蜱传脑炎病毒感染BALB_c小鼠模型的建立.pdf

通信作者:赵兰娟C o r r e spo n d e n c e t o:Z H A O L a nju a n E-m a i l:ljz h a o 1 3 1 6 3.c o md o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3-6 1 8 4.2 0 2 3.0 1.0 0 2论著蜱传脑炎病毒感染B A L B/c小鼠模型的建立唐万达1,唐海琳1,任瑞文2,赵平1,赵兰娟11.海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室,上海 2 0 0 4 3 3;2.南部战区疾病预防控制中心,广东 广州 5 1 0 5 0 7摘 要:本文建立了蜱传脑炎病毒(t i c k-b o r n e e n c eph a l i t i s v i r u s,T B E V)感染的动物模型,为筛选抗T B E V药物提供合适的工具。选取B A L B/c小鼠,经皮下注射途径接种T B E V,观察其感染症状、体重及生存率。检测小鼠脑、脾、肾组织中T B E V抗原分布、病毒滴度、组织病理和肿瘤坏死因子(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r,T N F-)、干扰素(i n t e r f e r o n,I F N-)m R N A表达水平的动态变化。结果表明,感染小鼠出现弓背、后肢瘫痪的症状;与未感染病毒的小鼠相比,感染小鼠的体重及生存率显著降低;T B E V抗原分布在小鼠的脑、脾、肾组织;脑组织中病毒滴度高且发生病理改变;感染鼠脑、脾、肾组织中T N F-与I F N-m R N A的表达水平呈动态变化。本文采用皮下注射攻毒途径成功建立了T B E V感染的B A L B/c小鼠模型。关键词:蜱传脑炎病毒;动物模型;皮下注射中图分类号:R 3 7 3.3 文献标识码:AE s t a b l i s h m e n t o f a B A L B/c m i c e m o d e l o f t i c k-b o r n e e n c e p h a l i t i s v i r u s i n f e c t i o nT A N G W a n d a1,T A N G H a i l i n1,R E N R u i w e n2,Z HA O P i ng1,Z HA O L a nju a n11.D e p a r t m e n t o f B i o d e f e n s e,F a c u l t y o f N a v a l M e d i c i n e,N a v a l M e d i c a l U n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3,C h i n a;2.C e n t e r f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n o f S o u t h e r n T h e a t e r C o mm a n d o f P L A,G u a n g z h o u 5 1 0 5 0 7,G u a n g d o n g P r o v i n c e,C h i n aA b s t r a c t:A n a n i m a l m o d e l o f t i c k-b o r n e e n c eph a l i t i s v i r u s(T B E V)i n f e c t i o n w a s e s t a b l i s h e d t o pr o v i d e a s u i t a b l e t o o l f o r a n t i-T B E V d r ug s c r e e n i ng.B A L B/c m i c e w e r e i n o c u l a t e d w i t h T B E V by s u b c u t a n e o u s i nje c t i o n,a n d t h e i r sympt o m s,b o dy w e igh t a n d s u r v i v a l r a t e w e r e o b s e r v e d.T B E V a n t ige n d i s t r i b u t i o n,v i r u s t i t e r,pa t h o l ogi c a l c h a nge s a n d t h e e xpr e s s i o n l e v e l s o f t u m o r n e c r o s i s f a c t o r (T N F-)a n d i n t e r f e r o n (I F N-)m R N A w e r e i n v e s t iga t e d i n b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f t h e m i c e.