塔里木河淤泥小单孢菌抗生素合成基因筛选及抑菌活性初探.pdf

第35卷 第 2期2023年6月塔里木大学学报Journal of Tarim UniversityVol.35 No.2Jun.2023文章编号：1009-0568（2023）02-0013-10塔里木河淤泥小单孢菌抗生素合成基因筛选及抑菌活性初探高帅，刘占文，骆新荣，万传星，张利莉*（塔里木大学生命科学与技术学院/塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，新疆 阿拉尔 843300）摘要本研究以分离自塔里木河淤泥的31株小单孢菌（分属于14个种）为研究对象，检测菌株所具有的大环内酯类抗生素、安莎类抗生素合成过程中的关键酶基因；选用4种培养基进行小单孢菌小量发酵，经80%甲醇萃取，浓缩发酵液；以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及解淀粉欧文氏菌为靶标菌，采用滤纸片法进行抑菌活性检测；对具有抑菌活性的菌株发酵产物做高效液相色谱(HPLC)检测分析。结果表明31株小单孢菌中24株含有PKS-I基因，15株含有AHBA基因；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及解淀粉欧文氏菌有拮抗活性的分别有3株、3株、6株以及14株菌；13株菌同时具有抗生素合成关键酶基因和抑菌活性。青铜小单孢菌（TRM99160）、土壤小单孢菌（TRM99303）、绛红产色小单孢菌（TRM99166）和碳样小单孢菌（TRM99551）菌株的发酵产物具有广谱抑菌活性，可用于深入挖掘次级代谢产物。综上，塔里木河淤泥小单孢菌具有拮抗多种病原菌活性及抗生素生物合成潜力，值得深入挖掘次级代谢产物。关键词塔里木河淤泥；小单孢菌；基因筛选；抑菌活性中图分类号：Q939.92文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2023.02.002Screening of antibiotic synthesis genes and exploring antimicrobialactivity of Micromonospora from Tarim River sedimentGAO Shuai，LIU Zhanwen，LUO Xinrong，WAN Chuanxing，ZHANG Lili*(College of Life Science and Technology,Tarim University/State Key Laboratory Breeding Base for The Protection andUtilization of Biological Resources in Tarim Basin Co-funded by Xinjiang Production&Construction Corps and TheMinistry of Science&Technology,Alar,Xinjiang 843300)AbstractIn this study,31 strains of 14 species of Micromonospora isolated from the sediment of Tarim River were selected as theresearch material.The key enzyme genes in the synthesis process of macrolides antibiotics and ansamycins antibiotics of the strainswere detected by PCR,and four media were used for small-batch fermentation.The fermentation products were extracted and con-centrated with 80%methanol.Using Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Candida albicans and Erwinia amylovora as targets,the antibacterial activity of crude extracts was detected by the filter paper method.Besides,the fermentation products of the strainswith antibacterial activity were detected by high performance liquid chromatography(HPLC)detection.The results showed that 24收稿日期：2023-01-13基金项目：国家自然科学基金新疆联合基金重点项目“塔里木盆地放线菌资源代谢潜力的深度挖掘”（U1703236）；塔里木大学研究生科研创新项目“一株小单孢菌TRM99188次级代谢产物的深度挖掘”（TDGRI202104）第一作者：高帅（1997-），男，2020级在读硕士研究生，研究方向为放线菌次级代谢产物挖掘。