牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起牛呼吸道综合征的分析.pdf

临床兽医120 2023.80 引言牛副流行性感冒是由牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）引起牛的一种急性接触性呼吸道传染病1。该病通常因长途运输等应激因收稿日期：2023-05-09基金项目：来宾市科技成果转化与应用项目（来科转220824）；南宁市科技基地专项（20192077）；贺州市科技攻关项目（贺科攻201808027）；广西畜牧产业科技先锋队专项（桂农科盟202309-01-2）作者简介：霍秀龙（1974-），男，壮族，本科，高级兽医师，主要从事基层动物疫病防控工作。*通信作者简介：李军（1971-），男，汉族，博士，正高级兽医师，研究方向：动物疫病防控与病原分子生物学。霍秀龙，吴翠兰，梁昌良牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起牛呼吸道综合征的分析J现代畜牧科技，2023，99（8）：120-123doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.031HUO Xiulong，WU Cuilan，LIANG Changlianget alAnalysis of Bovine Respiratory Syndrome Caused by Mixed Infection of Bovine Parainfluenza Virus Type 3 and Mycoplasma BovisJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：120-123牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起牛呼吸道 综合征的分析霍秀龙1，吴翠兰2，3，梁昌良2，3，莫志晖4，钟舒红2，3，彭昊2，3，李军2，3*（1.平果市动物疫病预防控制中心，广西 平果 531400；2.广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；3.农业农村部中国（广西）-东盟跨境动物疫病防控重点实验室，广西 南宁 530001；4.皇氏赛尔生物科技（广西）有限公司，广西 南宁 530001）摘要：为查明广西某牛场一起以呼吸道症状为主的病因，试验采用流行病学调查法、临床观察法、病理解剖观察法、病原分离培养和RT-PCR/PCR扩增法进行诊断，并对分离株进行药物敏感性试验。牛副流感病毒3型和牛支原体为阳性，牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒等为阴性。该起病例由牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起的，导致本场牛大批发病死亡的原因是由外购牛传染引起。关键词：牛副流感病毒3型；牛支原体；牛呼吸道综合征；耐药性分析中图分类号：S858.26文献标识码：Bdoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.031Analysis of Bovine Respiratory Syndrome Caused by Mixed Infection of Bovine Parainfluenza Virus Type 3 and Mycoplasma BovisHUO Xiulong1，WU Cuilan2,3，LIANG Changliang2,3，MO Zhihui4，ZHONG Shuhong2,3，PENG Hao2,3，LI Jun2,3*（1.Pingguo City Animal Disease Prevention and Control Center，Pingguo Guangxi 531400，China；2.Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Guangxi Veterinary Research Institute，Nanning Guangxi 530001，China；3.Key Laboratory of China（Guangxi）-ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control，Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China，Nanning Guangxi 530001，China；4.Huangshi Cel Biotechnology（Guangxi）Co.