上海交通大学附属新华医院--王连升博士-蛋白电泳在临床中的应用PPT课件.pptx

临床蛋白床蛋白电泳泳应用与解析用与解析王王连升升 博士博士2013-12-192013-12-19 1-主要内容主要内容血清蛋白血清蛋白电泳泳免疫固定免疫固定电泳泳尿蛋白尿蛋白电泳泳脑脊液蛋白脊液蛋白电泳泳-琼脂糖凝胶电泳原理-+蛋白加样位置阴极阳极0-+-电场作用力-正常血清蛋白电泳图谱 -2-2 巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白白蛋白GammaBetaAlpha-2Alpha-1免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白C3C3补补体体体体-1-1抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶结结合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白转铁转铁蛋白蛋白蛋白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白-1-1 酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白血血血血红红素素素素结结合合合合蛋白蛋白蛋白蛋白-+q 临床疾病的识别qq炎症炎症炎症炎症q肝病q肾病qq“M”蛋白的蛋白的蛋白的蛋白的筛查筛查及定量及定量及定量及定量q对疑似骨髓瘤患者检测单克隆免疫球蛋白q早期检出无症状的骨髓瘤患者q对骨髓瘤疾病进行随访及疗效观察血清蛋白电泳的临床应用-免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白C3C3补补体体体体 -1-1抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶结结合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白转铁转铁蛋白蛋白蛋白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白-1-1 酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白 -2-2 巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白血血血血红红素素素素结结合合合合蛋白蛋白蛋白蛋白急性期反急性期反急性期反急性期反应应蛋白蛋白蛋白蛋白电泳图谱-急性炎症PN6-电泳图谱-慢性炎症免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白C3C3补补体体体体 -1-1抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶结结合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白转铁转铁蛋白蛋白蛋白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白-1-1 酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白 -2-2 巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白血血血血红红素素素素结结合合合合蛋白蛋白蛋白蛋白7-电泳图谱-肝脏肝肝脏是血清蛋白合成的主要器官是血清蛋白合成的主要器官白蛋白GammaBetaAlpha-2Alpha-1免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白C3C3补补体体体体-1-1抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶结结合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白转铁转铁蛋白蛋白蛋白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白-1-1 酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白 -2-2 巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白血血血血红红素素素素结结合合合合蛋白蛋白蛋白蛋白8-电泳图谱-肝病9-NP电泳图谱-肝硬化Beta-Gamma桥beta区：多克隆IgAgamma区：多克隆IgG10-电泳图谱-肾病肾小球滤过屏障损伤 白蛋白流失 低白蛋白 高-2贾晓辉,马彧旻.