E-mail：*通信作者：张利莉（1963-），女，博士，教授，研究方向为放线菌资源利用。E-mail：塔里木大学学报第35卷塔里木河是中国第一大内流河，其流域包括高山、沙漠、干旱等多种极端环境。特殊的环境赋予塔里木河多种微生物资源潜力1。放线菌是一类高(G+C)%含量的革兰氏阳性细菌，是天然产物的重要来源，70%的天然抗生素来自放线菌2。小单孢菌（Micromonospora）是稀有放线菌，在分类学上属于细菌域、放线菌门、放线菌纲、放线菌目、小单孢菌亚目、小单孢菌科、小单孢菌属3。从放线菌所分离的天然产物中，小单孢菌所产生的天然产物占比14%，数量仅次于链霉菌（26.5%），位居稀有放线菌的首位4。小单孢菌所产生的抗生素主要是聚酮类抗生素，包括大环内酯类和安莎类抗生素。大环内酯类化合物是由I型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS-I)催化小分子羧酸通过连续脱羧缩合反应形成内酯环母核，并在环上通过糖苷键附着一个或多个脱氧糖或氨基糖残基，该类化合物具有很好的抑菌、抗肿瘤和抗寄生虫等生物活性，如红霉素、罗沙米星、卤霉素等5-6。安莎类抗生素是PKS-I催化合成的一类重要化合物，以 3-氨基-5-羟基苯甲酸（3-amino-5-hy-droxybenzoic acid，AHBA）为起始单元，并以一个芳香核和连接芳香核两个不相邻位置的脂肪链组成，最终形成大环内酰胺。该类化合物以利福霉素为代表，具有良好的抗菌、抗肿瘤等生物活性7-9。小单孢菌产生的抗生素在生物医学、生物防治方面有很大的应用前景，为人类健康发挥了重要作用10。抗生素生物合成关键酶基因筛选能够提高人们发现抗生素的效率，也是快速发现新型化合物的方法11-12。本研究以分离自塔里木河淤泥的31株小单孢菌（分属于14个种）为研究对象，利用抗生素合成关键酶基因筛选具有抗生素合成潜力的菌株，同时结合抑菌活性和高效液相色谱（HPLC）对其代谢潜力进行进一步探索，为丰富塔里木盆地功能菌株资源及抗生素挖掘提供菌株支持。1材料和方法1.1实验材料1.1.1菌株来源从来自塔里木河阿拉尔域流段（4053N，8128 E）淤泥中分离的放线菌547株，保存于甘油管中（-20）。靶标菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538，白色念珠菌(C.albicans)ATCC 64550，解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)ATCC 15580以及大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922，以上菌株均由塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地提供。1.1.2培养基ISP2培养基：酵母提取物4.0 g，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，琼脂粉16.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.27.4。一号培养基：葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉10.0 g，酵母膏 5.0 g，豆粕粉 15.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，碳酸钙5.0 g，硫酸镁 0.5 g，氯化钠 1.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH7.27.4。二号培养基：葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉10.0 g，蛋白胨 5.0 g，玉米浆 20.0 g，磷酸氢二钾 0.5 g，碳酸钙3.0 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸亚铁0.1 g，蒸馏水1 L，pH 7.27.4。AM6培养基：葡萄糖10.0 g，可溶性淀粉20.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母浸膏 5.0 g，碳酸钙 5.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.27.4。YMG 培养基：酵母提取物 4.0 g，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，琼脂粉16.0 g，蒸馏水1.0 L，pH7.27.4。