孤独症谱系障碍实验模型研究进展.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 509 523Current Biotechnology ISSN 20952341进展评述进展评述Reviews孤独症谱系障碍实验模型研究进展方靖靖1，黄昆仑1，2，3*，仝涛1，2，3*1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，精准营养与食品质量重点实验室；教育部功能乳品重点实验室，北京 100083；2.农业农村部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室，北京 100083；3.食品质量与安全北京实验室，北京 100083摘要：孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一种典型的由遗传或/和环境因素引起的异质性神经发育障碍。ASD患者的主要特征是社交沟通障碍、语言沟通障碍和刻板行为。目前，ASD的发病机制尚不明确，缺乏有效的治疗方法。综述了近年来用于ASD研究的细胞模型和动物模型，包括PC12细胞、SH-SY5Y细胞、人诱导多能干细胞、淋巴母细胞系和原代神经元，以及非哺乳动物模型、产前丙戊酸暴露模型、BTBR特发性小鼠模型、母体免疫激活模型、基于ASD易感基因构建的啮齿类动物模型和非人灵长类动物模型，总结了现有的ASD细胞模型和动物模型的关键信息，重点阐述了各模型的优势、局限性、构建方法和重要注意事项，以期为探索ASD的发病机制和开发新的诊疗方法奠定基础。关键词：孤独症谱系障碍；细胞模型；非哺乳动物模型；啮齿类动物模型；非人灵长类动物模型DOI：10.19586/j.20952341.2023.0014 中图分类号：R749 文献标志码：AResearch Progress on Experimental Models of Autism Spectrum DisordersFANG Jingjing1，HUANG Kunlun1，2，3*，TONG Tao1，2，3*1.Key Laboratory of Precision Nutrition and Food Quality；Key Laboratory of Functional Dairy，Ministry of Education，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.Key Laboratory of Safety Assessment of Genetically Modified Organism（Food Safety），the Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100083，China；3.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing 100083，ChinaAbstract：Autism spectrum disorder（ASD）is a typical heterogeneous neurodevelopmental disorder induced by genetic or/and environmental factors.The main characteristics of ASD patients are social communication deficits，verbal communication disorders，and stereotyped behaviors.Currently，the pathogenesis of ASD is not clear，and there is a lack of effective treatment methods.This review focused on cell models and animal models used for ASD research in recent years，including PC12 cells，SH-SY5Y cells，human induced pluripotent stem cells，lymphoblastoid cell lines，and primary neurons，as well as non-mammalian models，prenatal valproic acid exposure models，BTBR idiopathic mouse models，maternal immune activation models，rodent models based on ASD susceptibility genes，and non-human primate models.We consolidated the key information on the available cell