柿叶黄酮通过激活自噬与抗氧化应激协同作用改善NAFLD大鼠肝脏脂肪变性 (1).pdf

天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期柿叶黄酮通过激活自噬与抗氧化应激协同作用改善NAFLD大鼠肝脏脂肪变性王莲，肖继椿，田垚，李锡晶，王璐瑶，王岚，杨博涵，张荣泉摘要：目的探讨柿叶黄酮（PLF）对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠的改善作用及机制。方法将雄性SD大鼠采用高脂饮食喂养12周制备NAFLD大鼠模型。将建模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、水林佳组（28 mg/kg）、PLF组（200 mg/kg）及PLF+自噬抑制剂组（PLF+3-MA组，200 mg/kg PLF+2 mg/kg 3-MA），另取正常SD雄性大鼠为对照组，每组6只。给药6周后，苏木素-伊红（HE）染色观察肝组织病理学改变；计算肝指数；采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）；微量法测定肝脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；Western blot检测肝组织核转录因子E2相关因子2（Nrf2）、自噬蛋白Sequestosome-1/Protein 62（SQSTM-1/P62）、微管相关蛋白1轻链3-（LC3-）的表达。结果对照组大鼠肝细胞形态未见明显异常，模型组肝脏细胞出现脂肪空泡和炎症反应。与对照组相比，模型组大鼠的肝指数、TC、TG、LDL-C、ALT、AST以及MDA水平均升高，P62蛋白表达增加，HDL-C和SOD水平降低，Nrf2、LC3-蛋白表达降低（P0.05）。与模型组相比，水林佳组、PLF组大鼠的脂肪空泡和炎症反应明显改善，肝指数、TC、TG、LDL-C、ALT、AST和MDA水平均降低，P62蛋白表达降低，SOD水平升高，Nrf2、LC3-蛋白表达升高（P0.05）。而PLF+3-MA组对大鼠血脂水平、SOD和MDA指标以及标志性蛋白的改善作用均低于PLF组。结论PLF可通过激活自噬与抗氧化应激的协同作用对NAFLD大鼠肝脏产生保护效应。关键词：黄酮类；非酒精性脂肪性肝病；自噬；氧化性应激；柿叶黄酮中图分类号：R575.5文献标志码：ADOI：10.11958/20230145Study of persimmon leaf flavonoids ameliorates liver steatosis by activating autophagy andantioxidant stress in NAFLD ratsWANG Lian,XIAO Jichun,TIAN Yao,LI Xijing,WANG Luyao,WANG Lan,YANG Bohan,ZHANG RongquanTianjin Institute of Pharmaceutical and Medical Science,Tianjin 300020,ChinaCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of persimmon leaf flavonoids(PLF)on nonalcoholicfatty liver disease(NAFLD)in rats.MethodsMale SD rats were fed the high-fat diet for 12 weeks to prepare a NAFLD ratmodel.The model rats were randomly divided into the model group,the shuilinjia group(28 mg/kg),the PLF group(200 mg/kg)and the PLF+autophagy inhibitor group(PLF+3-MA group,200 mg/kg PLF+2 mg/kg 3-MA).Another normal SD male ratswere selected as the control group,with 6 rats in each group.After treatment for 6 weeks,Hematoxylin-eosin(HE)stainingwas used to observe changes of liver morphology and pathology.The liver index was calculated.Total cholesterol(TC),triacylglycerol(TG),high density lipoprotein cholesterol(HDL-C),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C),alanineaminotransferase(ALT),and aspartate aminotransferase(AST)in serum were