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e i n f e c t e d m i c e h a d sympt o m s o f a r c h e d b a c k a n d h i n d l i m b pa r a lys i s.T h e b o dy w e igh t a n d s u r v i v a l r a t e o f i n f e c t e d m i c e w e r e s ign i f i c a n t ly d e c r e a s e d a s c o mpa r e d w i t h t h e u n i n f e c t e d m i c e.T B E V a n t ige n c o u l d b e d e t e c t e d i n t h e b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f i n f e c t e d m i c e.V i r u s t i t e r s i n t h e b r a i n w e r e h igh e r t h a n t h o s e i n t h e spl e e n a n d k i d n ey o f i n f e c t e d m i c e,a l o ng w i t h t h e pa t h o l ogi c a l c h a nge s i n t h e b r a i n.T h e e xpr e s s i o n s o f T N F-a n d I F N-m R N A i n t h e b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f m i c e w e r e a s s o c i a t e d w i t h t h e d u r a t i o n o f T B E V i n f e c t i o n.B A L B/c m i c e m o d e l o f T B E V i n f e c t i o n h a s b e e n e s t a b l i s h e d by s u b c u t a n e o u s i nje c t i o n o f v i r u s.K e y w o r d s:T i c k-b o r n e e n c eph a l i t i s v i r u s;A n i m a l m o d e l;S u b c u t a n e o u s i nje c t i o n31微生物与感染 J o u r n a l of M i c r o b e s a n d I nfe c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):1 3-2 0 h t tp:jm i.f u d a n.e d u.c n 蜱传脑炎病毒(t i c k-b o r n e e n c eph a l i t i s v i r u s,T B E V)又称森林脑炎病毒,属于黄病毒科黄病毒属成员1,是蜱传脑炎的病原体。中国流行的T B E V属于远东亚型,该亚型致病性较强,死亡率可达4 0%以上2-4。目前针对T B E V感染尚无有效的抗病毒药物。合适的感染动物模型是抗T B E V药物研发和疫苗评估的有力工具5。T B E V可感染多种动物,如田鼠、金黄地鼠、昆明小鼠、C 5 7 B L/6小鼠和B A L B/c小鼠。F i l ipi等6证实:田鼠可作为T B E V的传播宿主,并从田鼠体内分离到T B E V欧洲亚型毒株。刘双军等7通过颅内注射、肌肉注射、腹腔注射、灌胃、滴鼻等多种途径令昆明小鼠感染T B E V,并分析比较了各种攻毒途径对病毒感染性的影响。有研究在C 5 7 B L/6小鼠中,比较了T B E V T o r -2 0 0 3和H B 1 7 1/1 1毒株对小鼠中枢神经系统的侵袭性和毒性差异8。B A L B/c小鼠曾被用于评估葡聚糖固化重组蛋白对T B E V感染小鼠的保护作用9。金黄地鼠和田鼠个体较大、难操作,而小鼠个体小、易操作、遗传背景明确,且其对多种病原体的敏感性也较高,因此小鼠在建立感染动物模型中最常用,其中B A L B/c小鼠被广泛用于病毒学和免疫学方面的研究1 0。本研究选择6周龄雌性B A L B/c小鼠作为实验动物。鉴于T B E V主要通过蜱叮咬传播,皮下注射可更好地模拟自然感染,因此采用皮下注射途径攻毒。攻毒后观察2种攻毒剂量对小鼠感染症状、体重变化及生存率的影响,并检测小鼠脑、脾、肾组织中T B E V抗原表达、组织的病理改变和病毒滴度,检测组织中肿瘤坏死因子(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r,T N F-)mR N A、干扰素(i n t e r f e r o n,I F N-)mR N A表达水平的动态变化。