models and animal models of ASD and highlighted the advantages，limitations，construction methods，and important caveats of each model，which was expected to lay a foundation for exploring the pathogenesis and developing new diagnosis and treatment methods for ASD.Key words：autism spectrum disorder；cell models；non-mammalian models；rodent models；non-human primate models收稿日期：20230213；接受日期：20230417基金项目：北京市自然科学基金项目(7222249)；山东省自然科学基金青年基金项目(ZR2021QC118)；中国农业大学2115人才工程资助项目。联系方式：方靖靖 E-mail:；*通信作者：黄昆仑 E-mail:；仝涛E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一组以社交沟通缺陷、语言沟通障碍和刻板行为为特征的异质性神经发育障碍。世界卫生组织发布的最新报告表明，大约每100名儿童中就有1人患有ASD，且男性的患病率高于女性1。现有的科学证据表明，环境、遗传因素均能使儿童更容易罹患ASD。近年来，ASD患病率不断上升，不仅严重影响患者及其家庭的正常生活，还给社会带来巨大负担。尽管早期行为和教育干预可以在一定程度上改善ASD患者的表观症状，但目前ASD的发病机制尚不明确，针对ASD核心症状的有效治疗手段仍然非常有限。因此，迫切需要深入探究ASD的病因及病理生理过程，以期为开发ASD的临床诊疗措施提供理论依据。在过去的十年中，ASD的诊断体系不断发展，目前ASD的诊断主要依赖于临床观察和行为特征。精神障碍诊断与统计手册（第五版）（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，5th Edition，DSM5）定义了ASD诊断标准的2个核心领域，包括在多种情境下持续的社会沟通和社会互动障碍以及限制性、重复的行为、兴趣或活动模式。这些症状自患者幼儿期开始出现，并在当前的社会、职业或其他重要功能领域造成有临床意义的损害。此外，DSM5定义的这些障碍与智力障碍或全面发育迟缓无关2。目前对ASD的研究主要依赖于动物模型和细胞模型。成功可靠的实验模型是研究ASD的基石。截至目前，国内外各实验室成功构建的ASD细胞模型包括PC12细胞、SH-SY5Y细胞、人诱导多能干细胞、淋巴母细胞系和原代神经元等。成功构建的ASD动物模型包括非哺乳动物模型、产前丙戊酸（valproic acid，VPA）暴露模型、BTBR特发性小鼠模型、母体免疫激活（maternal immune activation，MIA）模型、基于ASD易感基因构建的啮齿类动物模型和非人灵长类动物模型等。文章重点介绍了上述细胞模型和动物模型的特点和构建方法，并总结了各模型的优缺点，以期为ASD相关研究提供线索和基础。1细胞模型近年来，细胞模型越来越多地应用于ASD的基础研究中。PC12细胞、SH-SY5Y细胞、hiPSCs、LCLs和原代神经元等是目前ASD研究中常用的细胞模型。ASD细胞模型的建立和应用可以弥补动物模型造模周期长、干扰因素多等局限，对ASD候选药物的研发和筛选具有重要意义。1.1PC12细胞PC12细胞为单克隆细胞系，由Greene和Tisehler从可移植大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤中提取3。PC12细胞是研究神经发育的标准细胞模型，常用于ASD、帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病的相关研究中。在ASD研究中，可以利用PC12细胞探索ASD易感基因的功能，包括神经连接蛋白-3（neuroligin-3，NLGN-3）、人第 10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（human phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）、Rab3相互作用分子3等基因。例如，He等4报道了 PTEN 与 PC12细胞的多巴胺功能障碍和异常行为相关。PTEN在ASD的发展过程中可能通过抑制 PI3K/CREB 通路降低酪氨酸羟化酶的表达水平，为ASD的治疗提供了潜在的治疗靶点。此外，PC12 细胞还被用于探索相关环境因素诱发ASD 的分子机制。孕期暴露于丙戊酸（valproic acid，VPA）、沙利度胺和酒精是 ASD的环境诱发因素，这些致畸物可能通过改变基因表达从而干扰大脑发育。