detected by automatic biochemical analyzer.The contents of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in liver tissue were determined withmicrocalorimetric method.Western blot assay was performed to detect expression levels of nuclear factor erythroid 2 relatedfactor 2(Nrf2),autophagy protein sequencosome-1/protein 62(SQSTM-1/P62)and microtubule associated protein 1 lightchain 3-(LC3-).ResultsIn the control group,there was no significant abnormality in the morphology of hepatocytes,while in the model group,there were fat vacuoles and inflammation in liver cells.Compared with the control group,the liverindex,levels of TC,TG,LDL-C,ALT,AST and MDA were increased in the model group,and the expression level of P62increased,while levels of HDL-C and SOD were decreased,expression levels of Nrf2 and LC3-decreased(P0.05).Compared with the model group,the fat vacuoles and inflammation were significantly improved in the shuilinjia group andthe PLF group.The liver index,levels of TC,TG,LDL-C,ALT,AST and MDA were decreased in the shuilinjia group andthe PLF group,and the expression level of P62 decreased,while the level of SOD was increased,expression levels of Nrf2基金项目：天津市卫生健康委员会天津市中医药管理局中医中西医结合科研课题（2021164，2021166）作者单位：天津市医药科学研究所（邮编300020）作者简介：王莲（1982），女，助理研究员，主要从事天然产物的提取分离与药理作用机制方面研究。E-mail：通信作者E-mail：实验研究1211Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是全球流行的慢性肝病，随着人们饮食结构和生活方式的改变，其患病率逐年增高，全球的患病率高达 17%33%1，高风险人群可达25%40%2。该病是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征3-4；病程包括肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞肝癌5-6；病因机制复杂，涉及胰岛素抵抗、内质网应激、氧化应激、自噬等多个因素。近年的研究表明，自噬与氧化应激关系密切，极有可能是通过自噬受体蛋白Sequestosome-1/Protein62（SQSTM-1/P62）相关联，刺激释放核转录因子E2相关因子2（Nrf2），激活下游基因表达，提高肝细胞抗氧化应激能力7；两者作为人体2个主要细胞防御机制，是NAFLD发病的重要因素，也是改善NAFLD的潜在治疗靶点。柿叶黄酮（persimmon leafflavonoids，PLF）是柿叶提取物中的主要活性成分，具有抗氧化8、抗炎9、降血脂10、降血糖、保护肝脏11等多种药理作用。本实验旨在研究PLF是否通过激活自噬与抗氧化应激的协同作用促进NAFLD大鼠抗氧化能力，从而对肝脏起到保护作用。1材料与方法1.1实验动物SPF级SD雄性大鼠34只，67周龄，体质量90110 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。于天津市医药科学研究所实验动物中心SPF级环境内饲养，温度2025，相对湿度40%70%，光照/黑暗12 h交替。1.2试剂与仪器PLF、高脂饲料（配方为基础饲料88%、猪油10%、胆固醇2%）由天津市医药科学研究所天然产物与功能性食品研究室提供；水飞蓟宾胶囊（水林佳，35 mg/粒，国药准字H20040299）购自天津天士力圣特制药有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、RIPA蛋白裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），兔源微 管 相 关 蛋 白 1 轻 链 3-（LC3-）、Nrf2 一 抗 购 于Immunoway公司；P62抗体、山羊抗兔二抗购于Boster公司；-actin抗体购于CST公司。