基于中红外技术柑橘黄龙病检测研究.pdf

2023，32（3）福建分析测试Fujian Analysis&Testing基于中红外技术柑橘黄龙病检测研究吴联巍（福建省测试技术研究所，福建福州350003）收稿日期：2022-12-19作者简介：吴联巍（1991），男，助理工程师，从事有机分析工作，Email：摘要：本文基于中红外技术，对完整叶片ATR法、粉末混合溴化钾透射法、粉末压片ATR法三种制样-光谱采集方式应用于柑橘黄龙病的检测进行对比研究。采集健康与染病的柑橘植株叶片的红外光谱，利用MATLAB软件和TQ Analyst软件进行分类分析。结果表明：采用粉末压片ATR法采集的红外谱图有最好的分类效果，且分类正确率最高可达到100%，可用于柑橘黄龙病的准确检测。关键词：中红外光谱；柑橘；黄龙病；分类分析中图分类号：O657.3；S436.6文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）03-0014-06Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.03.03Detection of Citrus Huanglongbing Disease based on Mid-infrared SpectroscopyWu Lian-wei（Fujian Institute of Testing Technology，Fuzhou，Fujian 350003，China）Abstract:Based on mid-infrared spectroscopy，three sample preparation and spectral collection methods，namely ATRmethod for intact leaves，transmission method for the powder mixed with potassium bromide，and ATR method for the powder tabletting，were used to detect citrus Huanglongbing（HLB）disease.The infrared spectra of healthy and diseased citrusleaves were collected and classified by MATLAB software and TQ Analyst software.The results showed that the infraredspectrogram collected by ATR method for the powder tabletting had the best classification effect，and the highest classification accuracy could reach 100%，which could be used for the accurate detection of citrus HLB disease.Key words：mid-infrared；citrus；Huanglongbing disease；classification analysis柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是柑橘产业中一种毁灭性的病害，被称为柑橘的“癌症”。黄龙病病原菌通过柑橘木虱、人工嫁接等传播方式进入柑橘宿主。柑橘类植物感染黄龙病菌后虽不立即显症，但也同样具有极强的传染性，因此果园中一旦发生就会很快蔓延。而染病的植株则会出现叶子黄化、果实品质下降、树体经济寿命减短，最终导致植株死亡等现象。更严重的是，至今尚无有效治疗药剂和抗病品种，因此及时发现并挖除病株是保护果园、减少经济损失的唯一有效手段。目前，各国科学家对于柑橘黄龙病的确诊方法开展了一系列研究，传统的检测法主要有田间人工诊断法、核酸分子检测法以及化学染色法。田间人工诊断法是通过有经验的专家或者果农对柑橘叶片进行观察做出判断，这种方法依靠个人经验，可靠性较低，而且由于黄龙病感染初期叶片表面没有发生明显变化，局限性更加明显。核酸分子检测法是从植株中提取黄龙病菌的DNA，用PCR法进行确证1，这是目前最为可靠的确证方法。但是这种方法对设备要求高，耗时长，成本高，不便于推广使用。