植物组织器官培养生产代谢产物.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,1/8/2022,#,植物组织器官培养生产代谢产物,植物组织器官培养生产代谢产物,第1页,一,本节主要内容,毛状根培养制备次级代谢产物,二,本节关键问题,1.毛状根诱导机制与方法、应用,2.毛状根培养制备次级代谢产物影响原因,3.植物组织器官、细胞培养制备次级代谢产物,各自优缺点,植物组织器官培养生产代谢产物,第2页,一,分化与次级代谢产物关系,1,1.细胞分化与次生代谢产物,细胞分化程度提升与次生代谢产物含量,有一定相关性。比如：,许多植物次生代谢产物合成与叶绿体,分化相关。,植物组织器官培养生产代谢产物,第3页,2.细胞聚集和组织水平上分化,在聚集细胞团块中，位于,表面和中央,细胞处于不一样分化状态,，从而常表现出,与游离细胞,不一样次生代谢能力,。,比如：小果咖啡培养物中嘌呤环生物碱,合成取决于细胞团块大小。所以，固定,化培养利于提升生产次生代谢产物含量。,植物组织器官培养生产代谢产物,第4页,3.器官水平上分化,有些植物某种次生代谢产物在某个器官中含量,较高，在悬浮培养细胞中含量较低或没有。,比如：柴胡根中含有效成份柴胡皂苷，其愈伤组,织普通不能合成这类化合物。,有些植物培养物在合成次级代谢产物时要求有,芽形成。,比如：长春花脱分化培养细胞中极难取得含有,抗癌活性长春花碱，而在培养长春花簇芽中,能测定出长春花碱。,植物组织器官培养生产代谢产物,第5页,大多数植物次级代谢产物与细胞分化相关。,离体培养植物细胞存在不稳定、目标产物含量,低、需要激素等不足。,所以，分化程度较高、遗传更稳定植物组织器,官培养在有价值次级代谢产物生产上展现了应用,潜力。,植物组织器官培养生产代谢产物,第6页,二,植物组织器官培养,生产次级代谢产物,植物组织器官培养生产代谢产物,第7页,（一）毛状根培养生产次级代谢产物,一些植物次级代谢产物在根里大量合成,，不过正常根培养非常困难，生长迟缓,，收获困难。,毛状根(hairy,roots)是发根农杆菌（,Agrobacterium,rhizogenes,）感染双子叶,植物后，形成类似头发一样根组织。,许多植物毛状根在离体培养条件下表现,出次生代谢产物合成能力，产物产量较,正常植物及悬浮培养细胞要高。,植物组织器官培养生产代谢产物,第8页,1.,毛状根产生机制,发根农杆菌,(,Agrobacterium,rhizogenes,),是一个革兰氏阴性菌，能,侵染大多数双子叶植物、少数单子叶,植物及个别裸子植物，诱发被感染植,物受伤部位长出毛状根。,发根农杆菌含有致根性，是因为它具,有,能诱导毛状根产生Ri,(Root,）,inducing),质粒,（约250kb大质粒）,是位于,发根农杆菌染色体之外独立,双链环状DNA,。含有2个主要功效区：,T-DNA区,(Transferred,DNA,region，,转移区)和,Vir区,(Virulanee,region，,致病区)。,植物组织器官培养生产代谢产物,第9页,在通常状态下，Ri质粒上Vir区基因处于抑制,状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤,植物细胞合成低分子苯酚化合物乙酰丁香,酮使Vir区处于抑制状态基因被激活,，产生一,系列限制性核酸内切酶，在酶切割作用下产,生T-DNA链，T-DNA进入植物细胞核内，整合进,植物细胞基因组。其整合和表示结果造成,了大量毛状根产生。,T-DNA上有,生长素合成基因,tms,1和tms,2，指导,IAA(吲哚乙酸)合成，所以转化产生毛状根,，在培养时不需要添加外源生长激素，为激素,自养型。,植物组织器官培养生产代谢产物,第10页,2.毛状根诱导方法,（,1,）外植体接种法,取植物叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与发,根农杆菌共同培养23,天，将植物外植体移到,含有抗生素选择培养基上进行培养，经过屡次,继代培养，转化植物细胞产生愈伤组织，并可,产生毛状根。