MHA培养基：酸水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉2.0 g，牛肉提取物2.0 g，琼脂粉16.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.27.4。SDA培养基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂Micromonospora strains contained PKS-I gene,15 strains contained AHBA gene.There were 3 strains with antibacterial activitiesagainst S.aureus,3 strains against E.coli,6 strains against C.albicans,and 14 strains against E.amylovora,respectively.13 strainshad both key enzyme genes for antibiotic synthesis and antibacterial activity.Micromonospora chalcea TRM99160,Micromonospo-ra soli TRM99303,Micromonospora purpureochromogenes TRM99166 and Micromonospora carbonacea TRM99551 showed anti-bacterial activity against two or more pathogens,which could be used for further exploration of secondary metabolites.In summary,Micromonospora from Tarim River sediment has excellent antibacterial activity and antibiotic biosynthesis potential,which is wor-thy of further exploration of secondary metabolites.KeywordsTarim River sedimen;Micromonospora;genetic screening;antimicrobial activity14第 2期粉16.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.27.4。其中 ISP2 培养基用于小单孢菌的活化继代。MHA培养基用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、解淀粉欧文氏菌的生长，SDA培养基用于白色念珠菌的生长。一号培养基、二号培养基、AM6 培养基和YMG固体培养基是基于文献设计用于小单孢菌发酵生产聚酮类和安莎类化合物的培养基。1.1.3主要试剂及仪器仪器：PCR 仪（Lab Cycler Standard，SENSO，德国）；恒温培养振荡器（智诚仪器，上海）；凝胶成像仪（ChemDoc XRS+，伯乐公司，美国）；高压灭菌器（BXM-150M，博迅，上海）；高效液相色谱仪（LC-20AT，岛津，日本）；真空冷冻干燥机（博医康实验仪器，北京）；超净工作台（SW-CJ-2F，博迅，上海）等；试剂：甲醇为色谱纯（安徽时联公司），其他试剂均为国产分析纯。1.2实验方法1.2.1放线菌物种鉴定采用SDS法提取放线菌基因组DNA 13，以细菌通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3,1492R：5-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3）对 16S rRNA基因进行PCR扩增，PCR反应条件：94 预变性5 min；94 变性30 s，56 退火30 s，72 延伸90 s，循环30次；72 充分延伸10 min，4 保存备用；目的条带为1 500 bp。扩增后的产物送至北京擎科生物科技有限公司（上海）测序，所得序列在 EzBiocloud（https:/）上进行比对，确定菌株的种属信息。利用软件MEGA 7对16S rRNA基因序列采用邻近法（Neighbour-joining）构建系统发育进化树。1.2.2抗生素合成关键酶基因筛选以基因组DNA作为模板扩增大环内酯类抗生素合成所需I型聚酮合酶（PKS-I）基因14（引物K1F：5-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3，M6R：5-CGCAG-GTTSCSGTACCAG-3）。PCR扩增体系：DNA 1 L，10 mol/L引物 K1F和 M6R各 0.5 L，10PCR缓冲液 2.5 L，10 mol/L dNTPs 1 L，Taq DNA 聚合酶0.2 L，DMSO 2.5 L，水补足至 25 L。