化学染色法是根据感染黄龙病致病菌后，柑橘植株的新陈代谢受到干扰，其组织结构和物质组成发生一系列变化，例如韧皮部被破坏、筛孔堵塞、蔗糖积累2，淀粉含量显著增加3等现象，利用淀粉和碘发生的颜色变化，Pedro Gonzalez等人4采集发黄、向阳、非断枝的叶片，发现在黄龙病柑橘叶片断面142023，32（3）生成棕色至黑色物质，健康的则没有明显变化，并以PCR为确证方法，达到了90%以上的正确率。近年来，基于光谱方法的黄龙病的检测研究也得到广泛关注，如高光谱法5、拉曼光谱法6、近红外光谱法7、中红外光谱法8-10等，通过获取柑橘叶片的光谱数据，对数据进行分析后，判断出所属植株是否感染黄龙病。这些方法在效率、精准性、经济性方面各有所长，近年来也不断得到发展和应用。其中，中红外光谱技术是利用分子的振动引起能级变化吸收特定波段红外能量的一种表征手段。利用中红外光谱技术对柑橘的黄龙病检测研究已经有不少案例。例如，Samantha A.Hawkins8将叶片研磨，比较了黄龙病与其他柑橘病叶片的红外谱图，着眼于700 cm-1 1765 cm-1区域，发现部分能够区分，另一部分则会发生混淆。Reza Ehsani等人9采集健康、缺素、黄龙病三类样本将柑橘叶片磨成粉后，用ATR模式获取红外谱图，对原始谱图、一阶偏导、二阶偏导谱图分别进行研究，用QDA和KNN两种算法进行分类，实现 95%以上分类正确率。Paulino Ribeiro Villas Boas等人10采集了健康、柑橘杂色褪绿病、黄龙病显症和黄龙病不显症四类样品，直接用新鲜的叶片用于ATR测试，分类平均正确率在90%以上。然而，现有的基于中红外光谱检测黄龙病的相关研究不是很完备，一方面，对于柑橘叶片的制备方法对实验结果的影响缺乏系统研究，另一方面，对于健康和染病样品的分析也多基于计算机编程方法，对于一般技术人员而言难以掌握，不利于方法推广应用。本研究旨在优选出制样方法，提升采集红外谱图的质量，再利用简便的谱图分析软件建立分类模型，优化参数，实现红外光谱法对柑橘黄龙病的便捷检测。1材料与方法1.1实验材料所有柑橘树叶采集自福建省古田县某柑橘果园，选取健康和黄龙病（通过PCR方法确认）的植株各10棵，在同一棵树上采集成熟叶片4片作为一份样本，每棵树采集23份样本，共有健康和黄龙病样本各25份。1.2实验仪器JXCL-3K三维冷冻样品研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），ATR附件的晶体为金刚石，仪器自带谱图采集与处理软件OMNIC；TQ Analyst 9光谱分析软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）。1.3实验方法1.3.1样品制备将采集到的健康和黄龙病新鲜树叶，放入70 C烘箱内干燥24 h，即为完整叶片样品。去除主叶脉后装入 5 mL 离心管中，加入 5 颗锆珠（直径为2.8-3.0 mm），用JXCL-3K研磨仪研磨三次，每次50 s，60 Hz，即可得到粉末状样品。1.3.2红外光谱采集完整叶片ATR法：直接将完整叶片样品放置在ATR附件的晶体表面，以空气作为背景进行光谱采集；粉末混合溴化钾透射法：取约5 mg粉末状样品与适量溴化钾混合，研磨后压制成锭片，以空气作为背景进行光谱采集；粉末压片ATR法：取适量粉末状样品压制成薄片，将薄片放置在ATR附件的晶体表面，以空气作为背景进行光谱采集。所有方法采集的波数范围4000 cm-1 600 cm-1，分辨率4 cm-1，采集次数 16次。使用 ATR模式时，采集到原始谱图后采用高级ATR变换，晶体设置为金刚石，折射率设为1.5。1.3.3模型的建立与数据统计（1）使用MATLAB R2017b软件进行模型建立，分别用线性判别分析（LDA）、支持向量机（SVM）、K最邻近法（KNN）三种算法，采用5折交叉验证评估模型性能。样本分为健康和黄龙病两个类别，两个分类各有25份样本，共有50份样本。50份样本平均分成5个子样本，一个单独的子样本被保留作为验证模型的数据，其他4个样本用来训练。交叉验证重复5次，每个子样本验证一次。将5次验证的正确率取平均值作为该算法的分类正确率。（2）使用TQ Analyst 9软件中的判别分析模块，同样进行5折交叉验证。在一组实验中，健康和黄龙病两个类别各有25份样本，共有50份样本。每次分别有40份样本作为训练样本，10份样本作为验证样本，共进行 5次，直至每份样本经历一次验证。将5次实验的正确率取平均值作为该组分类正确率。吴联巍：基于中红外技术柑橘黄龙病检测研究152023，32（3）福建分析测试研究报告2结果与分析2.1三种谱图采集方式比较分别采用完整叶片ATR法、粉末混合溴化钾透射法、粉末压片ATR法三种制样-光谱采集方式，示意图如图 1 所示。图 2 对比的是在同一采集方式下，对同一样本在同一条件下连续三次采集谱图。