi m p r o v e d.C o m p a r e dw i t ht h em o d e lg r o u p,t h eM a n k i ns c o r e,I L-6,I L-1a n dT N F-l e v e l s,P I 3 K,AK Ta n d mT O R mR NAl e v e l sw e r ed e c r e a s e d,a n dt h e mR NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o n so fA t g 5,A t g 1 2a n dB a c l i n-1,L C 3 mR NAa n dL C 3/w e r ei n c r e a s e d,t h ep r o t e i nl e v e l so fp-P I 3 K,p-AK Ta n dp-m t o rw e r ed e c r e a s e d i nt h e a u c u b i ng r o u p.(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ea u c u b i ng r o u p,t h eM a n k i ns c o r e,t h el e v e l so f I L-6,I L-1a n dT N F-,a n d t h emR NAl e v e l so fP I 3 K,AK Ta n dmT O Rw e r e i n c r e a s e d,a n d t h emR NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o n so fA t g 5,A t g 1 2a n dB a c l i n-1,L C 3 mR NAa n dL C 3/r a t i ow e r ed e c r e a s e d,w h i l ep-P I 3 K,p-AK Ta n dp-m t o rp r o t e i n l e v e l sw e r e i n c r e a s e d i nt h ea u c u b i n+a g o n i s tg r o u p(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ea g o n i s tg r o u p,t h eM a n k i ns c o r e,t h e l e v e l s o f I L-6,I L-1a n dTN F-a n d t h emR NAl e v e l s o fP I 3 K,AK Ta n dmTO Rw e r ed e c r e a s e d,t h emR NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o n so fA t g 5,A t g 1 2a n dB a c l i n-1,L C 3mR NAa n dL C 3/w e r ei n c r e a s e d,t h ep r o t e i n l e v e l so fp-P I 3 K,p-AK Ta n dp-m t o rw e r ed e c r e a s e di nt h ea u c u b i n+a g o n i s tg r o u p(a l lP0.0 5).C o n c l u s i o n:A u c u b i nc a n i m p r o v ek n e e c a r t i l a g e l e s i o n sa n dr e d u c e i n f l a mm a t o r yr e s p o n s e i nm i c ew i t hKOA,a n d i t sm e c h a n i s m m a yb e t o i n h i b i t t h eP I 3 K/AK T/mTO Rs i g n a l i n gp a t h w a y t o i n d u c e a u t o p h a g yo f c h o n d r o c y t e s.K E Y WO R D S K n e eo s t e o a r t h r i t i s;A u c u b i n;P I 3 K/AK T/mTO Rs i g n a l i n gp a t h w a y;A u t o p h a g y;M i c e 膝骨关节炎(K n e eo s t e o a r t h r i t i s,KOA)是老年患者残疾的重要原因,严重降低了患者的生活质量1。