,植物组织器官培养生产代谢产物,第11页,（,2,）茎杆接种法,无菌植株生长到一定时候，将植株茎尖、叶片,切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将,带Ri质粒发根农杆菌接种在伤口处和茎顶部,切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛,状根。,植物组织器官培养生产代谢产物,第12页,（,3,）原生质体,农杆菌共培养法,将原生质体培养3-5天后，加入带Ri质粒发根农,杆菌进行共培养，然后借助于转化后细胞激素,自养型特征或T-DNA上抗菌素标识筛选出转化成,功细胞。,分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛,状根。,植物组织器官培养生产代谢产物,第13页,3.,毛状根培养优点,由Ri质粒转化毛状根生长快、激素自养型、生,长周期短，在培养时不需要添加外源激素，易于,培养。,毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强，,合成较为稳定，能大量合成一些悬浮培养细胞,不能或者极少合成次级代谢产物。,经过T-DNA改造，易于采取基因工程路径提升次级,代谢产物产量。,植物组织器官培养生产代谢产物,第14页,4.,毛状根在药用次生代谢产物中应用,毛状根应用于药用植物次生代谢产物生产已经有,近30年历史。,黄酮类(flavonoids)：付春祥等研究表明。来,源于新疆雪莲根段外植体毛状根系。其20d,生长速率可到达鲜重接种量24倍。其中黄酮含,量是野生雪莲根8,.,6倍，是野生雪莲叶片2,.,9,倍。,植物组织器官培养生产代谢产物,第15页,生物碱类(alkaloids)：孙敏等以长春花,(Catharanthus,roseus)无菌苗叶片为外植体诱导,毛状根，其中长春碱含量是原植物根和叶中含量,27.4倍和23.5倍。长春新碱含量是原植物根,是23.5倍。,蒽醌类(anthraquinones):对何首乌(Polygonium,multiflorum,Thunb)研究表明：以再生植株,叶柄、茎段和叶片为外植体可诱导毛状根，毛状,根中大黄酸含量为2.49g/L(干重)。是无菌幼,苗2.85倍。,植物组织器官培养生产代谢产物,第16页,皂苷类(saponins)：对人参研究表明：以无菌,苗带叶幼茎为外植体诱导毛状根中人参总皂苷,含量为2.486(干重)。高于原药材总皂苷含量,1.403(干重)。,苯丙素类(,类(phenyIpropanoids)：雪莲毛状根中丁,香苷和高车前素含量分别约是野生植株40倍,和3倍。,萜类(terpenoids)：对短叶红豆杉研究表明：,以无菌苗芽为外植体可诱导出毛状根。毛状根,中紫杉醇含量为愈伤组织1,.,3-8,8.0,0倍。,植物组织器官培养生产代谢产物,第17页,（二）冠瘿组织培养生产次级代谢产物,冠瘿组织（Crown,gall,tissue）是由根癌农杆菌,(,Agrobacterium,tumefaciens,)感染引发植,物肿瘤组织，它能在无外加,植物激素培养基上生长。,植物组织器官培养生产代谢产物,第18页,冠瘿组织形成,与,根癌农杆菌（,Agrobacterium,tumefaciens,）,上,Ti质粒相关。Ti质粒上也有一段特殊T-DNA，,编码,细胞分裂素合成酶基因,ipt(trnsr)以及,生长,素合成酶基因,iaaM(trns1)、iaaH(trns2)。,植物组织器官培养生产代谢产物,第19页,根癌农杆菌诱导植物形成冠瘿组织过程与发,根农杆菌诱导植物形成毛状根过程相同。,T-DNA整合进植物细胞基因组后，生长素合成,酶基因iaaM(trns1)、iaaH(trns2)分别表示,色,氨酸单加氧酶、吲哚乙酸酰胺水解酶,，二者共,同作用合成生长素,吲哚-乙酸,（IAA）。,细胞分裂素合成酶基因,因ipt(trnsr),)表示,异戊烯,基转移酶,，催化合成份裂素2-异戊烯基腺嘌呤,（ZIP）。,T-DNA指导生长素与分裂素合成造成了转,化植物形成冠瘿组织。