，LTD，Nanning Guangxi 530001，China）Abstract：In order to identify the etiology of respiratory tract symptoms in a cattle farm in Guangxi province，epidemiological investigation，clinical observation，pathological anatomical observation，pathogen isolation and culture，and RT-PCR/PCR amplification were used for diagnosis，and drug sensitivity test was conducted for the isolated strainsBovine parainfluenza virus type 3 and bovine mycoplasma were positive，while bovine coronavirus and bovine respiratory syncytial virus were negativeThe results showed that this case was caused by the mixed infection of bovine parainfluenza virus type 3 and mycoplasma bovisAnd The cause of the large number of cattle deaths in this farm was caused by the infection of imported cattleKeywords：bovine parainfluenza virus type 3，mycoplasma bovis，bovine respiratory syndrome，drug resistance analysis临床兽医1212023.8素而发病，临床表现为流鼻涕、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状，以感染的肺组织细胞浆和核内形成包涵体为特征1-2。牛副流感病毒3型常与其他病毒（牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等）、细菌（多杀巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、溶血曼氏杆菌等）或者支原体（牛支原体等）混合感染引起更为严重的牛呼吸道综合征3。现已证实，牛呼吸道综合征的发病率和死亡率较高，尤其是刚断奶或者运输的肉牛发生的风险更大，占总发病率的70%80%，占总死亡率的10%50%4。2022年7月，广西某牛场发生一起牛呼吸道综合征病例，经过流行病学调查、临床症状、病理变化观察和实验室检测，诊断是由牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起，发病起因是由外购牛传染造成。1 材料与方法1.1 样品来源广西某牛场病死牛的肺脏、心脏等组织。1.2 试剂HiFi-ScriptcDNA第一链合成试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、2ESTaqMasterMix、DM2000分子质量标准等购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖购自Sigma公司；TSA平板、血琼脂平板购自北京路桥技术有限责任公司；PPLO肉汤购自杭州百思生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；马血清购自广东蕊特生物科技有限公司。1.3 仪器PCR仪、凝胶成像系统购自Bio-rad公司。1.4 引物合成参照吴翠兰等5文献合成牛副流感病毒3型、牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、多杀巴氏杆菌、牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌特异性引物，引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。1.5 流行病学调查及临床症状咨询场主该批牛的发病经过，了解流行病学史，观察发病牛的临床症状，解剖病死牛查看内脏组织的病理变化，初步诊断病因。1.6 细菌分离培养将接种环在酒精灯上进行灼烧数秒钟后，分别对鼻拭子、肺脏、肝脏、肺门淋巴结进行划线接种于TSA平板和血琼脂，放置于37 恒温箱培养2448 h。1.7 支原体分离培养用肺脏组织剪碎后，加入适量的PPLO培养基充分混匀，然后用0.45 m滤膜过滤，取1 mL滤液加到4 mL PPLO培养液，置于含有5%CO2培养箱中37 培养35 d后，再划线接种于PPLO固体培养基表面，置于含有5%CO2培养箱中37 培养35 d后观察固体培养基上菌落生长情况。1.8 样品处理及核酸提取将采集的肺脏等组织进行研磨，反复冻融3次后，立即提取核酸。将2 mL生理盐水加入装有采样棉签的5 mL冻存管中，充分振荡摇匀，待棉签上的鼻液完全溶解释放后，立即提取核酸。样品的核酸提取按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取组织样品的RNA/DNA，-80 保存备用。1.9 PCR/RT-PCR检测以上述核酸RNA为模板，按照HiFi-ScriptcDNA第一链合成试剂盒说明书进行反转录为cDNA。以cDNA/DNA为模板，分别用牛副流感病毒3型、牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、多杀巴氏杆菌、牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌特异性引物为扩增引物进行PCR鉴定。PCR反应体系为25 L：2ESTaqMasterMix 12.5 L，上游引物和下游引物各1L，模板2L，加ddH2O至25L。