自噬是维持细胞内环境稳态的重要途径2。研究3发现,补肾调肝方含药血清增强软骨细胞自噬能力,延缓大鼠关节软骨退变,起到治疗KOA的作用。研究4表明,激活自噬可在一定程度上延缓KOA进展。桃叶珊瑚苷是环烯醚萜苷类化合物,杜仲所含天然活性成分之一。研究5表明,桃叶珊瑚苷可通过诱导自噬抑制成骨细胞凋亡。研究6发现,桃叶珊瑚苷可在体外抑制白细胞介素(I n t e r l e u k i n,I L)-1诱导的软骨细胞凋亡,在体内延缓KOA小鼠病程进展。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋 白 激 酶B/哺 乳 动 物 雷 帕 霉 素 靶 蛋 白(P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 3-k i n a s e s/p r o t e i n k i n a s e B/m a mm a l i a n t a r g e t o f r a p a m y c i n,P I 3 K/AK T/mTO R)信号通路是细胞自噬的重要信号转导通路。研究7表明,P I 3 K/AK T/mTO R信号通路在KOA大鼠软骨组织中异常活化,续断总皂苷通过抑制该信号通路上调软骨细胞自噬水平,延缓KOA进展。但关于桃叶珊瑚苷能否通过调节软骨细胞自噬改善KOA的相关报道较少。因此,本研究探讨桃叶珊瑚苷对KOA小鼠的作用及机制。1 材料与方法1.1 实验动物 S P F级雄性C 5 7小鼠5 0只,7周龄,体重(2 22)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号:S C X K(沪)2 0 1 7-0 0 0 5。所有小鼠饲养于温度(2 32)、空气湿度5 0%6 0%、1 2h明暗交替的环境中,自由进食和饮水。1.2 主要试剂 桃叶珊瑚苷(批号:S A 9 8 4 0,纯度9 8%,北京索莱宝科技有限公司);P I 3 K/AK T/mTO R信号通路激动剂7 4 0 Y-P(批号:S 8 0 2 1 1,上海源叶生物科技有限公司);I L-6检测试剂盒(批号:P I 3 2 6,上海碧云天生物科技有限公司);I L-1检测试剂盒(批号:BM S 6 0 0 2,北京诺为生物);肿瘤坏死因子-(T N F-)检测试剂盒(批号:S P S-3 1 5 1 7,上海赛培森生物科技有限公司);自噬相关蛋白(A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1、L C 3/)及p-P I 3 K、P I 3 K、p-AK T、AK T、p-mTO R、mTO R和GA P DH抗体(批号:a b 1 0 8 3 2 7、a b 3 0 3 4 8 8、a b 2 0 7 6 1 2、a b 1 9 2 8 9 0、a b 2 7 8 5 4 5、a b 3 0 2 9 5 8、a b 3 8 4 4 9、a b 8 8 0 5、a b 1 0 9 2 6 8、a b 1 3 4 9 0 3、a b 8 2 4 5,美国A b c a m公司)。1.3 实验方法1.3.1 分组与模型制备:将5 0只小鼠随机分为正常对照组、模型组、桃叶珊瑚苷组、激动剂组、桃叶珊瑚苷+激动剂组,每组1 0只。除正常对照组外,其余组小鼠根据改良的H u l t h法8建立KOA模型。小鼠腹腔麻醉,纵行切开右后肢膝关节部位皮肤,暴露膝关节,离断前、后交叉韧带和内侧副韧带,打开关节腔,切除内侧2/3半月板,止血后逐层缝合。正常对照组小鼠采用同样的操作暴露关节腔,不离断前、后交叉韧带和内侧副韧带,不切除半月板。术后肌注青霉素抗感染。1.3.2 给药与取材:造模后第2天,桃叶珊瑚苷组8 0m g/k g6桃叶珊瑚苷灌胃,1次/d,连续1 2周;激动剂组腹腔注射7 4 0 Y-P0.5m o l/k g9,1次/d,连续1 2周;桃叶珊瑚苷+激动剂组8 0m g/k g桃叶珊瑚苷灌胃,同时0.5m o l/k g7 4 0 Y-P腹腔注射,1次/d,连续1 2周;正常对照组和模型组小鼠分别灌胃和腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,1次/d,连续1 2周。于末次给药2h后处死小鼠,采集右后肢膝关节软骨组织,分成4份,其中1份进行乙二胺四乙酸二钠(E D T A)脱钙处理4周,4%多聚甲醛固定,其余3份置于-8 0冰箱保存。1511陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.91.3.3 HE染色:取经4%多聚甲醛固定后组织,经脱水、包埋、石蜡切片、伊红染液染色、双蒸水冲洗、苏木素染液染色、双蒸水清洗、中性树胶封片后,于显微镜下观察小鼠膝关节组织病理形态学变化,并进行M a n-k i n评分。