齐齐哈尔医学院学报.2009,30(16):2015Alpha-2巨球蛋白11-NP总蛋白浓度降低(低于60g/l)电泳图谱-肾病综合征12-原因原因:免疫缺陷病、免疫抑制剂、游离轻链病电泳图谱-低免疫球蛋白NP13-电泳图谱-高免疫球蛋白原因原因:慢性感染、自身免疫病、慢性肝病、慢性肉芽肿NP14-血清蛋白电泳图谱常见类型图谱类型型 总蛋白蛋白Alb 1 2 低蛋白血症 NN N急性炎症/急性急性时相反相反应 NN /N慢性炎症型 弥漫性肝损害N 肝硬化N NN-桥肾病 不定 弥漫宽球蛋白血症型N M蛋白血症型 在2-区出现异常异常异常异常峰高2（）球蛋白血症 妊娠（高型）N N蛋白质缺陷个别区带出现特征性缺乏 15-多克隆 Igs单克隆Ig-“MMMM”蛋白正常异常什么是M蛋白单克隆浆细胞恶性性增殖产生的均一蛋白“M”Multiple Myeloma多发性骨髓瘤Macroglobulinemia巨球蛋白血症Malignantlymphoma恶性淋巴瘤MonoclonalGammapathies单克隆丙种球蛋白病电泳曲线：异常异常峰峰-恶性浆细胞增殖恶性浆细胞增殖仅次于白血病（血液肿瘤）仅次于白血病（血液肿瘤）发病率发病率占所有肿瘤的占所有肿瘤的12%12%，血液肿瘤的，血液肿瘤的10%10%美国：白人美国：白人 4/104/10万；黑人万；黑人 10/1010/10万万欧洲：欧洲：2.53.0/10 2.53.0/10万万亚洲：亚洲：12/10 12/10万万中国：无确切数据中国：无确切数据发病年龄发病年龄老年病，随年龄老年病，随年龄发病率发病率欧美：高峰欧美：高峰 65706570岁，中位年龄岁，中位年龄 6868岁岁中国：高峰中国：高峰 55655565岁，中位年龄岁，中位年龄 5757岁岁男女比例男女比例 男：女男：女=3:2多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma MM)n临床特征p缺乏特异性缺乏特异性临床表床表现n骨痛、病理性骨折：最常最常见n肾功能受损、肾衰n贫血n血钙水平异常n免疫功能失调，感染n心、脑脏器微循环障碍，心脑血管病变p多学科n 骨科、感染科、呼吸科、内分泌n肾内科、泌尿科、心内科、神经科、消化科多发性骨髓瘤临床表现/并发症-多发性骨髓瘤病人溶骨报告多发性骨髓瘤临床表现/并发症C CalciumalciumR RenalenalA AnemianemiaB BoneoneCRAB21-多发性骨髓瘤现状晚晚骨折骨折预后差后差增加增加负担担感染感染发生率高生率高肾脏病病变不可逆不可逆死亡率死亡率 就就诊晚晚2/3 确诊时已达中晚期误诊率高率高1/3 非血液科首诊60%-1557例多发性骨髓瘤误诊分析62024424411856291223309骨科肾内科血液科误诊率：率：65.17%重重视实验诊断断39.8%15.6%19.8%7.6%15.6%-实例-1患者信息患者信息性性别：女：女年年龄：69首次就首次就诊科室：骨科科室：骨科诊断：多断：多发性骨髓瘤性骨髓瘤-实例-2患者信息患者信息性性别：女：女年年龄：69科室：消化内科科室：消化内科诊断：慢性胃炎断：慢性胃炎-实例-3患者信息患者信息性性别：女：女年年龄：73科室：中医科科室：中医科诊断：断：贫血？血？-多发性骨髓瘤及瘤前病变M蛋白骨髓克隆性浆细胞/浆细胞瘤ROTI有症状MM 10%无症状MM(冒烟型,SMM)10%瘤前病瘤前病变意义未明M蛋病 MGUS2)窄的条带，通常比较微弱。由于个别免疫球蛋白克隆增生。Ig G型寡克隆型寡克隆电泳泳图谱IF血清蛋白免疫固定电泳应用 特殊情况寡克隆条带在以下情况时常会出现:骨髓或者器官移植风湿性关节炎干燥综合症红斑狼疮治疗引起的免疫缺陷病毒:HIV,病毒性肝炎,EBV,CMV细菌和寄生虫感染:脑膜炎,脑炎*自体免疫疾病*感染引起的免疫缺陷-何时进行免疫固定电泳检测血清蛋白电泳出现血清蛋白电泳出现M蛋白蛋白原因不明的丙种球蛋白偏低原因不明的丙种球蛋白偏低患者有高骨髓瘤风险患者有高骨髓瘤风险(老年、老年、性别、性别、病史、病史、骨痛骨痛)血清电泳结果正常，但患者有骨髓瘤、轻链沉淀病、血清电泳结果正常，但患者有骨髓瘤、轻链沉淀病、淀粉样病变等疾病临床症状淀粉样病变等疾病临床症状 轻链轻链病病病病血清蛋白免疫固定电泳特殊病例免疫固定免疫固定结果果显示示为单独的独的 成分成分血清：游离血清：游离轻链尿液：尿液：本周氏蛋白本周氏蛋白42-本周氏蛋白1844年Henry Bence Jones 在一个骨髓瘤患者尿尿尿尿中发现一种具有特殊凝溶特殊凝溶特殊凝溶特殊凝溶性质的蛋白4060发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀轻链二聚体大多数骨髓瘤患者骨髓瘤患者骨髓瘤患者骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白43-浆细胞增生症胞增生症影响影响血液中出血液中出现游离游离轻链尿液中出现起因起因结果果骨髓瘤巨球蛋白血症CLL慢性白血病MGUS.