反应程序：95 预变性5 min；然后进行30个循环95 变性1min、5060 退火1 min、72 延伸1 min 30 s的反应；最后72 延伸10 min。反应结束后，取7L的PCR产物在1.5%的凝胶琼脂糖上进行电泳，观察电泳结果。1.10 药物敏感性试验用无菌棉签蘸取适量菌液，均匀涂在PPLO固体培养基，然后用镊子夹取药敏纸片贴在平板上，37 4 d，观察并测量抑菌圈直径。2 结果2.1 流行病学调查及临床症状观察2022年7月，广西某牛场从北方某省外购80头250 kg左右的西门塔尔牛，在距离本场约150 m的隔离栏舍饲养，半个月后外购牛开始流鼻涕、咳嗽、喘气，通过使用抗菌药物治疗，症状较轻者出现好转，症状严重者仍无好转，陆续死亡5头。在外购牛发病7 d后，距离150 m远饲养的本场自繁自养犊牛（48月龄）也开始发病，表现出相同症状，共发病88头，死亡47头，死亡率53.41%（47/88）。病牛临床表现为体温升高至41，精神萎靡，食欲减退，流泪、眼分泌物增多，咳嗽，腹式呼吸。剖检病死牛肺脏呈典型纤维素性肺炎，水肿、间质增宽、纤维素性渗出物覆盖，见图1，肺门淋巴结水肿；心肌柔软、心肌和心冠沟脂肪有出血点。2.2 细菌分离培养结果样品组织接种于TSA平板和血琼脂放置于37 恒温箱培养2448 h后，未发现有细菌生长。临床兽医122 2023.8图1 牛肺呈“大理石样”病变2.3 支原体分离培养结果滤液经过4 d培养后，PPLO固体培养基可见到针刺般大小的菌落，用显微镜观察可见典型的“煎蛋样”菌落，见图2。以该菌DNA为模板分别进行牛支原体的PCR扩增鉴定，结果显示能扩出448 bp的特异性条带，表明从肺上分离到牛支原体。图2“煎蛋样”菌落2.4 PCR/RT-PCR检测结果样品经过PCR/RT-PCR检测结果显示，牛副流感病毒3型和牛支原体的特异性引物扩增出预期目的条带，牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、多杀巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌未见扩增出预期的目的条带，见图3。图3 RT-PCR/PCR结果注：M：marker DM 2000；1：牛副流感病毒3型；2：牛支原体；3：牛冠状病毒；4：牛呼吸道合胞体病毒；5：牛传染性鼻气管炎病毒；6：多杀巴氏杆菌；7：溶血曼氏杆菌；8：化脓隐秘杆菌；9：肺炎克雷伯氏菌2.5 药物敏感性试验试验共用10种药物对分离到的牛支原体进行药物敏感性试验，其结果见表1。分离菌对恩诺沙星、氧氟沙星、阿米卡星呈现出高度敏感；对庆大霉素表现为中敏；对头孢噻肟、头孢曲松、泰勒菌素、阿奇霉素、红霉素、复方新诺明为耐药。表1 药物敏感性试验药物名称 抑菌圈直径（mm）药物名称抑菌圈直径（mm）头孢噻肟0恩诺沙星22头孢曲松0庆大霉素16氧氟沙星20阿米卡星19泰乐菌素12复方新诺明0阿奇霉素10红霉素93 讨论经过流行病学调查、临床症状、病理变化观察和实验室检测，诊断是由牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起的，而导致本场牛大批量发病死亡的原因是由外购牛传染造成6。该病例是经过长途运输引发的牛呼吸道综合征，证实应激因素是导致牛发生呼吸道疾病综合征的关键原因之一。受到应激因素刺激后，牛体的免疫力下降，易引起病原的感染与传播。牛副流感病毒3型的传播主要方式为呼吸道飞沫传播，可在病牛鼻液中检测到病原，故在拥挤的牛舍或运输的局限环境中，容易发生感染和传播7-8。该病毒感染牛体后在临床上的表现与牛支原体肺炎、牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒等呼吸道病原感染后的临床症状极为相似，因此要加以鉴别，避免误诊。目前，牛副流感病毒3型的诊断方法包括病毒分离及鉴定、病毒中和实验、ELISA检测、血凝及血凝抑制实验、RT-PCR、荧光定量RT-PCR以及新型的分子生物学方法Nano-PCR和RT-LAMP检测7，9-10。诊断方法的多样性为疫病的诊断提供可靠手段。牛副流感病毒3型为副黏病毒科、副黏病毒亚科、呼吸道病毒属的成员，为单股负链RNA病毒，分为A型、B型和C型3种基因型8，11-12。该病毒最早于1959年分离到，目前，牛副流感病毒3型在美洲、欧洲、亚洲各国均有流行7。2008年，刘鹏等13报道从黑龙江省某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离到1株牛副流感病毒3型后，山东、辽宁、江苏等省陆续有牛副流感病毒3型的报道。王海勇等14采用血清学的方法对我国12个省份进行牛副流感病毒3型的血清学调查，结果显示黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、河北、山东、河南、湖南和福建的抗体阳性率在50%以上，总体阳性率为77.6%，而且我国没有可用的商品化疫苗，抗体阳性即是野毒感染机体所产生的抗体，结果表明牛副流感病毒3型在我国流行广泛，因此对于牛副流感病毒3型的预防和治疗应引起高度重视，否则将严重危害我国养牛业的可持续发展。牛副流感病毒3型主要的传播方式是水临床兽医1232023.8平传播，病毒通过患病牛的分泌物、排泄物以及被患病牛污染的饲料垫料等都可以传播给健康牛。牛副流感病毒3型一年四季均可发病，但多见于秋季和冬季8。据报道，牛副流感病毒3型常与其他病原发生混合感染。