TOSHIBATBA40-FR全自动生化分析仪购于日本东芝公司；Mini-protean Tetra System电泳仪购于美国Bio-Rad公司；LAS500凝胶成像发光一体机购于美国GE公司；Eclipse Ci-L显微镜、NIS-BRML图像分析系统购于日本尼康公司；EG1150H自动生物组织包埋机购于德国徕卡公司。1.3研究方法1.3.1PLF的制备以河北产干燥柿叶为原料，使用70%乙醇回流提取3次，过滤。在滤液中加入20%NaOH至pH值为910，以石油醚反复萃取后，向水相中加入15%HCl调至pH值为56，以乙酸乙酯反复萃取，收集乙酸乙酯浓缩干燥，得PLF粗样品。以芦丁为对照品，使用紫外分光光度法检测样品中PLF含量为30%。1.3.2造模、分组及给药SD大鼠于实验开始前1周置于实验环境中，自由进食进水，自然昼夜节律。将大鼠按随机数字表法分为对照组（8只）和造模组（26只），对照组予基础饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养，连续12周，期间无死亡。在12周末从对照组和造模组中各随机取2只大鼠麻醉处死，检测血清肝功能。取肝脏组织，苏木素-伊红（HE）染色后进行组织病理学观察，当造模组丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）明显升高，且肝组织呈现明显脂肪空泡时，可确定模型建立成功。将造模成功的24只大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性药物对照组（水林佳组）、PLF干预组（PLF组）、PLF+自噬抑制剂组（PLF+3-MA组），每组6只。对照组和模型组给予PBS灌胃；水林佳组给予28 mg/kg水林佳灌胃12；PLF组给予PLF 200 mg/kg灌胃13；PLF+3-MA组给予PLF 200 mg/kg灌胃及2 mg/kg3-MA腹腔注射14。以上各组均每日给药1次，干预6周，给药结束后再按照实验路线图对相关检测指标进行测定，见图1。1.3.3血脂水平检测于末次给药次日上午空腹取血，以3 000 r/min离心15 min，分离血清。使用全自动生化分析仪检测大鼠血清中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量。1.3.4肝组织病理学评价及肝功能检测称取大鼠体质量，解剖分离肝脏，滤纸吸净残余血液，称取肝质量，比较各组大鼠体质量和肝质量水平，计算肝指数（肝指数=肝质量/体质量100%）。取各组大鼠肝脏右叶组织，一部分于-80 冷冻保存，另一部分于4%中性甲醛固定后，经脱水、透明，石蜡包埋，切片、封片后，进行HE染色，于正置显微镜下观察肝组织病理学改变。使用全自动生化分析仪检测ALT和AST。1.3.5氧化应激指标检测称取适量大鼠肝脏右叶组织，按照质量体积比1 10加入提取液，进行冰浴匀浆，4、8 000 r/min离心10 min，取上清液。按照微量法试剂盒说明书检测肝脏组织氧化应激指标SOD和MDA含量。1.3.6Western blot检测肝组织Nrf2、P62、LC3-蛋白表达水平称取肝脏右叶组织，加入RIPA蛋白裂解液进行充分碾磨，4、12 000 r/min离心15 min，提取上清液制作蛋白样品，采用BCA法测定蛋白浓度。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，各组取等质量蛋白上样，进行电泳分离，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗稀释液（1 5 000），4 孵育过夜，TBST洗膜3次；加入二抗（1 5 000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次。and LC3-increased(P0.05).The improvement effect on blood lipid levels,SOD and MDA indicators,as well as markerproteins were lower in the PLF+3-MA group than those of the PLF group.ConclusionPLF has protective effect on liver ofNAFLD rats by activating autophagy and antioxidant stress.Key words:flavones;non-alcoholic fatty liver disease;autophagy;oxidative stress;persimmon leaf flavonoids1212天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期显影剂显影，采用凝胶成像仪分析系统半定量分析各蛋白表达量。