其中,软骨表面损伤计06分,细胞丧失计03分,基质染色丧失计04分,潮线丧失计01分,分值越高表明病变越严重1 0。1.3.4 番红O-固绿染色:取石蜡切片,严格按照试剂盒说明书进行染色。1.3.5 软骨组织炎症因子水平检测:取冻存的软骨组织,剪碎,匀浆后3 0 0 0r/m i n离心1 0m i n,取上清液,严格按照E L I S A试剂盒说明书检测I L-6、I L-1和T N F-水平。1.3.6 实时荧光定量P C R(R T-q P C R)检测自噬相关基因、P I 3 K、AK T和mTO R mR NA水平:取冻存的软骨组织,剪碎,匀浆后采用T R I z o l试剂提取组织R NA,反转录成c D NA,以c D NA为模板行P C R反应。以GA P DH为内参,引物由广州锐博生物科技有限公司合成,序列见表1。以2-C t法计算目的基因表达水平。表表11 各基因引物序列基 因正向引物序列反向引物序列A t g 55-T G T G C T T C G AG A T G T G T G G T T-35-A C C AA C G T C AAA T AG C T GA C T C-3A t g 1 25-T C C C C G G AA C G AG G AA C T C-35-T T C G C T C C A C AG C C C A T T T C-3B a c l i n-15-T C A G C C G GA G A C T C AA G G T-35-C A C A G C G G G T G A T C C A C A T C-3P I 3 K5-A C A C C A C G G T T T G G A C T A T G G-35-G G C TA C AG T AG T G G G C T T G G-3AK T5-A GAAG A GA C GA T G G A C T T C C G-35-T C AAA C T C G T T C A T G G T C A C A C-3mTO R5-G G C A C A C A T T T G AA GAA G C A G-35-C T C G T T G AG G A T C AG C AAG G-3L C 35-G A C C G C T G TAAG G AG G T G C-35-C T T GA C C AA C T C G C T C A T G T T A-3G A P DH5-A GA G AG G C C C A G C TA C T C G-35-C AAA T C C G T T C A C A C C G A C C-31.3.7 蛋白印迹法检测自噬相关蛋白、L C 3/、P I 3 K、p-P I 3 K、AK T、p-AK T、mTO R和p-mTO R蛋白水平:取冻存的软骨组织,剪碎,匀浆,裂解,B C A法测定蛋白浓度。蛋白电泳分离,取下分离胶,将分离胶上的蛋白湿转至P V D F膜,T B S T洗涤,5%脱脂奶粉室温封闭2h,加入相关抗体(均11 0 0 0稀释),4 孵育过夜,加入相关二抗(均15 0 0 0稀释)室温孵育,显色后采用I m a g eJ分析条带灰度值。1.4 统计学方法 采用S P S S2 1.0统计学软件分析数据,计量资料以(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较行L S D-t检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 小鼠膝关节软骨组织染色结果及M a n k i n评分比较 见表2(图1)。染色结果显示:与正常对照组比较,模型组关节软骨表面粗糙,细胞结构层次混乱,数量减少,潮线排列破坏严重;激动剂组软骨组织病变程度更重;桃叶珊瑚苷+激动剂组小鼠关节软骨表面稍光滑,细胞排列相对整齐,数量稍减少,潮线受损程度减轻;桃叶珊瑚苷组软骨组织病变程度明显改善。统计学分析显示:与正常对照组比较,模型组M a n k i n评分升高(P0.0 5);与模型 组比较,桃 叶 珊 瑚 苷 组M a n k i n评分降低(P0.0 5);与桃叶珊瑚苷组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组M a n k i n评分升高(P0.0 5);与激动剂组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组M a n k i n评分降低(P0.0 5)。