肾小管损伤淀粉样病变轻链沉淀病本周氏蛋白44-正常免疫球蛋白的合成 18分钟10分钟浆细胞一条重链一条轻链组合一分子免疫球蛋白过剩轻链肾小球滤过10%在肾小管分解代谢80%重吸收10%随尿排出-异常免疫球蛋白的合成 18分钟10分钟恶变的浆细胞一种重链一种轻链组合单克隆免疫球蛋白大量过剩轻链肾小球滤过本周氏蛋白尿本周氏蛋白尿肾毒性、异常沉毒性、异常沉积-本周氏蛋白阳性患者多表现为肾脏损害极易极易误诊为慢性肾炎轻链有3种形式出现在血清或尿中正常的轻链过剩 慢性肝病、红斑狼疮等多克隆增殖性疾病伴随轻链单一轻链47-901004060室温室温本周氏蛋白检测方法热沉淀反应法48-本周氏蛋白检测方法-尿液的免疫固定电泳重重重重链链参考泳道参考泳道参考泳道参考泳道复合复合复合复合轻链轻链游离游离游离游离轻链轻链49-本周氏蛋白检测结果解析游离游离lamdalamda复合复合kappakappa游离游离lamdalamda50-本周氏蛋白电泳的临床意义浆细胞病的诊断和治疗监测某些情况下，特某些情况下，特别是是对轻链型的型的M蛋白，比血蛋白，比血清免疫固定清免疫固定电泳更加敏感泳更加敏感因为游离轻链的分子量比较小（2550KDa）更容易通过肾脏清除进入尿液中，从而在尿中被检测到-病人甲，女，29岁，蛋白尿肾内科就诊。SDS尿蛋白电泳：100肾小球性蛋白尿总轻链定量：5.95mg/dl(05.10)70.10mg/dl（0-5.0）；血清蛋白电泳和免疫固定电泳未见单克隆蛋白临床病例血清免疫固定电泳（阴性）-临床病例尿免疫固定电泳（L轻链）尿免疫固定电泳可见轻链型M蛋白骨髓涂片：可见骨髓瘤细胞该病人确诊为轻链型多发性骨髓瘤53-国际骨髓瘤基金会 2013推荐的M蛋白早期筛查流程尿蛋白尿蛋白检测-肾病病55-肾病的临床特征隐匿性发病就诊晚早期就诊率仅20-30%部分患者首诊即终末期发病率逐年增加高血压、糖尿病自身免疫病，肾小球肾炎肾功能衰竭是共同终点慢性慢性慢性慢性肾肾病已病已病已病已经经成成成成为为沉重的社会和家庭沉重的社会和家庭沉重的社会和家庭沉重的社会和家庭负负担担担担-57蛋白与蛋白与肾脏生理生理蛋白与肾脏生理白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白微量免疫球蛋白，转铁蛋白，白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白 肾小球滤过白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白肾小管重吸收微量免疫球蛋白，转铁蛋白，白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白尿液-肾性蛋白尿的肾脏排泄示意图鉴别肾单位病变部位的蛋白标志物指标：分子量分子量大小分子量蛋白鉴别标准白蛋白：67KDa大分子量蛋白肾小球损伤小分子量蛋白肾小管损伤-琼脂糖电泳在肾病中的应用尿本周氏蛋白尿本周氏蛋白电泳泳尿尿SDS蛋白蛋白电泳泳60-HYDRAGEL5PROTEINURIE 主要的尿蛋白电泳条带区域分析起源于肾小管的各类蛋白(分子量 67 kDa)白蛋白(分子量:67 kDa)a1-微球蛋白(MW:33kDa)游离轻链(MW 25 kDa)转铁蛋白(MW:80kDa)Cystatin(MW:11kDda)b2-微球蛋白(MW:12kDa)溶菌酶(MW:15kDa)视黄醇结合蛋白(MW:21kDa)游离轻链的二聚体(MW 50 kDa)IgG(MW:160kDa)IgA(MW:165kDa)结合珠蛋白加样位置a2-巨球蛋白(MW:900kDa)SDSSDS+-分子筛原理：分子量排列原理：分子量排列原理：分子量排列原理：分子量排列SDS：十二：十二烷基磺酸基磺酸钠SDS尿蛋白电泳图谱SDSSDS+-分子量标记(kDa)14.430436794低分子量(67kDa)白蛋白(67kDa)分子筛62-病因糖尿病感染性损伤(细菌感染,乙肝患者,水痘,梅毒,单核白血球增多症,)其他系统性疾病(自动免疫系统,癌症,)中毒现象(重金属,药物中毒,)白蛋白和大分子量蛋白白蛋白和大分子量蛋白肾小球性蛋白尿-肾小球性蛋白尿67kDa肾小管性蛋白尿肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力(小于67kDa的蛋白)产生原因遗传原因(Fanconissyndrome,Bartlerssyndrome)代谢性疾病(糖尿病,草酸中毒)免疫球蛋白单克隆扩增(myeloma,Waldenstrm)药物作用(氨基甙类抗生素)中毒(金属中毒,氨基甙类)67 