1.4统计学方法采用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量数据以x s表示。组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1PLF对NAFLD大鼠血脂水平的影响与对照组相比，模型组大鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C水平降低（P0.05）；与模型组相比，PLF组和水林佳组 TC、TG、LDL-C 水平均降低（P0.05）；与PLF组相比，PLF+3-MA组对TC、TG、LDL-C 水平的降低作用均减弱（P0.05）；但 PLF 组、PLF+3-MA组和水林佳组均未能升高HDL-C水平，见表1。2.2PLF对肝组织病理学的影响肝脏形态观察显示，对照组肝脏颜色暗红，表面光滑完整，弹性好，边缘锐利；模型组肝脏呈现黄白色，表面粗糙，可见颗粒，弹性减弱，边缘钝；与模型组相比，水林佳组和PLF组肝脏颜色呈现暗红，表面粗糙感减弱，颗粒减少，形态明显得到改善；与PLF组相比，PLF+3-MA组肝脏呈暗红色，但颜色稍浅，表面颗粒较多，见图2。HE染色结果显示，对照组大鼠肝细胞大小均匀，肝细胞内无脂滴，形态未见明显异常；模型组肝脏细胞体积增大，胞质含脂滴，并形成空泡，局部汇管区或肝小叶见炎性细胞浸润；相比于模型组，PLF组、水林佳组的肝脏细胞明显减小，胞浆内脂肪空泡和脂滴数量减少，炎性细胞浸润情况改善明显；相比于PLF组，PLF+3-MA组细胞偏大，胞浆内脂肪空泡和脂滴数量较多，见图3。2.3PLF对肝功能的影响与对照组相比，模型组大鼠肝指数升高（P0.05）；与模型组相比，PLF组和水林佳组肝指数降低（P0.05）；但PLF+3-MA组与PLF组肝指数的测定结果相近。与对照组相比，模型组ALT、AST也明显增高（P0.05）；与模型组相比，PLF组、水林佳组的ALT、AST水平下降（P0.05）；且 PLF+3-MA 组对 AST 的降低作用要弱于PLF组（P0.05），见表2。2.4PLF对氧化应激水平的影响与对照组相比，模型组大鼠肝脏组织中的SOD水平降低，MDA水平升高（P0.05）；与模型组相比，PLF组和水林佳组均能明显升高SOD水平，降低MDA水平（P0.05）；与PLF组相比，PLF+3-MA组对SOD和MDA指标的改善作用均减弱（P0.05），见表3。2.5PLF对肝组织中Nrf2、P62、LC3-蛋白表达的影响与对照组相比，模型组P62蛋白表达增加，Nrf2和LC3-蛋白表达降低（P0.05）；与模型组Fig.1Experimental technology roadmap图1实验技术路线图组别对照组模型组水林佳组PLF组PLF+3-MA组FTC1.230.092.150.41a1.340.27b1.040.21b1.710.22d17.120TG0.340.080.520.11a0.300.04b0.220.06b0.340.08d11.963HDL-C0.540.060.380.04a0.310.02b0.310.03b0.320.0341.480LDL-C0.220.060.680.09a0.260.06b0.190.04bc0.290.04d67.921Tab.1Comparison of serum lipid indexes betweenfive groups表1各组大鼠血脂水平比较（n=6，mmol/L，x s）P0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与水林佳组比较，d与PLF组比较，P0.05；表24同。1213Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11相比，PLF组和水林佳组P62蛋白表达降低，Nrf2、LC3-蛋白表达升高（P0.05）；而 PLF+3-MA 组LC3-、Nrf2的蛋白表达低于PLF组，P62蛋白表达高于PLF组（P0.05），见图4、表4。对照组模型组水林佳组PLF组PLF+3-MA组Fig.2Anatomical morphology of liver in the five groups图2各组大鼠肝脏解剖形态对照组模型组水林佳组PLF组PLF+3-MA组Fig.3Pathological staining results of liver tissue in the five groups(HE staining,100)图3各组大鼠肝脏组织病理染色结果（HE染色，100）组别对照组模型组水林佳组PLF组PLF+3-MA组FALT/（U/L）54.483.5074.755.09a54.585.00b48.923.57bc51.723.4535.934AST/（U/L）119.7810.46176.8712.94a131.4210.60b102.1710.60bc140.4510.20d38.405肝指数/%2.640.314.480.83a2.720.29b2.690.36b2.730.1918.487Tab.2Comparison