图2a可以看出，当采用完整叶片ATR法谱图采集方图1健康与黄龙病柑橘树叶照片及三种不同制样-光谱采集方式示意图图2同一样本在三种不同光谱采集方式下的光谱重复性比较式时，三张谱图吸光度变化不大，但是总体的重复性不好。例如在3306 cm-1处吸收峰的强弱排序依次为 1-2-3，但是在 1200 cm-11100 cm-1波数吸收峰的强弱排序为1-3-2。这种吸收峰强度的反转可能源自叶片表面的凹凸不平或者物质组成的不均匀。图2b是采用粉末混合溴化钾透射的模式采集的谱图，三张谱图的吸光度差异较大，这是由于添加的样本粉末量难以精准控制，同时研磨后样本粉末在锭片中的分布不均匀，吸光度有一定随机性。对三张谱图进行吸光度归一化变换时，发现三张谱图几乎重合，也就意味着峰峰之间的相对强度是不变的。图2c是粉末压片ATR的模式，三张谱图接近重合，展现出良好的重复性。进一步对比三种采集方式的谱图，可以看出粉末混合溴化钾透射法和粉末压片ATR法两种方式的吸收峰波数和峰形基本一致，而与完整叶片ATR法却有明显不同，例如在完整叶片ATR法中，2925 cm-1，2854 cm-1附近代表亚甲基的对称与非对称伸缩振动的吸收峰与1054 cm-1附近代表多糖的吸收峰强度10相当，而在粉末混合溴化钾透射法和粉末压片ATR 法两种方式下，2925 cm-1，2854 cm-1附近吸收峰比1054 cm-1附近吸收峰强度小得多。这是由于完整叶片 ATR 法中，ATR 晶体附件与叶片表面接触，叶片表面覆盖的蜡质中脂肪烃和脂类物质成分占比高11，因而亚甲基峰较强，而在经过研磨粉碎之后重新压片，叶片内部的物质（主要为多糖类物质）获得了暴露在表面的机会，因此多糖吸收峰显著增强。使用OMNIC软件，分别计算所有样本光谱的上述两个位置的峰面积作为吸光度的值A2925、A1054，再将每张谱图的两个吸光度值相除，分别求算得到平均数和标准差，统计得到表1。之所以选择这连个位置的吸光度作为研究对象，是因为A2925代表亚甲基的吸收，植物叶片的有机物基本都有亚甲基的吸收，因此A2925可以近似认为是叶片所有有机物的某种平均吸收；A1054代表多糖类物质吸收，如果淀粉含量增加，则此处吸光度也会增强。在完整叶片ATR法中，健康与黄龙病样本的A1054、A2925、A1054/A2925均出现了显著差异（P0.05）。在粉末压片ATR法中，健康和黄龙病样本在2925 cm-1附近吸光度没有明显差异，但是在1054 cm-1处及A1054/A2925出现了明显差异（P0.05），黄龙病样本在此处的吸光度要明显大于健康样本。这与此前的研究结果相符合，即在162023，32（3）黄龙病植株的叶片中发生了淀粉富集的现象10。在粉末混合溴化钾透射法中，尽管吸光度的绝对值上与粉末压片ATR法相去甚远，但是A1054/A2925值却依然得到类似的结果。这也意味着对于健康和黄龙病植株的叶片，淀粉含量的差异可以通过中红外光谱表现出来。2.2MATLAB软件建立分类模型通过比较吸光度的方式，确实可以将健康和黄龙病的叶片区分，从而实现黄龙病的快速诊断。但是对于批量的样本，计算峰面积的方式效率低下而且无法处理临界状态的光谱。因此，有必要建立模型以提升分析的效率和准确度。在过去的研究中，研究者们常用计算机编程建立分类模型的方式进行分析。常见的有监督的分类模型有线性判别分析（LDA）、支持向量机（SVM）、K 最邻近法（KNN）等。使用MATLAB软件建立分类模型，如表2所示，取得了较好的分类正确率。表2不同采样方法和算法模型下分类正确率谱图采集方法完整叶片ATR法粉末混合溴化钾透射法粉末压片ATR法不同算法模型分类正确率LDA86%96%100%SVM88%94%100%KNN（K=3）86%94%100%均值87%95%100%通过比较行内数据，不难看出，所用三种算法的表现没有明显差异。比较行间数据，粉末压片ATR法要优于粉末混合溴化钾透射法，且同时优于完整叶片ATR法。2.3TQ Analyst软件建立判别分析模型采用计算机编程的方式进行分类分析，能够比较多种算法间的优劣，参数调整范围大，是科研工作者的首选方式。但是对于普通的面向应用的技术人员而言，编程的方式太过复杂，因此不利于推广应用。本研究采用的商业化软件TQ Analyst，是一款简便实用的光谱分析软件，内置的判别分析模型与上述线性判别分析（LDA）算法原理基本一致，调整模型参数如波数范围，得到的模型分类结果如表3所示。首先比较表2与表3之间的数据，可以看出采用TQ Analyst软件同样可以取得较好的模型分类正确率，并且在采集方法的对比中也有一致的结果，即粉末压片ATR法要优于粉末混合溴化钾透射法，且同时优于完整叶片ATR法。