表表22 各组小鼠M a n k i n评分比较(分)组 别nM a n k i n评分正常对照组1 03.8 50.6 4模型组1 02 2.5 93.0 6*桃叶珊瑚苷组1 01 1.7 03.5 4#激动剂组1 02 6.8 84.2 6#桃叶珊瑚苷+激动剂组1 01 7.9 64.5 7 注:与正常对照组比较,*P0.0 5;与模型组比较,#P0.0 5;与桃叶珊瑚苷组比较,P 0.0 5;与激动剂组比较,P0.0 52.2 各组小鼠软骨组织I L-6、I L-1和T N F-水平比较 见表3。与正常对照组比较,模型组I L-6、I L-1和T N F-水平升高(均P0.0 5)。与模型组比较,桃叶珊瑚苷组I L-6、I L-1和T N F-水平降低(均P0.0 5)。与桃叶珊瑚苷组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组I L-6、I L-1和T N F-水平升高(均P0.0 5)。与激动剂组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组I L-6、I L-1和T N F-水平降低(均P0.0 5)。2.3 各组小鼠软骨组织自噬相关基因、P I 3 K、AK T和mTO RmR NA水平比较 见表4。与正常对照组比较,模型组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1、L C 3 mR NA降低,P I 3 K、AK T、mTO R mR NA水 平 升 高(均P0.0 5)。与模型组比较,桃叶珊瑚苷组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1、L C 3m R N A升高,P I 3 K、A K T、m T O R m R N A降低(均P0.0 5)。与桃叶珊瑚苷组比较,桃叶珊瑚25112 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l苷+激动剂组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1、L C 3mR NA降低,P I 3 K、AK T和mTO RmR NA升高(均P0.0 5)。与激动 剂 组 比 较,桃 叶 珊 瑚 苷+激 动 剂 组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1、L C 3 mR NA升 高,P I 3 K、AK T和mTO RmR NA降低(均P0.0 5)。图1 各组小鼠膝关节软骨组织HE染色和番红O-固绿染色结果(2 0 0)表表33 各组小鼠软骨组织I L-6、I L-1和T N F-水平比较(n g/L)组 别nI L-6I L-1TN F-正常对照组1 02 3.5 05.2 25 9.0 68.4 28 3.4 18.7 5模型组1 01 2 2.4 91 1.3 7*1 4 8.3 11 3.9 0*2 0 1.3 32 6.4 3*桃叶珊瑚苷组1 07 3.9 09.4 2#9 1.4 81 1.4 7#1 4 2.4 91 8.4 6#激动剂组1 01 8 5.3 41 5.3 9#1 9 0.5 31 9.8 3#2 2 5.8 02 9.8 3#桃叶珊瑚苷+激动剂组1 01 0 5.8 61 4.7 71 2 2.4 41 8.3 51 8 4.0 62 2.9 9 注:与正常对照组比较,*P 0.0 5;与模型组比较,#P 0.0 5;与桃叶珊瑚苷组比较,P 0.0 5;与激动剂组比较,P 0.0 5表表44 各组小鼠软骨组织自噬相关基因、P I 3 K、AK T和mT O RmR NA水平比较(xs)组 别nA t g 5A t g 1 2B a c l i n-1L C 3P I 3 KAKTmT O R正常对照组1 03.5 90.4 22.8 60.3 35.0 90.6 36.2 80.6 42.0 60.4 44.7 50.5 95.2 00.6 3模型组1 02.7 50.4 4*2.1 00.3 5*3.4 80.5 5*3.5 10.3 5*5.7 00.5 2*7.5 20.6 6*6.8 80.6 8*桃叶珊瑚苷组1 06.8 90.5 3#5.9 60.4 5#7.2 70.6 6#8.4 20.5 2#1.3 80.3 3#3.5 10.4 4#3.0 90.5 5#激动剂组1 02.1 60.3 0#1.4 20.3 6#2.3 00.4 1#2.2 20.4 1#6.3 90.7 3#8.4 80.6 3#7.3 90.7 4#桃叶珊瑚苷+激动剂组1 04.8 40.5 63.8 80.4 14.8 30.5 75.8 00.4 74.7 70.4 25.8 80.7 34.8 50.6 4 注:与正常对照组比较,*P0.0 5;与模型组比较,#P0.0 5;与桃叶珊瑚苷组比较,P0.0 5;与激动剂组比较,P0.0 52.4 各组小鼠软骨组织自噬相关蛋白、L C 3/、p-P I 3 K、p-AK T和p-mTO R蛋白水平比较 见表5。