of ALT and AST contents in serumand liver index between five groups表2各组大鼠血清ALT、AST含量及肝指数比较（n=6，x s）Tab.3Comparison of SOD and MDA contents in livertissue between five groups表3各组大鼠肝脏组织中SOD和MDA含量比较（n=6，x s）组别对照组模型组水林佳组PLF组PLF+3-MA组FSOD/（U/g）106.919.5039.137.07a75.858.62b101.1710.22bc53.337.81d68.246MDA/（nmol/g）23.992.9998.339.76a36.345.76b31.685.45b44.106.43d126.744Fig.4The expression of autophagy and oxidative stress markersdetected by Western blot assay图4Western blot检测自噬、氧化应激标志蛋白的表达A：对照组；B：模型组；C：水林佳组；D：PLF组；E：PLF+3-MA组。Nrf2P62LC3-actinABCDE（n=6，x s）组别对照组模型组水林佳组PLF组PLF+3-MA组FNrf22.170.130.760.02a1.400.07b3.890.29bc1.470.05d407.064P620.870.062.850.18a1.240.08b1.030.08bc1.550.07d337.128LC3-1.950.151.030.09a1.650.06b1.660.08b1.230.12d77.051Tab.4Comparison of expression levels of Nrf2,P62 andLC3-between five groups表4各组大鼠Nrf2、P62和LC3-蛋白表达水平比较1214天津医药 2023 年 11 月第 51 卷第 11 期3讨论3.1以高脂饮食建立大鼠NAFLD模型NAFLD是全球流行的慢性肝病，发病率逐年上升。文献报道许多针对保肝护肝作用的研究多采用化学药物诱导的方法造模，虽具有造模速度快、成本低的特点8，11，但与NAFLD的发病机制并不吻合。本研究以高脂饮食喂养大鼠建立NAFLD模型，结果发现大鼠出现肥胖、脂质代谢紊乱、肝脏功能损伤等现象，显示造模成功。该模型更接近于因饮食摄入过多而引起的NAFLD表现，与人类的发病机制更为相似。3.2NAFLD的治疗现状现代医学对NAFLD的治疗以改善生活方式为主，包括调整饮食结构，运动疗法，给予胰岛素增敏剂、降脂药物及对症治疗等。目前尚无获批的特异性药物，临床上用到的治疗药物普遍以改善代谢为主，包括二甲双胍、噻唑烷二酮类、维生素E、人胰高血糖素样肽-1类似物，这些药物存在不良反应大、依从性差等缺点，效果不甚理想。而许多包括天然产物在内的营养制剂也表现出抑制NAFLD发生和相关并发症的作用15-16，且具有易于吸收、安全性高的优点17，因此很多学者致力于从天然产物去探寻NAFLD的有效治疗方法，故针对PLF治疗NAFLD的药效和机制研究十分必要。水林佳是水飞蓟宾与磷脂酞胆碱的复合制剂，可显著提高肝脏解毒功能，改善肝脏细胞水变性和脂肪变性，减少脂肪在肝脏内的沉积和浸润，从而减轻NAFLD的病理变化，因此选择该药作为本研究的阳性对照药品18。3.3NAFLD发病与氧化应激和自噬有关NAFLD发病机制复杂，存在“二次打击”、“三次打击”和“多重打击”多个学说，其病因涉及因素繁多，包括胰岛素抵抗、内质网应激、氧化应激、细胞凋亡与自噬、肠道微生物等，在遗传易感个体中，多个并行因素会产生协同作用，参与NAFLD的发生、发展。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，是目前公认的NAFLD发病机制之一。有研究表明，Nrf2是细胞抗氧化应激的中枢调节者，正常情况下，1分子Nrf2和2分子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）以非共价键的形式结合成二聚体存在于细胞浆中，当受到外界氧化应激因子刺激后，二者解离，Nrf2发生核异位，然后通过与抗氧化应激反应元件相互作用，诱导编码抗氧化蛋白和相解毒酶的表达，如谷氨酸合成酶、血红素氧合酶1等，产生相应的自身防御反应19。自噬是一种高度保守的细胞内降解过程，它通过选择性降解来调节肝细胞脂质的积累，在NAFLD过程中起保护作用20。抑制自噬会影响脂滴、受损的线粒体和有毒的蛋白质聚集体的降解，加重NAFLD 的发展。自噬和Keap1/Nrf2氧化应激信号通路关系密切，两者通过通路中的自噬受体蛋白P62相关联。P62是一个多功能蛋白质，自噬形成时，LC3-会酶解掉一小段多肽，转变为LC3-，P62作为自噬反应的底物参与自噬反应；而P62还可与Keap1结合，释放Nrf2，激活下游基因表达，提高肝细胞抗氧化应激能力。自噬和氧化应激作为人体2个主要细胞防御机制，是NAFLD发病过程中非常重要的因素，也是改善NAFLD的潜在治疗靶点。