,植物组织器官培养生产代谢产物,第20页,冠瘿组织培养不但能够生产植物根中产生次级代,谢产物，而且能够制备植物叶中代谢产物，国外,利用冠瘿组织培养制备了喹啉生物碱，我国也已经,开展西洋参冠瘿组织培养制备人参皂苷研究。,Ti质粒另外一个应用：构建转基因植物,植物组织器官培养生产代谢产物,第21页,三,毛状根培养生产药用次级代谢产物,讨论分析,植物组织器官培养生产代谢产物,第22页,1.,长春花碱毛状根培养制备,长春花（,Catharanthus,roseus,(L.),Don）：,夹竹桃科长春花属。,长春花姿态优美，花期长，适合布置花坛、花,境，也可作盆栽观赏。还是一个防治癌症药,源植物。长春花中含55种生物碱。其中长春碱,和长春新碱对治疗绒癌等恶性神瘤、淋巴肉瘤,及儿童急性白血病等都有一定疗效（长春新碱,抗癌比长春碱高强）。,植物组织器官培养生产代谢产物,第23页,植物组织器官培养生产代谢产物,第24页,植物组织器官培养生产代谢产物,第25页,植物组织器官培养生产代谢产物,第26页,植物组织器官培养生产代谢产物,第27页,2.雪莲花毛状根培养制备黄酮,植物组织器官培养生产代谢产物,第28页,发根农杆菌,R1601,诱导水母雪莲叶片,21d,时到达最大值，为,633mg/L,植物组织器官培养生产代谢产物,第29页,氮源总浓度为,30mmo1/L,时，毛状根,生长量和总黄酮合成量均到达最大，,分别为,7.3g/L(DW),和,617mg/L;,NH,4+,/N0,3-,百分比为,5:25,时，毛状根生长,量和总黄酮合成量均到达最大，分别,为,8.0g/L(DW),和,821mg,/L,植物组织器官培养生产代谢产物,第30页,50mg/L,葡萄糖效果最好，毛状,根干重和总黄酮合成量分别到达,7.6g/L(DW),和,773mg/L;,20mg/L,蔗糖和,30mg/L,葡萄糖组,合时，毛状根生长量到达,7.6g/L,(DW),，总黄酮合成量到达,850mg/L,NOTE,：,G:,葡萄糖；,S:,蔗糖,植物组织器官培养生产代谢产物,第31页,G,A,3,（赤霉素）对水母雪莲毛状根侧,根产生有强烈促进作用，GA,3,浓度为,0.5mg/L时，毛状根生长量到达,9.1g/L(DW)，是基础培养条件下1.2,倍;总黄酮合成量到达936mg/L。,0.5mg/LGA,3,和0.5mg/LIBA（3-吲哚丁,酸）组合对毛状根生长和总黄酮合成,最有利，生长量为12.6g/L(DW)，比基,本培养条件时提升了70%;总黄酮合成,量为1287mg/L。,NOTE：NAA(萘乙酸)；,IBA(3-吲哚丁,酸)；,IAA（吲哚乙酸）；,BA（6-苄氨,基嘌呤）,植物组织器官培养生产代谢产物,第32页,植物组织器官培养生产代谢产物,第33页,植物组织器官培养生产代谢产物,第34页,植物组织器官培养生产代谢产物,第35页,植物组织器官培养生产代谢产物,第36页,结论,上节例子反应器悬浮培养细胞：,3.0%,黄酮,植物组织器官培养生产代谢产物,第37页,3.讨论,现实状况：,当前转化成功毛状根植物有200各种，,但怎样使其规模化生产有用次生代谢产,物报道较少。,课堂讨论题：,你认为植物毛状根培养最大限制或问,题在哪里？,植物组织器官培养生产代谢产物,第38页,毛状根生产次级代谢产物影响原因,当前制约毛状根在药用植物有效成份生产中应用,主要原因：,毛状根诱导率,毛状根发酵培养技术：一些物理原因(如光强、,温度)和化学原因(如培养基、碳源、氮源、激素,、前体、诱导子等)均会对毛状根增殖和次生,代谢物质合成产生影响。,生物反应器,生物合成路径不清楚,植物组织器官培养生产代谢产物,第39页,（,1,）生物原因,毛状根诱导及高产单克隆根系筛选：,A不一样诱导对象,B不一样诱导方法,C生长速度、特征（比如：结团性、耐受剪切力）,D产物含量,E稳定性,植物组织器官培养生产代谢产物,第40页,（,2,）化学原因,A碳源：,作为供给毛状根碳源糖类较多，但对不一样,单糖、双糖怎样影响毛状根生长及其产物合成了,解较少。,对于甜菜毛状根，蔗糖能够快速被利用，其次,为麦芽糖；葡萄糖只能被有限地利用；果糖、乳,糖、半乳糖、木糖、甘油既能抑制毛状根生长，,也能抑制甜菜色有合成。,植物组织器官培养生产代谢产物,第41页,B氮源：,常采取无机氮源主要是硝酸盐和铵。