与正常对照组比较,模型组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1蛋白 水 平 以 及L C 3/降 低,p-P I 3 K、p-AK T和p-mTO R蛋白水平升高(均P0.0 5)。与模型组比较,桃叶珊瑚苷组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1蛋白水平和L C 3/升高,p-P I 3 K、p-AK T和p-mTO R蛋白水平降低,而激动剂组与之相反(均P0.0 5)。与桃叶珊瑚苷组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1蛋白水平和L C 3/降低,p-P I 3 K、p-AK T和p-mTO R蛋白水平升高(均P0.0 5)。与激动剂组比较,桃叶珊瑚苷+激动剂组A t g 5、A t g 1 2、B a c l i n-1和L C 3/升高,p-P I 3 K、p-AK T和p-mTO R蛋白水平降低(均P0.0 5)。表表55 各组小鼠软骨组织自噬相关蛋白、L C 3/、P I 3 K、p-P I 3 K、AK T、p-AK T、mT OR和p-mTO R蛋白水平比较(xs)项 目正常对照组(n=1 0)模型组(n=1 0)桃叶珊瑚苷组(n=1 0)激动剂组(n=1 0)桃叶珊瑚苷+激动剂组(n=1 0)A t g 50.8 50.0 60.4 10.0 4*0.9 10.0 6#0.1 90.0 4#0.4 80.0 5A t g 1 20.8 70.0 70.3 70.0 4*0.7 60.0 5#0.1 80.0 3#0.5 30.0 5B a c l i n-10.8 20.0 80.4 20.0 4*1.0 20.0 6#0.1 90.0 5#0.5 50.0 7L C 3/0.6 20.0 40.7 30.0 6*1.0 40.0 8#0.4 80.0 3#0.9 60.0 7p-P I 3 K0.0 90.0 20.5 40.0 6*0.3 30.0 5#0.8 70.0 7#0.7 40.0 5P I 3 K1.0 10.0 60.9 80.0 70.9 50.0 60.9 60.0 71.0 10.0 8p-AK T0.1 10.0 40.3 50.0 5*0.0 70.0 2#0.8 70.0 8#0.4 80.0 7AK T0.9 70.0 80.9 80.0 90.9 70.0 60.9 50.0 70.9 60.0 6p-mT O R0.0 80.0 20.7 10.0 6*0.1 40.0 6#0.8 70.0 8#0.2 20.0 6mTO R0.9 30.0 60.9 70.0 70.9 40.0 50.9 10.0 60.8 80.0 7 注:与正常对照组比较,*P 0.0 5;与模型组比较,#P 0.0 5;与桃叶珊瑚苷组比较,P 0.0 5;与激动剂组比较,P 0.0 53511陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.93 讨 论随着病程进展,骨关节炎患者常出现关节软骨退化,伴边缘骨赘形成,好发于膝、髋、颈椎和腰椎等负重关节,主要临床表现为关节疼痛、僵硬、肥大和活动受限。临床上主要通过非甾体类抗炎药、透明质酸钠、基质金属蛋白酶抑制剂或联合用药等药物治疗,或采用针灸推拿、正骨治疗等非药物治疗。但以上治疗只能缓解骨关节炎患者临床症状,延缓病情进展,不能完全根治1 1。因此,寻找有效治疗骨关节炎的新药物具有重要的临床意义。桃叶珊瑚苷具有广泛的药理学活性。研究1 2发现,桃叶珊瑚苷通过抑制心肌细胞凋亡发挥抗心肌缺血损伤的作用,从而改善急性心肌梗死小鼠心功能障碍。梅凡等1 3研究表明,桃叶珊瑚苷可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。但关于桃叶珊瑚苷能否通过调节软骨细胞自噬改善KOA的相关报道较少,因此本研究探讨桃叶珊瑚苷对KOA小鼠的作用及机制。本研究结果显示,KOA小鼠膝关节软骨表面粗糙,细胞结构层次混乱、数量减少,潮线排列破坏严重。桃叶珊瑚苷组小鼠膝关节软骨组织病变程度明显改善。模型组小鼠M a n k i n评分高于正常对照组,桃叶珊瑚苷组小鼠评分低于模型组。KOA患者常存在炎症反应损伤1 4。因此,本研究检测了软骨组织炎症因子水平,结果显示桃叶珊瑚苷可降低软骨组织中I L-6、I L-1和T N F-水平。以上结果表明桃叶珊瑚苷可保护KOA小鼠软骨退变,降低膝关节炎症反应