本研究成功建立T B E V感染的B A L B/c小鼠模型。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒、抗体与细胞 T B E V由海军军医大学生物医学防护教研室保存。T B E V免疫小鼠腹水由本研究室保存。非洲绿猴肾细胞V e r o由本研究室保存。猪肾细胞P K-1 5由复旦大学基础医学院病原生物学系叶荣研究员馈赠。T B E V用V e r o细胞扩增,收集病毒,在P K-1 5细胞上用空斑实验测定滴度,以病毒空斑形成单位(pl aqu e f o r m i ng u n i t,P F U)表示,病毒分装后贮存于-8 0 冰箱。1.1.2 实 验 小 鼠 无 特 定 病 原 体(spe c i f i c pa t h oge n f r e e,S P F)级6周龄雌性B A L B/c小鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司,体重为 1 5 1 7 g。动物饲养与实验操作在海军军医大学生物安全3级实验室内开展。实验设计符合海军军医大学实验动物的伦理要求。1.1.3 主要试剂 胎牛血清、DM EM(d u l b e c c os m o d i f i e d e agl e m e d i u m)培养基、青霉素和链霉素双抗、谷氨酰胺、0.5%胰酶-乙二胺四乙酸、磷酸盐缓冲液(ph o sph a t e b u f f e r e d s a l i n e,P B S)购自美国G i b c o公司。柠檬酸抗原修复液、苏木素染液、苏木素分化液、苏木素返蓝液、二氨基联苯胺显色液、苏木素-伊红(h e m a t o xyl i n-e o s i n,H E)染液购自武汉塞维尔生物技术有限公司。牛血清白蛋白(b o v i n e s e r u m a l b u m i n,B S A)购自美国A f fym e t r i x公司。T R I z o l试剂购自美国I n v i t r oge n公司。质量分数为3%的过氧化氢溶液购自国药集团化学试剂有限公司。质量分数为4%的多聚甲醛购自北京鼎国昌盛生 物 技 术 有 限 责 任 公 司。结 晶 紫 购 自 美 国G e n v i e w公司。羧甲基纤维素钠购自美国S igm a-A l d r i c h公 司。M-ML V反 转 录 酶、d N T P M i x、E a s t ep qP C R M a s t e r M i x购自美国P r o m ega公司。随机引物和引物在北京六合华大基因科技股份有限公司合成。1.2 方法1.2.1 实验小鼠分组与攻毒 B A L B/c小鼠用电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)称量体重,根据体重随机分为M o c k组(未感染病毒的对照小鼠)、1 03 P F U和1 04 P F U的T B E V感染组,共3组,每组有5只小鼠。病毒感染组每只小鼠经颈后部分别皮下注射1 03 P F U或1 04 P F U的T B E V(DM EM培养基稀释),1 0 0 L/只,M o c k组每只小鼠注射等体积的DM EM培养基。注射当天记为第0天,攻毒后每日观察小鼠感染症状、称量小鼠体重并记录死亡小鼠数量。1.2.2 小鼠脑、脾、肾组织样品收集 B A L B/c小鼠经颈后部皮下注射途径感染T B E V,1 03 P F U/只。感染后第5、7、9天,在生物安全柜内(美国T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c公司)处死小鼠,解剖后分别取小鼠的脑、脾、肾组织。采集的脑、脾、肾组织用P B S洗涤,分别加入P B S(检测病毒滴度)、T R I z o l(检测I F N-与T N F-mR N A水平),在冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司)上研磨,条件为-2 5、6 5 H z、8 0 s。研磨样品用低温高速离心机(美国T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c公司)离心,4、1 0 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n后收集上清液,进行相应检测。采集脑、脾、肾组织,经质量分数为4%的多聚甲醛固定2 4 h后进行免疫组织化学和41微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):1 3-2 0H E染色分析。1.2.3 免疫组织化学 组织石蜡切片脱蜡,置于柠檬酸抗原修复缓冲液进行抗原修复。切片冷却,用P B S洗涤3次,放入3%过氧化氢溶液于室温避光孵育2 5 m i n。