kDa 67 kDa 67 kDa-67 kDa 67 kDa 67 kDa肾小管性蛋白尿混合性蛋白尿67kDa 67kDa 67kDa-SDS尿蛋白电泳图谱分析68-69-SDS尿蛋白电泳15号样本BJ电泳尿蛋白电泳的联合应用尿本周氏蛋白电泳游离游离kappakappa尿蛋白检测到游离轻链70-SDS非浓缩尿蛋白电泳检测的优势1.敏感性高：检测限为15mg/L2.标本收集：随机尿，无需浓缩(推荐晨尿)3.检测结果尿蛋白的全貌直观反映肾脏受损部位对不愿意进行肾穿检查的病人,可作为替代实验4.动态观察：对确诊或不典型患者可进行动态观察-SDS尿蛋白电泳、本周氏蛋白检测对象血尿、浮肿尿量改变(增加或减少)不明原因水肿尿蛋白尿蛋白尿蛋白尿蛋白阳阳阳阳性性性性血清蛋白电泳提示“MM蛋白”尿SDS蛋白电泳提示“轻链轻链”存在尿沉渣异常高血压、糖尿病、自身免疫病患者骨髓瘤患者。-脑脊液脊液电泳泳73-脑脊液（CSF）介绍脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下隙内的一种无色透明液体功能在中枢神经系统起着淋巴液的作用供应脑细胞一定的营养运走脑组织的代谢产物调节着中枢神经系统的酸碱平衡缓冲脑和脊髓的压力，具有保护和支持作用-病理性脑脊液蛋白产生机制渗透-血液-脑脊液屏障（血脑屏障，BBB）通透性增加 鞘内合成 -免疫球蛋白合成两种机制并存-常见的5种图型 正常正常IgG鞘内合成鞘内合成IgG 鞘内合成鞘内合成无鞘内合成无鞘内合成无鞘内合成无鞘内合成(但是有但是有单克隆克隆)-结果判读无鞘内合成，无渗透无鞘内合成，无渗透79-出出现鞘内合成鞘内合成（脑脊液泳道有条脊液泳道有条带，对应血清条血清条带位置没有条位置没有条带）结果判读 单克隆条克隆条带，来源于血清，来源于血清，渗透，渗透结果判读脑脊液等电聚焦电泳的特点遵循国际脑脊液(CSF)检测标准非常简便、省时、可靠拥有极好的分辨率、极好的灵敏度(大约300mg/L)和很好的实验重复性82-小结血清蛋白电泳的应用炎症、肝病、肾病、M蛋白免疫固定电泳M蛋白的类型鉴定多发性骨髓瘤及瘤前病瘤前病变患者的随访尿电泳检测本周氏蛋白电泳SDS尿蛋白电泳脑脊液电泳病理性蛋白的来源-电泳技术的发展历程18091809年年发现电发现电泳泳现现象象19371937年年建立了界面建立了界面电电泳技泳技术术19481948年年诺贝尔诺贝尔化学化学奖奖19501950年后年后区区带电带电泳从泳从发发展到成熟展到成熟19801980年年 毛毛细细管管电电泳技泳技术术20012001年年sebiasebia首次推出全自首次推出全自动动毛毛细细管管电电泳泳仪仪1919世世纪纪2121世世纪纪sebiasebia84-Capillarys Electrophoresis Principle正极负极检测器氘光源 200 nm约1万伏高压毛细管(内径25微米）进样-+温控装置电泳方向毛细管电泳工作原理-毛细管电泳的特点液相电泳全自动化高分辨率高清晰度高敏感度高速度-毛细管血清蛋白电泳图谱白蛋白GammaBeta-2Beta-1Alpha-2Alpha-1免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白C3C3补补体体体体-1-1抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶结结合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白合珠蛋白转铁转铁蛋白蛋白蛋白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白-1-1 酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白酸性糖蛋白 -2-2 巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白血血血血红红素素素素结结合合合合蛋白蛋白蛋白蛋白-微量单克隆免疫球蛋白(M蛋白)的检测微量微量M蛋白蛋白gamma 区：曲区：曲线异常异常89-Thanks王王连升升电话：[phone]邮箱：箱：祝大家新年快祝大家新年快乐90-