Rout 等5研究了这 3 种化合物对PC12细胞模型中 50种不同转录因子的影响，研究结果表明GATA结合蛋白3基因表达的改变可能与ASD的发生有关。然而，PC12细胞也有其局限性。例如，在使用PC12细胞研究神经系统疾病的发病机制和药物作用机制时，应考虑到PC12细胞是一种肿瘤细胞，其形态和特征在多次传代后会发生变化。1.2SH-SY5Y细胞SH-SY5Y 细胞来源于人神经母细胞瘤细胞系，具有神经元样形态和生理特性。此外，SH-SY5Y细胞可以分化为皮质样神经元，是研究神经发育过程中神经表型和神经退行性疾病的良好细胞模型。在ASD的相关研究中，常利用SH-SY5Y细胞探索ASD易感基因的功能，筛选新的ASD易感基因。例如，据 Unsicker等6报道，SHANK2中一个或两个等位基因的移码突变可导致 SH-SY5Y细胞中神经元分化的改变，主要表现为细胞生长和510方靖靖，等：孤独症谱系障碍实验模型研究进展突触前/突触后蛋白表达的变化。SHANK2突变还影响细胞酪氨酸激酶受体下游的信号转导和淀粉样前体的表达。此外，有研究者利用SH-SY5Y细胞探索ASD发病的分子机制。Kalkan等7发现肿瘤坏死因子 可通过激活 Caspase-3凋亡级联诱导神经变性。对 SH-SY5Y细胞中甲基化区域的分析表明，SH-SY5Y细胞中高度甲基化区域的基因显著富集于钙离子信号、突触传递和神经元分化以及 ASD 候选基因，提示基因甲基化可能是ASD的病因之一8。SH-SY5Y 细胞模型也存在一定的局限性。例如，与 hiPSCs 等其他细胞模型相比，SH-SY5Y细胞不能用于观察神经发育过程。与原代神经元相比，未分化的SH-SY5Y细胞对神经毒素和神经保护药物的敏感性较低。1.3人诱导多能干细胞人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，HiPSCs）是一种类似于胚胎干细胞的细胞类型，由日本科学家Takahashi等9通过在分化的体细胞中引入Oct-4、Sox-2、Klf4和c-Myc 4种转录因子来重编程体细胞而获得。近年来，HiPSCs的发展为单基因突变或特发性突变ASD患者的神经发育或精神疾病建模，以及开发针对特定ASD患者的个体化医疗提供了全新的机会。HiPSCs常用于探索 ASD易感基因的功能及相关基因突变诱发 ASD 的分子机制。许多 ASD患者存在唐氏综合征细胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecules，DSCAM）基因突变，Lim 等10利用来自 ASD 患者的 HiPSCs 细胞模型发现，DSCAM突变可能通过损害NMDA受体功能导致ASD的相关表型。此外，HiPSCs还可用于开发ASD的潜在治疗方法。例如，Marchetto等11发现来自ASD患者的HiPSCs细胞增殖增加，表现出异常的神经发生和突触功能，而胰岛素生长因子1处理可以改善这些神经网络缺陷。Chiola等12提出HiPSCs本身也可以作为修复ASD患者受损脑回路的工具。Jong等13利用来自接触蛋白关联蛋白 样 蛋 白 2（contactin associated protein-like 2，CNTNAP2）突变的 ASD 患者的 HiPSCs 产生了前脑类器官，并研究了CNTNAP2突变对胚胎皮质发育的影响。上述结果提示，HiPSCs和脑类器官技术的发展为研究ASD的潜在机制和探索治疗途径提供了新思路。HiPSCs也存在一定的局限性，如不能观察到典型的病理表型。此外，在HiPSCs制备中使用的核心转录因子之一 c-Myc 已被证明是一种癌基因，可能导致细胞发生癌变，应用 HiPSCs 进行ASD相关研究时，应严格控制其致瘤风险。1.4淋巴母细胞系淋巴母细胞系（lymphoblastic cell lines，LCLs）亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫的重要指标，可总体反映机体当前的免疫功能和状态。此外，LCLs 还可辅助诊断神经系统疾病，对研究ASD发病机制和观察药物疗效具有重要意义。已有多项研究利用LCLs探讨了ASD的相关分子机制，并为ASD的药物开发提供了新的研究工具。Nayan 等14利用 LCLs 发现 ASD 患者来源的LCLs超氧化物歧化酶活性较低，丙二醛和细胞内DNA损伤水平较高，而无刺蜂蜜处理可以扭转这一变化。丁酸可显著改善 ASD 患者来源的LCLs线粒体功能障碍，还可激活免疫系统相关基因的表达，改善ASD疾病状态的能量代谢15。尽管LCLs是细胞遗传学和分子遗传学的主要研究材料，但也存在一些局限性。例如，LCLs在采集后难以保存，不能传代培养，患者的LCLs样本往往需要反复采集。1.5原代神经元原代神经元体外培养时间短，其遗传性状与体内细胞相似，适用于神经元形态、功能及分化的相关研究。与多次传代的细胞相比，原代神经元更接近于神经元在体内的正常发育状态，具有简便、快速、条件易控制、药理靶点明确、干扰因素少、结果易观察等优点。