3.4PLF通过激活自噬与抗氧化应激的协同作用改善NAFLDPLF对高脂饮食诱导NAFLD大鼠的肝脏损伤具有明显的保护作用，能够有效降低血脂水平，作用效果与水林佳相近。在探讨 PLF 改善NAFLD的作用机制时发现，PLF可升高NAFLD大鼠肝脏组织中的SOD水平、降低MDA水平，有效降低大鼠体内氧自由基浓度，改善大鼠氧化应激状态。为进一步探讨PLF的具体作用机制，本实验中引入了自噬抑制剂3-MA，结果表明加入3-MA后，PLF降低血脂和改善氧化应激的作用均被削弱，提示PLF可能是通过激活自噬调节作用来改善NAFLD症状。Western blot结果显示，与对照组相比，模型组P62蛋白表达增加，LC3-蛋白表达降低，表明自噬反应受到抑制，同时Nrf2蛋白表达降低，则表明与之关联的Nrf2氧化应激通路受到抑制。给予PLF干预后，Nrf2和LC3-蛋白水平均升高，P62水平下降，表明PLF可促进大鼠自噬反应和抗氧化应激。一方面，P62与Keap1结合增加，释放的游离Nrf2增多，提高了抗氧化应激能力；另一方面，LC3-升高，自噬作用增强，P62作为自噬底物与其他降解蛋白结合，在自噬溶酶体中降解，P62水平下调。自噬抑制剂的加入不仅使自噬作用受到抑制，自噬标志性蛋白水平下降，而且使氧化应激标志物Nrf2蛋白水平也下调，抗氧化应激作用降低，这又进一步验证了PLF可通过自噬与抗氧化应激的协同作用促进大鼠抗氧化能力，从而对肝脏起到保护作用。综上所述，本研究证实了PLF对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝脏损伤具有保护作用，且可有效改善其脂质代谢过程，其机制可能与激活自噬和抗氧化应激的协同作用有关。这不仅为 PLF 作为NAFLD的治疗药物进行开发提供了理论基础，也为NAFLD 的临床治疗提供了新的实验思路和研究途径。1215Tianjin Med J,November 2023,Vol.51 No.11参考文献1 段琼，张紫行，徐娟，等.高尿酸血症与脂肪肝关联的前瞻性队列研究 J.中华疾病控制杂志，2022，26（12）：1420-1425，1432.DUAN Q，ZHANG Z X，XU J，et al.A prospective cohort study onthe relationship between hyperuricemia and fatty liverJ.Chin JDis Control Prev，2022，26（12）：1420-1425，1432.doi：10.16462/ki.zhjbkz.2022.12.010.2 HUANG T D，BEHARY J，ZEKRY A，et al.Non-alcoholic fattyliver disease：A review of epidemiology，risk factors，diagnosis andmanagementJ.Intern Med J，2020，50（9）：1038-1047.doi：10.1111/imj.14709.3 ESLAM M，NEWSOME P N，SARIN S K，et al.A new definition formetabolicdysfunction-associatedfattyliverdisease：Aninternational expert consensus statementJ.J Hepatol，2020，73（1）：202-209.doi：10.1016/j.jhep.2020.03.039.4 唐东晖，钟艳花.藿朴夏苓汤通过AMPK通路干预非酒精性脂肪肝病小鼠的作用机制研究 J.中药新药与临床药理，2020，31（7）：794-801.TANG D H，ZHONG Y H.The protective effect ofHuo Pu Xia Ling Tang on nonalcoholic fatty liver mice induced byhigh fat diet by regulating AMPK activityJ.Traditional ChineseDrug Research&Clinical Pharinacology，2020，31（7）：794-801.doi：10.19378/j.issn.1003-9783.2020.07.008.5 LINDENMEYER C C，MCCULLOUGH A J.The natural history ofnonalcoholic fatty liver disease-an evolving viewJ.Clin LiverDis，2018，22（1）：11-21.doi：10.1016/j.cld.2017.08.003.6 蔡江帆，陈民利.非酒精性脂肪肝炎动物模型的研究概况 J.中国实验动物学报，2021，29（1）：128-136.CAI J F，CHEN M L.Research progress on animal models of nonalcoholic steatohepatitisJ.Acta Lab Anim Sci Sin，2021，29（1）：128-136.doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2021.01.019.7 王雨露，许笑阳，俞晓菡，等.