扩增程序：95 预变性5 min；95 变性40 s，55 退火2 min，72 延伸4 min，循环35次；72 充分延伸10 min，4 保存备用；目的条带为1 2001 400 bp。扩增安莎类抗生素合成所需3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶（AHBA）基因15（引物 A1：5-AGAGGAT-CCTTCGAGCRSGAGTTCGC-3，引物A2：5-GCAG-GATCCGGAMCATSGCCATGTAG-3）。PCR扩增体系：DNA 1 L，10 mol/L 引物 A1 和 A2 各 0.5 L，10PCR 缓冲液 2 L，10 mol/L dNTPs 1 L，TaqDNA聚合酶0.2 L，DMSO 1.2 L，水补足至20 L。扩增程序：95 预变性10 min；95 变性30 s，58 退火30 s，72 延伸90 s，循环35次；72 充分延伸5 min，4 保存；目的条带为755 bp。PCR产物经电泳检测并纯化后，送至北京擎科生物科技有限公司（上海）测序，所得序列进行 BLAST 分析(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov)。1.2.3菌株发酵及粗提物制备采用ISP2培养基活化菌株，倒置于37 恒温培养箱中培养57 d。使用打孔器在生长良好的小单孢菌平板上打孔，分别挑取35个菌饼于200 mL发酵培养基中，置于28 摇床，120 r/min培养7 d。使用真空冷冻抽干机抽干水分，干燥后使用80%甲醇超声萃取3次，收集萃取液，减压浓缩后放置于小瓶中备用。配制YMG固体培养基，将种子液均匀涂布在培养基表面，每株菌涂布5个平板，倒置于37 恒温培养箱中发酵 10 d。发酵结束后切碎培养基，使用80%的甲醇超声萃取3次，过滤收集萃取液，减压浓缩后的浸膏备用。1.2.4抑菌活性筛选和HPLC检测采用滤纸片法检测各小单孢菌发酵粗提物对病原菌的抑制作用16。取200 L病原菌菌悬液涂布于MHA、SDA固体平板培养基上备用。称取0.1 g粗提物浸膏加入1 mL甲醇溶解，并取10 L滴加在6 mm无菌滤纸片上，均匀放置于各病原菌平板上，以甲醇为空白对照，每个发酵粗提物做3次平行实验。将细菌病原菌放入 37 培养箱培养，真菌病原菌放入28 培养箱培养，24 h后观察结果，并测量抑菌圈直径。将具有抑菌活性的粗提物浸膏用2 mL纯甲醇溶解，经 HPLC检测分析。HPLC条件，色谱柱：Shim-pack GIST C18 5 m(4.6 mm250 mm)，流动相A：纯净水，流动相B：甲醇，流速1 mL/min，柱温箱40，波长190800 nm，检测条件：10%100%甲醇40 min，100%甲醇10 min，进样量10 L。2结果与分析2.1塔里木河淤泥小单孢菌种类鉴定从塔里木河淤泥中共分离到的547株放线菌，经高帅 等：塔里木河淤泥小单孢菌抗生素合成基因筛选及抑菌活性初探15塔里木大学学报第35卷16S rRNA基因序列比对，获得31株小单孢菌，分属于14个种（图1）。其中，柠檬小单孢菌(M.citrea)10株、旱稻小单孢菌(M.oryzae)5株、海胆棕色小单孢菌(M.echinofusca)2株、绛红产色小单孢菌(M.pur-pureochromogenes)2株、紫娇花小单孢菌(M.tulbaghiae)2株、河流小单孢菌(M.fluminis)2株、安达曼海小单孢菌(M.andamanensis)1 株、橙色小单孢菌(M.au-rantiaca)1株、碳样小单孢菌(M.carbonacea)1株、青铜小单孢菌(M.chalcea)1株、棘孢小单孢菌(M.echi-nospora)1株、碧蝽小单孢菌(M.palomenae)1株、土壤小单孢菌(M.soli)1株、蒲公英小单孢菌(M.taraxa-ci)1株。小单孢菌的生长，除了需要足够的营养外，还需要适宜的温度、氧浓度、压力等环境因素。在所有已发表的小单孢菌物种中，土壤环境和水体环境是小单孢菌的主要分离来源17-18。由此可见，塔里木河淤泥适合小单孢菌的生长，蕴含着丰富的小单孢菌资源。图1基于16S rRNA基因序列构建的31株小单孢菌的Neighbour-joining系统发育树16第 2期2.2不同培养基对小单孢菌发酵产物的抑菌活性和HPLC谱图的影响青铜小单孢菌(M.chalcea)是小单孢菌属的模式菌 种。采 用 一 号 培 养 基 发 酵 的 青 铜 小 单 孢 菌TRM99160发酵产物对大肠杆菌、白色念珠菌、解淀粉欧文氏菌均有拮抗活性，但使用二号、AM6、YMG3种培养基发酵产物无拮抗活性（表1）。HPLC检测也显示青铜小单孢菌(TRM99160)在4种培养基中具有不同的代谢产物（图2）。这表明不同的培养基成分可能激活了菌株中不同的沉默基因簇，从而产生了不同的次级代谢产物，使菌株表现出不同的抑菌活性。