研究发现 VPA 预处理原代神经元后，Wnt/-catenin 信号通路中关键信号分子-catenin 和磷酸化糖原合成酶激酶3的表达增加，提示VPA处理激活原代神经元中Wnt信号通路转导。VPA干预的原代神经元可以很好地模拟ASD患者内质网应激的异常状态。VPA还可抑制原代细胞树突和轴突的生长，从而影响神经元的发育和神经网络的成熟16。此外，NLGN 表达异常与 ASD的发生有关，使用原代神经元进行研究发现，NLGN并不影响突触数量，而是影响突触的抑制和兴奋功能，从而导致社交障碍等ASD相关的行为异常17。原代神经元还存在不能完全模拟体内环境等缺点，限制了原代神经元在神经系统疾病相关研511生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology究中更广泛的应用。表1总结了各种细胞模型在ASD研究中的应用及优缺点。2非哺乳动物模型非哺乳动物模式生物如果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼等也被用于ASD的相关研究中。非哺乳动物模型不仅具有高通量、短寿命、短生殖周期、加速代际研究等与细胞模型相似的优势，而且具有较高的基因保守性，可用于ASD相关的病理特征探索以及社会行为变化观察。此外，这些非哺乳动物模型还被用于ASD候选基因、环境因素及候选药物的高通量分析和快速筛选。但非哺乳动物模型在生理、解剖和行为特征等方面与人类差异均较大。2.1果蝇果蝇具有繁殖周期短、产量高、经济环保等优点。此外，果蝇基因组相对简单和保守。因此，果蝇可广泛用于包括ASD在内的精神疾病的分子机制研究。果蝇脆性X智力低下1（fragile X mental retardation 1，FMR1）基因与人类该基因同源性达35%，相似性达 56%。Kanellopoulos 等18进一步研究发现，FMR1的缺失增加了突触代谢型谷氨酸受体的表达，降低了环磷酸腺苷的表达，导致果蝇的学习记忆缺陷。利用果蝇构建双酚A诱导的ASD模型，表现出类似 ASD的行为特征，如重复行为和异常的社会行为19。这些研究结果证实了果蝇作为研究ASD动物模型的可行性，为探索相关易感基因和环境因素诱发ASD的分子机制奠定了研究基础。2.2秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫具有保守、简单的神经元通路，为筛选ASD易感基因和探索相关分子机制提供了强有力的工具。Helena 等20利用 SFARI Gene数据库（http：/gene-archive.sfari.org，version3.0）鉴定了秀丽隐线虫中人类ASD相关易感基因的同源基因，并筛选出在社会行为中起作用的新的候选基因，这些基因突出了突触在ASD中的重要贡献，主要涉及细胞信号传导、表观遗传学和磷脂代谢等功能。Troy 等21利用秀丽隐杆线虫表征了ASD相关基因的功能，并量化了135个突变的26种表型，涵盖形态、运动、触觉敏感性和学习习惯。还 有 研 究 利 用 秀 丽 隐 杆 线 虫 发 现 了 以CHD8 CHD7和NLGN-3 NLGN-1为中心的感觉反应和学习的基本网络，并发现 NLGN-1 的 R433C错义突变可导致秀丽隐杆线虫的社会功能障碍，NLGN-1的重新表达可以恢复NLGN-1突变秀丽隐杆线虫的感觉和学习障碍22。此外，一些研究利用秀丽隐杆线虫探索治疗ASD的候选药物。例如，Kathrin 等23通过秀丽隐杆线虫筛选出具有ASD相关运动缺陷表型的突变体，并对超过3 900种化合物进行了全面的药物筛选。2.3斑马鱼斑马鱼作为新兴模型，具有繁殖快、交配行为表1细胞模型在ASD研究中的应用以及优缺点Table 1The application,advantages and disadvantages of cell models in ASD research细胞模型PC12细胞模型SH-SY5Y细胞模型hiPSCs细胞模型LCLs细胞模型原代神经元细胞模型潜在应用探索 ASD 易感基因如 NLGN-3 和 PTEN的功能4及VPA等环境因素诱发ASD的分子机制5探索ASD易感基因如SHANK2的功能6；研究ASD的分子机制，如Caspase-3凋亡级联、甲基化等7-8探讨ASD易感基因如DSCAM的功能10；研究 ASD 的基因-环境交互作用；探索ASD的潜在治疗方法，如胰岛素生长因子111；ASD相关脑类器官的开发13探索ASD与氧化应激的关系；研究线粒体功能障碍与 ASD 的关系；筛选防治ASD的候选药物14-15探索Wnt信号通路、内质网应激、NLGN表达与ASD的关系16-17优点研究神经发育的标准细胞模型研究神经表型和神经变性疾病的良好细胞模型具有胚胎干细胞的形态和遗传特征；发展个体化医学反映机体的免疫状态；协助疾病诊断更接近神经元在人体内的状态缺点是一类肿瘤细胞，经过多次传代后其形态和特性都会发生变化不能观察神经发育过程；未分化细胞对神经毒素和神经保护剂的敏感性较低无法观察到典型的病理表型；必须严格控制致瘤风险采集后难以保存，不能传代培养；患者的LCLs标本往往需要反复采集无法完全模拟体内环境512方靖靖，等：孤独症谱系障碍实验模型研究进展受光控制、产卵多、体外受精、早期胚胎整体透明、易于使用药物等优点。