P B S洗涤3次,加入3%B S A封闭3 0 m i n,切片上滴加T B E V免疫小鼠腹水(1 5 0 0),切片于湿盒内4 孵育过夜。P B S洗涤3次,加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(11 0 0 0),室温孵育5 0 m i n。P B S洗涤3次,加入二氨基联苯胺显色液,在显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色。苏木素染液复染3 m i n后水洗,分化液分化数秒后水洗,返蓝液返蓝后水洗。脱水封片,采用成像系统N i k o n D S-U 3(日本尼康)采集图像并分析。1.2.4 H E染色 组织石蜡切片脱蜡,放入苏木素染液染色5 m i n,水洗,用分化液分化,水洗,返蓝液返蓝,再水洗。切片放入体积分数为8 5%、9 5%的酒精梯度脱水各5 m i n。放入H E染液染色5 m i n。脱水封片,采用成像系统N i k o n D S-U 3采集图像并分析。1.2.5 空斑实验 将P K-1 5细胞置于3 7、C O2体积分数为5%的培养箱(美国T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c公司)内,培养基为含体积分数1 0%的胎牛血清、质量分数1%的谷氨酰胺、质量分数1%的青霉素链霉素的DM EM。用胰酶-乙二胺四乙酸消化细胞,接种于1 2孔培养板,培养至细胞密度约1 0 0%。收集的小鼠脑、脾、肾组织研磨样品以1 0倍系列稀释后加至细胞,每个稀释度设3个重复孔。T B E V在P K-1 5细胞上的空斑实验参照文献1 1并做修改,以质量分数2%的羧甲基纤维素钠作为覆盖液,质量分数1%的结晶紫染色,质量分数4%的多聚甲醛固定。1.2.6 实时荧光定量聚合酶链反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R)收集小鼠脑、脾、肾组织研磨样品进行R N A抽提,使用多功能酶标仪(美国B i o T e k公司)检测R N A的纯度和浓度,加入随机引物、M-ML V反转录酶和d N T P M i x反转录成c D N A。使用E a s t ep qP C R M a s t e r M i x,在R o t o r-G e n e 3 0 0 0 P C R仪(澳大利亚C o r b e t t公司)上进行扩增。扩增条件如下:9 5 2 m i n,9 5 1 0 s、5 5 1 0 s、7 2 2 5 s,共4 0个循环。采用R o t o r-G e n e 6.1.8 1软件、C t法对目的基因进行相对定量分析,G A P DH作为内参。鼠 源 引 物 序 列 如 下。G A P DH:正 向5 -T G C C C A G A A C A T C A T C C C T G-3,反 向5 -A T C C A C G A C G G A C A C A T T G G-3。I F N-:正向5 -C G G A C T T C A A G A T C C C T A T G G A-3,反向5 -T G G C A A A G G C A G T G T A A C T C T T C-3。T N F-:正向5 -C T G T A G C C C A C G T C G T A G C-3,反 向5 -T T G A G A T C C A T G C C G T T G-3。1.2.7 统计学分析与作图 采用G r aphpa d P r i s m 8.0软件对实验数据进行统计学分析,数据以平均值标准差(M e a n S D)表示。采用t检验进行组间差异性比较,生存率数据采用L og r a n k检验。P 0.0 5表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 T B E V感染B A L B/c小鼠的体重及生存率显著下降 T B E V通过皮下注射途径感染B A L B/c小鼠,采用1 03 P F U/只和1 04 P F U/只2种攻毒剂量,之后连续1 2天,每天观察小鼠的感染症状,称量体重。攻毒后第8天,1 03 P F U、1 04 P F U感染组小鼠均开始出现弓背、后肢瘫痪的症状,并逐日加重,而未感染病毒的M o c k组小鼠无此症状。如图1 A所示,在观察时段内,M o c k组小鼠的体重呈上升趋势。A:C h a nge s i n b o dy w e igh t o f m i c e.B:S u r v i v a l c u r v e o f m i c e.B A L B/c m i c e w e r e s u b c u t a n e o u s ly i n o c u l a t e d w i t h 1 03 P F U a n d 1 04 P F U o f T B E V.D a t a w e r e e xpr e s s e d a s t h e m e a n S D o f t w o e xpe r i m e n t s(n=5).B o dy w e igh t d a t a w e r e a n a lyz e d by u npa i r e d t t e s t a n d s u r v i v a l d a t a w e r e a n a lyz e d by L og r a n k t e s t.M o c k:w i t h o u t T B E V i n o c u l a t i o n.