表1青铜小单孢菌TRM99160发酵产物抑菌活性检测培养基种类一号培养基二号培养基YMG培养基AM6培养基靶标菌大肠杆菌(E.coli)+-金黄色葡萄球菌(S.aureus)-白色念珠菌(C.albicans)+-解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)+-注：“+”表示有抑菌活性，“-”表示无抑菌活性；下表同。探索菌株的拮抗活性要选用不同培养基。4种培养基中，使用一号培养基产生的次级代谢产物所表现出的抑菌效果最好，HPLC谱图检测也显示出丰富的次级代谢产物，说明采用一号培养基挖掘青铜小单孢菌TRM99160的活性物质具有很大的潜能。二号培养基及AM6培养基虽然对4种病原菌没有表现出活性，但在HPLC检测中也显示出了丰富的次级代谢产物，或许扩大靶标菌的检测范围并结合其他检测方法可以分析出该培养基的代谢潜能。菌株 TRM99160 使用YMG培养基发酵未表现出拮抗活性，同时在HPLC检测中254 nm波长无吸收峰，在进一步挖掘该菌株的活性物质时可以放弃YMG培养基。图2青铜小单孢菌TRM99160发酵产物HPLC检测2.3同一物种小单孢菌的抑菌活性和HPLC谱图比较研究采用一号培养基对10株柠檬小单孢菌进行发酵，发酵产物表现出不同的抑菌活性和HPLC谱图（表2、图 3）。对 白 色 念 珠 菌 有 拮 抗 活 性 的 菌 株 仅 有TRM99112，对解淀粉欧文氏菌有拮抗活性的菌株仅有TRM99114、TRM99471，其他菌株对这2种病原菌均无抑菌活性。HPLC谱图显示TRM99112具有2个明显不同于其他柠檬小单孢菌的特征峰，这2个峰代表 的 产 物 可 能 对 白 色 念 珠 菌 具 有 抑 菌 活 性。TRM99114与TRM99471的HPLC谱图有相似之处，可能是因为这些菌株产生了相同类型的次级代谢产高帅 等：塔里木河淤泥小单孢菌抗生素合成基因筛选及抑菌活性初探17塔里木大学学报第35卷物，而这类产物很可能对革兰阴性菌解淀粉欧文氏菌具有抑菌活性。其他无拮抗活性的柠檬小单孢菌的谱图有类似的特征吸收峰。同一种属的不同菌株产生了不同的抑菌活性及不同的代谢HPLC谱图，说明代谢产物具有菌株特异性，而不具有种属特异性。其原因可能是16S rRNA基因分类的局限性造成的，16S rRNA基因并不能代表菌株的其他基因，例如次级代谢产物合成基因。表210株柠檬小单孢菌抑菌活性检测序号12345678910菌株TRM99114TRM99471TRM99112TRM99127TRM99161TRM99184TRM99185TRM99284TRM99285TRM99544靶标菌大肠杆菌(E.coli)-金黄色葡萄球菌(S.aureus)-白色念珠菌(C.albicans)-+-解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)+-图310株柠檬小单孢菌发酵产物HPLC检测18第 2期2.431株小单孢菌功能基因筛选与抑菌活性筛选通过对31株小单孢菌进行基因筛选和抑菌活性筛选。结果表明（表3）PKS-I基因扩增阳性的菌株有24株，阳性率达77%；AHBA基因扩增阳性的菌株有15株，阳性率达48.4%。不同菌种之间基因筛选结果有差异。如橙色小单孢菌(TRM99415)、碳样小单孢菌(TRM99551)、青铜小单孢菌(TRM99160)同时含有PKS-I和AHBA基因；安达曼海小单孢菌(TRM99403)、旱稻小单孢菌(TRM99089)等只含有 PKS-I基因；绛红产色小单孢菌(TRM99166)、蒲公英小单孢菌(TRM99316)、紫娇花小单孢菌(TRM99305)等均不含PKS-I和AHBA基因。相同菌种的不同菌株之间也有差异。如柠檬小单孢菌中的 TRM99471 同时含有 PKS-I 和 AHBA，TRM99161仅含PKS-I，TRM99112两者均无；旱稻小单孢菌 TRM99191 与 TRM99146、紫娇花小单孢菌TRM99172与TRM99305，他们之间的基因筛选结果不同。这表明小单孢菌菌株特异性的存在，不同的菌种或同菌种的不同菌株可能具有不同的抗生素合成基因。表331株小单孢菌PKS-I、AHBA基因筛选和一号培养基发酵产物对各病原菌的抑菌活性筛选1234567891011121314151617181920212223TRM99403TRM99415TRM99551TRM99160TRM99112TRM99114TRM99127TRM99161TRM99184TRM99185TRM99284TRM99285TRM99471TRM99544TRM99311TRM99063TRM99167TRM99188TRM99194TRM99089TRM99107TRM99146TRM99169安达曼海小单孢菌(M.andamanensis)橙色小单孢菌(M.aurantiaca)碳样小单孢菌(M.carbonacea)青铜小单孢菌(M.chalcea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