氧化应激与自噬在肝细胞癌发生发展中的作用 J.临床肝胆病杂志，2020，36（2）：426-429.WANG Y L，XU X Y，YU X H，et al.Role of oxidative stress andautophagy in the development and progression of hepatocellularcarcinoma J.J Clin Hepatol，2020，36（2）：426-429.doi：10.3969/j.issn.1001-5256.2020.02.042.8 李绍波，刘雪梅，毕倩宇，等.柿叶总黄酮对急性肝损伤小鼠肝组织的保护作用 J.西北药学杂志，2020，35（1）：72-76.LI S B，LIU X M，BI Q Y，et al.Protective effect of persimmon leaf totalflavonoidsonacuteliverinjuryinmice J.NorthwestPharmaceutical Journal，2020，35（1）：72-76.doi：10.3969/j.issn.1004-2407.2020.01.017.9 王翠荣，成芳梅，黄斌，等.柿叶水提取物对异烟肼和利福平联用所致小鼠肝损伤的保护作用及机制研究 J.广西医科大学学报，2020，37（1）：37-43.WANG C R，CHENG F M，HUANG B，etal.Protectiveeffectandmechanismofwaterextractfrompersimmon leaves on liver injury induced by isoniazid andrifampicin in miceJ.Journal of Guangxi Medical University，2020，37（1）：37-43.doi：10.16190/ki.45-1211/r.2020.01.005.10 魏超，程文红，韩春丽.柿叶提取物对老年原发性高脂血症患者血脂水平影响研究 J.数理医药学杂志，2018，31（8）：1206-1207.WEI C，CHENG W H，HAN C L.Effect of persimmon leafextract on blood lipid level in elderly patients with primaryhyperlipidemiaJ.Journal of Mathematical Medicine，2018，31（8）：1206-1207.doi：10.3969/j.issn.1004-4337.2018.08.046.11 成芳梅，王翠荣，黄斌，等.柿叶水提取物对对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤的保护作用及机制 J.广西医科大学学报，2020，37（2）：203-208.CHENG F M，WANG C R，HUANG B，et al.Protective effect and mechanism of WEPL on APAP-induced liverinjury in mice J.Journal of Guangxi Medical University，2020，37（2）：203-208.doi：10.16190/ki.45-1211/r.2020.02.009.12 岳明强.加味三才汤对糖尿病SD大鼠肝脏脂肪变性和keap1-Nrf2 通路影响的实验研究 D.成都：成都中医药大学，2015.YUE M Q.The experimental research of effects of supplementedSan-Cai decotion on liver fatty degeneration and keap1-Nrf2transduction in diabetic SD rats D.Chengdu：Chengdu Universityof Traditional Chinese Medicine，2015.13 高永峰，高允生，辛晓明.柿叶总黄酮对糖尿病小鼠降血糖降血脂作用及其机制研究 J.泰山医学院学报，2009，30（4）：245-247.GAO Y F，GAO Y S，XIN X M.Hypoglycemic andhypocholesterolaemia effect of Total flavonoids from persimmon leafin alloxan-induced diabetic mice and its mechanism J.Journal ofTaishan Medical College，2009，30（4）：245-247.doi：10.3969/j.issn.1004-7115.2009.04.002.14 吴鹏波，宋琪，俞媛洁，等.姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应 J.中国组织工程研究，2020，24（11）：1720-1725.WU P B，SONG Q，YU Y J，et al.Curcumin ameliorates