*:P0.0 5;*:P0.0 1.*(R e d):1 03 P F U T B E V v s m o c k;*(B l u e):1 04 P F U T B E V v s m o c k.图1 T B E V感染B A L B/c小鼠的体重及生存率变化F i g.1 C h a n g e s i n b o d y w e i g h t a n d s u r v i v a l r a t e o f B A L B/c m i c e i n f e c t e d w i t h T B E V51唐万达,等:蜱传脑炎病毒感染B A L B/c小鼠模型的建立与M o c k组小鼠的体重相比,1 03 P F U组小鼠在攻毒后第1、2、9天体重显著下降(P0.0 1、P0.0 5),之后体重逐渐回升,至第1 2天小鼠体重接近M o c k组小鼠体重;1 04 P F U组小鼠在攻毒后第1、7、8、9、1 0天体重显著下降(P0.0 5),之后体重持续下降。同时发现,1 03 P F U组小鼠在感染后第9天死亡2只,第1 1天死亡1只;1 04 P F U组小鼠在感染后第8天死亡1只,第1 2天共死亡4只(见图1 B)。第2 1天,1 03 P F U组存活2只、1 04 P F U组存活1只。与M o c k组小鼠的生存率相比,1 03 P F U、1 04 P F U组小鼠生存率均降低,差异具有显著性(P 0.0 5)。结果表明,T B E V在B A L B/c小鼠体内建立感染,攻毒剂量1 04 P F U的致死率高于1 03 P F U的致死率。下述T B E V在B A L B/c小鼠体内感染特性的研究采用皮下注射1 03 P F U/只的攻毒方式,并动态收集鼠脑、脾、肾组织标本,进行相应检测。2.2 病毒感染B A L B/c小鼠脑、脾、肾组织中T B E V抗原分布 采用免疫组织化学检测T B E V感染小鼠脑、脾、肾组织中病毒抗原的表达。如图2所示,M o c k组的脑、脾、肾组织均未检测到T B E V抗原。攻毒后第5天,在脾组织中可检测到T B E V抗原(棕黄色为阳性信号)。第7天,脑、肾组织中也检测到T B E V抗原的表达。第9天,T B E V抗原在脑、脾、肾组织中的表达均增多,阳性信号较第5、第7天增强。第7天,仅在大脑皮质、丘脑部位检测到T B E V抗原且阳性信号较弱;第9天,在大脑皮质、海马体、丘脑、下丘脑等部位均可检测到T B E V抗原且阳性信号较强。以上结果显示,随着感染时间的延长,脑B A L B/c m i c e w e r e i n f e c t e d w i t h T B E V by s u b c u t a n e o u s i nje c t i o n.D e t e c t i o n o f T B E V a n t ige n i n b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f t h e m i c e o n d ay 5,7 a n d 9 po s t-i n f e c t i o n by i mm u n o h i s t o c h e m i s t ry,r e spe c t i v e ly.T B E V a n t ige n i n b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f m o c k m i c e w a s d e t e c t e d o n d ay 9.T h e r epr e s e n t a t i v e i m age s o f t w o i n d epe n d e n t e xpe r i m e n t s w e r e s h o w n.O r igi n a l m agn i f i c a t i o n:4 0 0.M o c k:w i t h o u t T B E V i n f e c t i o n.图2 T B E V感染B A L B/c小鼠脑、脾、肾中T B E V抗原的分布F i g.2 D i s t r i b u t i o n o f T B E V a n t i g e n i n b r a i n,s p l e e n a n d k i d n e y o f T B E V-i n f e c t e d B A L B/c m i c e61微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):1 3-2 0组织中T B E V抗原的表达明显比脾、肾组织的抗原表达强。