)柠檬小单孢菌(M.citrea)海胆棕色小单孢菌(M.echinofusca)海胆棕色小单孢菌(M.echinofusca)棘孢小单孢菌(M.echinospora)河流小单孢菌(M.fluminis)河流小单孢菌(M.fluminis)旱稻小单孢菌(M.oryzae)旱稻小单孢菌(M.oryzae)旱稻小单孢菌(M.oryzae)旱稻小单孢菌(M.oryzae)+-+-+-+-+-+-+-+-7.790.38-8.281.25-8.821.10-8.111.08-8.911.848.231.127.790.17-8.070.307.270.29-9.642.528.661.10-12.423.38-8.671.29-7.741.399.622.4410.720.3211.400.98-序号菌株菌种基因筛选PKS-I AHBA一号培养基发酵产物抑菌圈直径/mmabcd高帅 等：塔里木河淤泥小单孢菌抗生素合成基因筛选及抑菌活性初探19塔里木大学学报第35卷2425262728293031TRM99191TRM99333TRM99166TRM99306TRM99303TRM99316TRM99172TRM99305旱稻小单孢菌(M.oryzae)碧蝽小单孢菌(M.palomenae)绛红产色小单孢菌(M.purpureochromogenes)绛红产色小单孢菌(M.purpureochromogenes)土壤小单孢菌(M.soli)蒲公英小单孢菌(M.taraxaci)紫娇花小单孢菌(M.tulbaghiae)紫娇花小单孢菌(M.tulbaghiae)+-+-+-+-7.120.54-8.111.08-9.963.04-6.140.59-6.520.438.220.518.230.54-6.940.73-7.971.24序号菌株菌种基因筛选PKS-I AHBA一号培养基发酵产物抑菌圈直径/mmabcd注：“+”表示基因筛选阳性，“-”表示基因筛选阴性或无抑菌活性；a表示大肠杆菌；b表示金黄色葡萄球菌；c表示白色念珠菌；d表示解淀粉欧文氏菌。使用一号培养基发酵，31株菌中有17株菌表现出了抑菌活性（54.8%），对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及解淀粉欧文氏菌有拮抗活性的分别有3株、3株、6株以及14株菌。其中碳样小单孢菌(TRM99551)、青铜小单孢菌(TRM99160)、旱稻小单孢菌(TRM99089)、绛红产色小单孢菌(TRM99166)、土壤小单孢菌(TRM99303)5株菌表现出了对2种以上病原 菌 的 拮 抗 活 性，并 且 TRM99551、TRM99160、TRM99166 以及 TRM99303 对 3 种不同病原菌具有拮抗活性。碳样小单孢菌(TRM99551)和绛红产色小单孢菌(TRM99166)2 株菌具有广谱抑菌活性，其发酵产物对G+、G-和真菌病原菌均有拮抗活性。能够拮抗解淀粉欧文氏菌的小单孢菌株数量最多，表明小单孢菌可能产生了抑制该病原菌的代谢产物，大部分塔里木河淤泥小单孢菌具有产生活性次级代谢产物的潜能。通过基因筛选和抑菌活性筛选，发现安达曼海小单孢菌(TRM99403)、橙色小单孢菌(TRM99415)、旱稻小单孢菌(TRM99089)、青铜小单孢菌(TRM99160)等13株菌同时具有PKS-I（或AHBA）基因和抑菌活性。但抗生素合成基因PKS-I和AHBA的筛选结果和抑菌活性筛选结果并不能一一对应，如碳样小单孢菌(TRM99551)同时具有2种抗生素合成基因，也具有广泛的抑菌活性；而绛红产色小单孢菌(TRM99166)不具有 2种基因，但其发酵产物却具有广谱抑菌活性。原因可能是该种小单孢菌次级代谢产物丰富，在当前的4种发酵培养基条件下，并未激活可以产生这2种基因的基因簇，而是产生了由其他基因控制的活性产物；棘孢小单孢菌(TRM99167)同时具有PKS-I和AHBA 2种抗生素合成基因，但并未表现出拮抗活性，可能有以下两种原因：一是该菌株产生了拮抗活性物质，但对本研究所选用的 4种病原菌无拮抗活性；二是该菌株产生了具有拮抗活性的次级代谢产物，但生产量较少，不足以表现出抑菌活性，可以扩大培养或者通过基因工程手段提高其产量，为进一步挖掘其活性物质奠定基础。3讨论解淀粉欧文氏菌可引发苹果、梨等蔷薇科植物火疫病，对农业生产和新疆水果进出口贸易造成较大危害19。防治植物火疫病的方式主要是施加药品，如硫酸铝、硫酸铜、氢氧化铜等无机化合物或使用抗生素如链霉素、春雷霉素。链霉素防治果树火疫病效果较好，但大量使用链霉素会引发细菌耐药性，使防治效果大大降低。现在迫切需要新型抗生素防治果树火疫病的发生。本研究中塔里木河淤泥小单孢菌对解淀粉欧文氏菌拮抗能力强、拮抗菌株占比数量多，表明塔里木河淤泥小单孢菌可作为潜在的防治果树火疫病的菌种资源。通过对分离自塔里木河淤泥的31株小单孢菌的抑菌活性检测、HPLC分析，菌株表现出同种不同功能的现象，如10株柠檬小单孢菌表现出不同的抑菌续表320第 2期活性、功能酶基因以及HPLC谱图，这很大程度上可能与16S rRNA基因鉴定的分辨率有关。