其次比较不同波数下模型分类正确率。不同波数范围的红外光谱对应不同的官能团吸收，从而影响分析结果。使用TQ Analyst软件能够方便地选取一个或多个波数范围用以建立模型。分类结果表明在1800 cm-1 600 cm-1下模型的分类正确率最高，4000cm-1 600 cm-1和1500 cm-1 600 cm-1波数下模型正确率稍低。表3不同分析波数下模型分类正确率谱图采集方法完整叶片ATR法粉末混合溴化钾透射法粉末压片ATR法不同分析波数下模型分类正确率4000cm-1600 cm-174%94%100%1800 cm-1600 cm-182%100%100%1500 cm-1600 cm-170%96%100%在对红外光谱等多维数据进行分类分析时，常采用主成分分析法（PCA）降低数据维度，提高计算效率。同时通过观察主成分在低维空间的分布，可以直观地比较两类样品是否容易区分。线性判别分析就是通过找到合适的截面将两类样本区分，达到分类的目的。TQ Analyst 软件提供了PCA分析及查看主成分投影的功能。如图3所示，黑色点代表健康样本，灰色代表的是黄龙病样本。图3a是完整表1样本的红外光谱在2925 cm-1，1054 cm-1附近吸光度比较谱图采集方法完整叶片ATR法粉末混合溴化钾透射法粉末压片ATR法样本种类健康黄龙病健康黄龙病健康黄龙病A29254.821.502.560.7520.175.4420.377.654.840.645.030.66A10543.531.162.641.0669.4019.0585.7232.6114.381.6820.492.69A1054/A29250.820.381.040.253.430.114.210.192.980.164.090.36吴联巍：基于中红外技术柑橘黄龙病检测研究172023，32（3）福建分析测试研究报告叶片ATR法，可以明显看到无论如何划分截面，黑色点和灰色点总是不能完全区分开来，这也是导致其正确率较低的原因。图3b展示的是粉末混合溴化钾透射法中两类样品的分布情况，基本上还是按类聚集，但是个别黑色点和灰色点靠得较近，有可能在分类中被错误划分。图 3c 展示了粉末压片ATR法中，健康和黄龙病样品在3个主成分下的空间分布，可以看出两类样本各自聚集，可以很好地用一个截面将其区分。图3三种光谱采集方式对应的主成分分析投影图对上述数据进行综合分析，粉末压片ATR法的判别正确率最高，可达100%。无论是对光谱的局部特征吸收峰进行分析，还是从主成分分析总体的角度来看，以健康和黄龙病两类样本作为划分，以粉末压片ATR的方式获得的红外光谱，具有最大的类内相似度和最小的类间相似度。这是由于健康和染病的样本的主要的化学物质区别是内部细胞的淀粉含量，通过研磨的方式，叶片内外的物质得以充分混合，所采集的光谱可以认为反映了整张叶片的平均化学组成。而当采用完整叶片ATR法时，一方面，由于叶片表面几何与化学结构不均衡，导致采集的光谱类内相似度降低；另一方面，由于ATR模式中光的入射深度仅有几个微米，导致光谱主要反映的是叶片浅层表面化学信息，叶片表面覆盖的蜡质层进一步阻碍了内部化学信息的表达11，健康与染病的淀粉类物质的差异性无法通过红外光谱体现。当采用粉末混合溴化钾透射模式，受样品颗粒空间分布浓度差异、锭片厚度不均一等制样因素影响，其类内相似度有所影响。基于上述原因，粉末压片ATR法有最好的分类效果，最适合用于中红外光谱检测黄龙病。3结论本文采用中红外光谱技术，对比研究了完整叶片ATR法、粉末混合溴化钾透射法、粉末压片ATR法三种制样-光谱采集方式对柑橘黄龙病检测结果的影响。结果表明，基于中红外光谱技术所获得的谱图，黄龙病样本在多糖类物质的特征吸收峰强度总是大于健康样本。采用粉末压片ATR模式的红外光谱重复性最好且分类效果最好，粉末混合溴化钾透射法次之，完整叶片ATR法最差。此外，基于红外光谱建立分类模型，使用TQ Analyst软件与使用MATLAB软件编程计算得到的分类结果相似，而TQ Analyst软件应用于柑橘黄龙病检测具备简便易操作的优点，有利于推广中红外光谱在柑橘黄龙病检测方面的应用。参考文献1 Tatineni，S.；Sagaram，U.S.；Gowda，S.；Robertson，C.J.；Dawson，W.O.；Iwanami，T.；Wang，N.，In Planta Distribution ofCandidatus Liberibacter asiaticusas Revealed byPolymerase Chain 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