2.3 B A L B/c小鼠脑组织病理改变除检测T B E V抗原在感染B A L B/c小鼠的脑、脾、肾组织的分布外,还观察了组织的病理变化。对T B E V感染小鼠脑、脾、肾组织行H E染色,仅发现脑组织出现轻微的病理改变。脑组织病理切片结果显示,感染后第5天,鼠脑组织开始出现神经元固缩,细胞周围间隙增大(见图3黑色箭头处),第7天、第9天,鼠脑组织病理学改变仍同第5天,病理学改变不明显(见图3)。在感染后第9天,丘脑部可见少量的炎症细胞浸润(结果未示)。B A L B/c m i c e w e r e i n f e c t e d w i t h T B E V by s u b c u t a n e o u s i nje c t i o n.H E s t a i n i ng o f b r a i n s e c t i o n s o f m i c e o n d ay 5,7 a n d 9 po s t-i n f e c t i o n,r e spe c t i v e ly.H E s t a i n i ng o f b r a i n s e c t i o n s o f m o c k m i c e o n d ay 9.T h e gaps a r o u n d t h e c e l l s b e c a m e l a rge r(B l a c k a r r o w s).T h e r epr e s e n t a t i v e i m age s o f t w o i n d epe n d e n t e xpe r i m e n t s w e r e s h o w n.O r igi n a l m agn i f i c a t i o n:2 0 0.M o c k:w i t h o u t T B E V i n f e c t i o n.图3 T B E V感染B A L B/c小鼠脑组织的病理改变F i g.3 P a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n b r a i n o f T B E V-i n f e c t e d B A L B/c m i c e2.4 B A L B/c小鼠脑组织中存在高滴度病毒采用空斑实验进一步检测攻毒后鼠脑、脾、肾组织中的病毒滴度。在小鼠感染后第5天,仅脾内可检测到T B E V且病毒滴度仅为1 5 P F U/m L(见图4)。在第7天,脑、肾组织中也检测到T B E V且脑组织中病毒滴度高达3.6 71 06 P F U/m L,而肾组织中病毒滴度只有2 0 P F U/m L。至第9天,脑、脾、肾组织中的病毒滴度均升高,其中脑中病毒滴度最高,为1.3 3 1 07 P F U/m L。与第7天的脑、脾组织中病毒滴度相比,第9天的脑、脾组织中病毒滴度显著升高(P0.0 5)。此外,脑、脾、肾组织中病毒滴度的检测结果与T B E V抗原在3种组织中的分布一致。结果提示,T B E V感染后,病毒首先在鼠脾内复制增殖,之后在脑、肾中增殖,随着T B E V感染时间的延长,T B E V最终在脑中大量增殖。B A L B/c m i c e w e r e i n f e c t e d w i t h T B E V by s u b c u t a n e o u s i nje c t i o n.B r a i n,spl e e n a n d k i d n ey w e r e c o l l e c t e d o n d ay 5,7 a n d 9 po s t-i n f e c t i o n,r e spe c t i v e ly.T B E V t i t e r s i n b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f t h e m i c e w e r e d e t e r m i n e d by pl aqu e a s s ay.D a t a w e r e e xpr e s s e d a s m e a n S D o f t h r e e e xpe r i m e n t s(n=3).D a t a w e r e a n a lyz e d by u npa i r e d t t e s t.*:P 0.0 5.U D:u n d e t e c t a b l e.图4 T B E V感染B A L B/c小鼠脑、脾、肾中T B E V滴度F i g.4 T B E V t i t e r s i n b r a i n,s p l e e n a n d k i d n e y o f T B E V-i n f e c t e d B A L B/c m i c e71唐万达,等:蜱传脑炎病毒感染B A L B/c小鼠模型的建立2.5 B A L B/c小鼠脑、脾、肾组织中T N F-与I F N-m R N A表达的动态变化 本研究不仅检测T B E V在B A L B/c小鼠体内的复制增殖,还研究了小鼠针对T B E V感染产生的免疫应答。