傅欣玲等15报道了牛副流感病毒3型与牛病毒性腹泻病毒、大肠杆菌等发生混合感染，廉德平等16报道牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气病毒的混合感染率为22.22%。在本病例中，除检测到牛副流感病毒3型外，还检测到牛支原体。牛支原体是介于病毒和细胞之间的一种原核生物17，以水平传播的方式进行感染，主要定植在呼吸道纤毛上导致纤毛受损，削弱其清除功能，并诱发大量的巨噬细胞和淋巴细胞浸润，引起局部炎症造成肺脏损伤，造成其他细菌、病毒的混合感染。牛支原体在世界范围内广泛存在，欧洲每年有25%33%的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，每年损失1.44亿1.92亿欧元，严重影响畜牧业的发展18-19。目前对于支原体的治疗主要药物治疗。通过分离到的牛支原体进行药物敏感性试验，结果显示，分离对氨基糖苷类（恩诺沙星、氧氟沙星）和喹诺酮类（阿米卡星）呈现出高度敏感；对氨基糖苷类（庆大霉素）表现为中敏；对-内酰胺类（头孢噻肟、头孢曲松）、大环内酯类（泰勒菌素、阿奇霉素、红霉素）、磺胺类（复方新诺明）为耐药。该结果与Sulyok20、吴翠兰等5研究相一致。据报道，牛支原体23SrRNA等位基因的结构域和V发生位置突变及核糖体蛋白L4和L22基因发生点突变都有可能影响牛支原体对大环内酯类药物的敏感性或者耐药性6。牛支原体分离株产生的耐药机制是否与之相关，有待进一步的研究。目前对于牛呼吸道综合征最主要是做好防控措施。首先，在饲养管理方面，要坚持场内自繁自养的原则，加强养殖场的环境卫生，注意清理粪污和定期消毒，同时还要提高营养，增加个体免疫力。其次，在疫病防控方面，要做到“早发现、早隔离、早诊断、早治疗”。一旦牛发病，要及时隔离和对症治疗，防止继发感染，同时还要对饲养环境中用到的器具和人员全面消毒，防止病原的进一步传播。参考文献1朱远茂，马磊，杨婷，等牛副流感的流行、危害及其防控J中国预防兽医学报，2016，38（8）：667-6712朴范泽兽医全攻略+牛病M北京：中国农业出版社，20093楚会萌，任亚初，程凯慧，等一株牛副流感病毒3型的分离鉴定及基因组序列分析J中国病原生物学杂志，2020，15（9）：1 038-1 0414Chai J，Capik S F，Kegley B，et alBovine respiratory microbiota of feedlot cattle and its association with diseaseJVet Res，2022，53（1）：45吴翠兰，彭昊，李军，等20162017年广西牛呼吸道疾病综合征病原学的调查研究J中国畜牧兽医，2018，45（12）：3 535-3 5446路荣内蒙古地区牛副流感病毒3型的分离及鉴定D呼和浩特：内蒙古农业大学，20207贺志昊，张平，王明进，等牛副流感病毒3型的研究进展J畜牧兽医科技信息，2020（10）：268李健友，李家伟，王超，等牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用J中国畜牧兽医，2017，44（10）：2 837-2 8449师新川，温永俊，王凤雪，等牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用J中国畜牧兽医，2012，39（11）：31-3410 崔一龙，杨达汉，石芸，等一株牛副流感病毒3型的分离鉴定及系统进化树分析J中国生物制品学杂志，2019，32（1）：25-2811 庄金秋，梅建国，张颖，等牛副流感病毒3型实验室检测方法研究进展J中国草食动物科学，2017，37（4）：46-4912 刘鹏，侯喜林，周玉龙，等牛副流感病毒3型的分离鉴定J微生物学通报，2009，36（9）：1 384-1 38913 王海勇，童钦，王炜，等我国牛副流感病毒3型血清学调查J中国预防兽医学报，2014，36（2）：154-15614 傅欣玲，张聪，舒鑫，等一起牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型和大肠杆菌混合感染的诊疗报告J畜牧与兽医，2018，50（5）：97-10015 廉德平，倪宏斌，凌晨，等新疆阿克苏地区牛传染性鼻气管炎病毒与牛副流感病毒3型感染的检测J中国兽医杂志，2018，54（2）：15-1816 吴翠兰，陶立，李军，等牛支原体广西分离株的致病性研究J黑龙江畜牧兽医，2018（7）：99-10117 王洪梅，赵贵民，侯佩莉，等牛呼吸道疾病综合征流行现状及防控技术研究进展J中国畜牧杂志，2015，51（16）：33-3918 Nicholas R A，Ayling R DMycoplasma bovis：disease，diagnosis，and controlJRes Vet Sci，2003，74（2）：105-11219 Sulyok K M，Kreizinger Z，Fekete L，et alAntibiotic susceptibility profiles of Mycoplasma bovis strains isolated from cattle in Hungary，Central EuropeJBMC Vet Res，2014，10：25620 Uri L，Eytan A，Roger D A，et alAcquired resistance to the 16-membered macrolides tylosin and tilmicosin by Mycoplasma bovisJVeterinary Microbiology，2014，168（2-4）编辑：韩若