硝酸,盐和铵对毛状根生长及其次生代谢产物合成产生,较为主要调控作用，所以硝酸盐和铵百分比、,总添加量、添加时间对毛状根影响值得研究。,植物组织器官培养生产代谢产物,第42页,C激素：,对根生长产生影响，激素也影响到根中乙烯,生物合成。,激素与T-DNA区基因相互作用也起到很大作,用，比如：发根(rol)基因控制激素代谢和生理代,谢，而激素又刺激rol基因表示.,植物组织器官培养生产代谢产物,第43页,D诱导子：,诱导子,(elicitors)主要是引发植物产生过,敏反应物质，因为诱导子能引发植物休内特殊,次生代谢物积累，所以被用于毛状根培养。,植物组织器官培养生产代谢产物,第44页,E前体：,添加对应前体可能会增加产物产量，如甜,菜毛根合成甜菜色苷代谢过程最终一步主要,由甜菜醛氨酸与氨基酸合成了甜菜色苷，所以添,加氨基酸对提升甜菜色苷产量有帮助。,植物组织器官培养生产代谢产物,第45页,F过氧化物酶：,毛状根中一些过氧化物酶类与次生代谢产,物降解有着亲密联络，怎样减低这类氧化酶,活性从而提升次生代谢产物在毛状根中积累,量是值得关注又一热点。,植物组织器官培养生产代谢产物,第46页,（,3,）物理原因,A光质：,可见光包含不一样波长光线，所以应该考虑光,源对毛状根生长和合成次生代谢产物产生影响。,比如：在660nm波长光线下，青篙毛状根干,重和青篙素含量都到达最大。光敏色素在红光照,射下成为激活状态，使得一些酶酶活发生改变，,次生代谢产物合成路径因而受到调整。,植物组织器官培养生产代谢产物,第47页,B温度：,因为正常植物一天当中受到不一样温度、光,强度影响，次生代谢改变可能会很大，所以,研究温度模式对毛状根生长和次生代谢影响则,显得较为主要。,高丽参毛状根研究表明，20,(白,天)/13,(夜晚)处理，高丽参毛状根生物量以,及人参皂苷产量到达最大。,植物组织器官培养生产代谢产物,第48页,（,4,）毛状根培养生物反应器,毛状根外型像毛发，轻易交织缠绕。毛状根,特点决定了用于毛状根培养生物反应器需要,特殊设计。,比如：反应器内部需要特殊设计满足毛状根,空间分布均匀性问题。同时，也要提供合,适培养液循环与气体供给方式才能满足毛状,根对营养和气体需求，还要考虑接种、取样,、收获、生物量检测等特殊问题。,植物组织器官培养生产代谢产物,第49页,传统反应器改造,在搅拌式反应器中用丝网把毛状根与叶轮隔开，,防止了叶轮剪切力影响。,在鼓泡塔反应器中增加大量喷头，提升了充,氧效率。,植物组织器官培养生产代谢产物,第50页,新型反应器设计,:,超声雾化反应器,1,生物反应器,2,中心筒,3,不锈钢筛网,4,空气出口,5,时间继电器,6,雾化头,7,培养液,8,空气入口,9,空气过滤器,10,流量计,11,电磁阀,12,空气储罐,13,雾化装置,14 40W,日光灯,植物组织器官培养生产代谢产物,第51页,（,5,）培养方式,A两段培养方法：,早期在采取低剪切力预培养方法能够提升,毛状根对高剪切力适应能力，从而增加生物量，,提升次生代谢产物产量。,B两相培养：,加提取剂经常能够促进产物生成，有利于,产物回收并抵消反馈抑制。比如：经过添加疏水,性树脂，丹参毛状根生物量增加了3倍，丹参酮产,量增加了15倍，而且添加X一5树脂能够回收,76.5%丹参酮。,植物组织器官培养生产代谢产物,第52页,四,植物细胞与组织器官培养制,备次级代谢产物比较,植物组织器官培养生产代谢产物,第53页,植物组织器官培养生产代谢产物,第54页,本节回顾与讨论,问题1：与细胞培养路径相比，为何要进,行组织器官培养制备次级代谢产物？,问题2：毛状根培养制备次级代谢产物影,响原因与调控方法？,植物组织器官培养生产代谢产物,第55页,本节补充阅读文件,植物组织器官培养生产代谢产物,第56页,第1次大作业,查找我国外文件，分析讨论影响紫杉醇,（或长春新碱、紫草宁等）生产影响因,素与对策。,要求：不少于字，综述格式。,时间：2周时间。4月29号上课交。,植物组织器官培养生产代谢产物,第57页,下节课内容,动物细胞培养生物制药,预习思索题：,动物细胞培养生物制药与植物细胞培养生,物制药有哪些不一样之处？,植物组织器官培养生产代谢产物,第58页,