利用实时荧光定量P C R监测T B E V感染B A L B/c小鼠脑、脾、肾组织中T N F-与I F N-mR N A水平的动态变化,并与M o c k组小鼠脑、脾、肾组织中相应因子mR N A水平进行比较。结果如图5 A所示,T B E V感染小鼠后第5天(P0.0 5)、第7天(P0.0 0 1)、第 9天(P0.0 5)其脾内T N F-mR N A的表达受到了显著抑制;T B E V在感染后第7天其脾内I F N-mR N A的表达增强(P 0.0 5),而在第5天(P0.0 1)、第 9天(P0.0 5)脾内I F N-mR N A的表达受到抑制。在B A L B/c小鼠肾组织,T B E V感染后第7天(P0.0 1)、第 9天(P 0.0 0 1)T N F-mR N A的表达受到抑制;在感染后第9天I F N-mR N A的表达被显著抑制(P0.0 0 1,见图5 B)。在T B E V感染后第 9天,脑组织中T N F-mR N A水平显著降低(P0.0 5);T B E V感染小鼠脑组织中I F N-mR N A水平无明显变化,第9天时表达略微升高(见图5 C)。上述结果揭示了T B E V感染小鼠后其脑、脾、肾组织中T N F-与I F N-mR N A表达水平的动态变化。L e v e l s o f T N F-a n d I F N-m R N A i n spl e e n(A),k i d n ey(B)a n d b r a i n(C)o f T B E V-i n f e c t e d B A L B/c m i c e w e r e d e t e c t e d by qu a n t i t a t i v e r e a l t i m e-P C R.D a t a w e r e s h o w n a s f o l d o f t h e m R N A l e v e l s i n b r a i n,spl e e n a n d k i d n ey o f m i c e o n d ay 5,7 a n d 9 po s t-i n f e c t i o n o v e r t h e c o r r e spo n d i ng m R N A l e v e l s o f m o c k.D a t a w e r e e xpr e s s e d a s m e a n S D o f t h r e e e xpe r i m e n t s(n=3).D a t a w e r e a n a lyz e d by pa i r e d t t e s t.*:P 0.0 5;*:P 0.0 1;*:P 0.0 0 1;P:c o mpa r e d t o t h e m o c k.M o c k:w i t h o u t T B E V i n f e c t i o n.图5 T B E V感染B A L B/c小鼠脑、脾、肾中T N F-、I F N-m R N A的表达F i g.5 E x p r e s s i o n o f T N F-a n d I F N-m R N A i n b r a i n,s p l e e n a n d k i d n e y o f T B E V-i n f e c t e d B A L B/c m i c e3 讨论T B E V借助媒介、宿主和环境之间的相互作用传播病毒,对人类健康造成严重威胁1 2。T B E V经蜱传播,主要分布在北温带与寒带地区1 3。目前,尚无针对T B E V感染的有效抗病毒药物,抗病毒药物的研发需要合适的动物模型进行体内抗病毒作用的评估。B A L B/c小鼠具有对病毒敏感性较高,以及遗传背景明确,个体小,易操作的优点,常被用作感染动物模型的实验动物1 4。因此,本研究选用B A L B/c小鼠作为T B E V感染的实验动物。为更好地模拟病毒自然感染,采用1 03 P F U和1 04 P F U 2种攻毒剂量经皮下注射途径感染小鼠,发现2种剂量均可导致小鼠出现弓背、后肢瘫痪的症状,这与C h e r n o k h a e v a等1 5研究中观察到T B E V的感染症状一致。P e t ry等1 6通过皮下注射途径感染C 5 7 B L/6小鼠,也出现弓背、竖毛、后肢瘫痪等感染症状。此外,攻毒后B A L B/c小鼠的体重及生存率均显著下降。随着感染时间的延长,1 03 P F U组小鼠的体重逐渐回升而1 04 P F U组小鼠体重持续下降,并且1 03 P F U组小鼠的存活率较1 04 P F U组小鼠更高。结果表明,T B E V通过皮下注射途径攻毒81微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):1 3-2 0可以在B A L B/c小鼠体内建立感染,攻毒剂量1 04 P F U的致死率高于1 03 P F U。基于