16S rRNA基因在原核生物分布广、结构稳定、保守性高、数据库相对完善，是细菌分子鉴定最常用的系统进化标记分子20-21，但其多拷贝基因间存在的异质性导致其在原核生物的多样性分析上具有一定的局限性和偏离性22。尤其是对于一些较相近的物种而言，16S rRNA基因的种间变异度小，很难进行有效的物种鉴定23-24。而gyrB、ropB等以单拷贝的形式存在的管家基因碱基替换率比16S rRNA更高，多数编码与核心代谢相关的功能蛋白，稳定并广泛地存在于待测菌株中25。结合对31株小单孢菌的gyrB、ropB等管家基因进行种水平的分析，或许能够进一步鉴别进化关系较为接近的物种，对于功能菌株的生物活性的筛选提供一定的参考。同一菌株在不同培养基条件下表现出不同活性，这说明改变培养基使菌株产生了不同的次级代谢产物。菌株次级代谢途径的表达受到精密而复杂的代谢调控网络的控制，碳、氮源的改变，甚至培养条件中微小的变化，都会导致代谢途径发生巨大的改变，从而产生不同的次级代谢产物26。传统的培养方法通常受限于代谢途径的不完全表达，导致已知化合物不断的被再分离27。改变培养基成分结合活性筛选可以快速地鉴别是否产生活性化合物，再结合HPLC检测可以进一步判断在不同培养条件下是否产生了不同种类的化合物，从而为新药物的发现提供线索。本研究还发现抗生素合成关键酶基因筛选和抑菌活性筛选并不能一一对应。如绛红产色小单孢菌(TRM99166)，没有PKS-I和AHBA基因，但仍有拮抗金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及解淀粉欧文氏菌的广谱抑菌活性，可能是因为产生了其他类型活性次级代谢产物，可进一步结合微生物基因组学28、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）、二维核磁检测29等方式判断次级代谢产物的种类及性质。4结论本研究采用功能酶基因筛选、抑菌活性筛选、HPLC化学检测，对来源于塔里木河淤泥的31株菌小单孢菌（分属于14个种）进行代谢潜力的初步探索。发现31株小单孢菌种中24株小单孢菌含有PKS-I基因，15株含有AHBA基因；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、解淀粉欧文氏菌有拮抗活性的分别有3株、3株、6株、14株菌；13株菌同时具有抗生素合成关键酶基因和抑菌活性。青铜小单孢菌(TRM99160)、土 壤 小 单 孢 菌(TRM99303)、绛 红 产 色 小 单 孢 菌(TRM99166)和碳样小单孢菌(TRM99551)等菌株的发酵产物具有广谱抑菌活性，值得深入挖掘次级代谢产物。塔里木河淤泥小单孢菌具有优良的代谢潜力，可作为抗生素挖掘的优质菌种资源。参考文献1 KOCHHAR N，KAVYA I K，SHRIVASTAVA S，et al Perspectives on the microorganism of extreme environ-ments and their applications J/OL.Curr Res Microb Sci，2022，3：100134 2023-05-09.https:/ 李文均，焦建宇放线菌分类地位的变迁及其系统学研究最新进展 J 微生物学杂志，2020，40(1)：1-143 张学武，张建丽小单孢菌属的分类及应用研究 J 微生物学通报，2006，33(5)：117-1214 GENILLOUD OActinomycetes：still a source of novelantibiotics J Nat Prod Rep，2017，34(10)：1203-12325 庞子萱，吴季恒，严豪，等聚酮类化合物研究进展 J 食品与发酵工业，2022，48(6)：316-3266 VZQUEZ-LASLOP N，MANKIN A SHow macrolideantibiotics work J Trends Biochem Sci，2018，43(9)：668-6847 SKRZYPCZAK N，PRZYBYLSKI PModifications，bio-logical origin and antibacterial activity of naphthalenoidansamycins J Nat Prod Rep，2022，39(9)：1653-16778 YANG X C，WU W，LI H J，et alNatural occurrence，bioactivity，and biosynthesis of triene-ansamycins J/OL Eur J Med Chem，2022，244：114815 2023-05-09 https:/ 凡琴放线菌产安莎类和环醇类抗生素合成基因资源的挖掘 D 厦门：厦门大学，201410 QI S S，GUI M，LI H H，et 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