在行为学方面，斑马鱼模型表现出相对简单和定义明确的感觉运动行为。此外，斑马鱼具有同质性偏好和群落聚集的特征，可用于社会行为研究。近年来，斑马鱼因其较高的遗传操作效率和显著的行为表型，成为研究ASD极具吸引力的模式生物。目前，一些研究利用斑马鱼模型探索VPA等环境因素引发ASD样行为的分子机制。例如，VPA处理的斑马鱼表现出类似ASD的症状，如细胞增殖降低、颜色偏好降低、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）神经元分化受损24。在斑马鱼中对神经分子机制的研究为未来ASD的靶向治疗提供了重要线索。此外，还有研究利用斑马鱼探索了ASD易感基因对神经发育和自主行为的影响。Gauthier等25 发现下调SHANK3同源基因的表达可以降低斑马鱼的头围和游泳时对触摸的反应能力。2.4鸣禽类除上述ASD动物模型外，斑胸草雀等鸣禽动物模型也可用于ASD的相关研究。斑胸草雀具有良好的发声学习能力，可用于模拟语言交流障碍，研究ASD易感基因和语言相关基因在鸣禽学习发声环路中的作用。例如，在鸣禽类ASD动物模型中发现 CNTNAP2 与 ASD 相关，并广泛存在于人类语言相关的神经环路中26。非哺乳动物模型在生理、解剖和行为特征等方面与人类差异均较大，表2总结了该类模型在ASD研究中的应用以及优缺点。3啮齿类动物模型啮齿类动物的基因与人类具有高度同源性，针对已知的ASD风险基因和环境风险因素，目前已经建立了多种啮齿类动物模型。啮齿类动物模型成本低、妊娠期短、产仔数高，研究啮齿类动物模型的行为和生理特性的方法也相对详尽。此外，啮齿类动物的基因操作工具丰富，单基因啮齿类动物模型可以用来解释特定基因的功能，但并不能代表大多数人类的ASD疾病。然而，啮齿类动物和人类在许多方面存在着较大差异，如大脑解剖和行为特征。这些差异使得啮齿类动物模型在ASD研究中的转化价值成为一个有争议的问题。小鼠和大鼠都被广泛用于构建与ASD相关的啮齿动物模型，而大鼠具有更广泛的社会行为和更复杂的声学交流系统，其中特定的超声发声（ultrasound vocalization，USV）是其情境依赖性情绪信号，具有重要的交流功能。常用的ASD啮齿类动物模型包括产前VPA暴露模型、BTBR特发性小鼠模型、MIA模型以及基于ASD易感基因构建的啮齿类动物模型等（表3）。3.1产前丙戊酸暴露模型VPA 在临床上被用作抗癫痫药或情绪稳定剂，可以治疗癫痫、双相情感障碍和神经病理性疼痛。Bromley等27报道了孕期VPA暴露会增加子代患ASD的风险。此外，研究发现有产前VPA暴露史的儿童神经发育障碍疾病的患病率增加了610倍，其中ASD是产前VPA暴露儿童在6岁时最常见的神经发育障碍28表征。在动物实验中，产前暴露于VPA的大鼠或小表2非哺乳动物模型在ASD研究中的应用以及优缺点Table 2The application,advantages,and disadvantages of non-mammalian models in ASD study非哺乳动物模型果蝇模型秀丽隐杆线虫模型斑马鱼模型鸣禽类动物模型表型特征FMR1 突变果蝇之间的互动较少，存在学习记忆缺陷18；双酚A诱导的果蝇表现出增加的重复行为和异常的社会互动19NLGN-1 基因 R433C 错义突变可导致社会功能障碍22VPA 处理可降低斑马鱼的细胞增殖和颜色偏好24；下调SHANK3同源基因可降低斑马鱼的头围和对触摸的反应能力25研究 CNTNAP2 等语言相关基因在鸣禽学习发声回路中的作用26潜在应用阐明ASD的分子机制；筛查ASD风险基因和药物探索新的 ASD 易感基因及ASD的潜在治疗方法探讨 ASD 易感基因的功能；筛选ASD候选药物揭示 ASD 语言障碍的相关分子机制优点生殖周期短、低成本，简单保守的基因组保守且简单的神经元通路繁殖快、药物使用方便且成本低；表现出明确定义的刻板样行为模拟语言沟通障碍缺点生理、解剖和行为特征都与人类有较大差异大脑结构和生理特征与人类有较大差异低同源性；在解剖和行为特征上与人类存在巨大差异大脑不发达513生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology鼠是研究ASD的经典动物模型，被广泛用于探索ASD的潜在治疗药物相关研究中。例如，母鼠在妊娠 11.513.5 d 皮下或腹腔注射 400600 mg kg-1 VPA，会普遍导致子代小鼠超声发声频率降低，持续时间缩短。在社会交往实验中，产前暴露VPA仔鼠的社会能力普遍受损，但当 VPA 剂量低于350 mg kg-1时，仔鼠的社会损害表型不明显。在社会偏好实验中，产前暴露VPA子代的社会偏好普遍降低。在重复行为检测方面，雌性小鼠在妊娠 11.513.5 d 腹腔或皮下注射 400600 mg kg-1 VPA所产生的子代小鼠在旷场实验和理毛实验中表现出理毛、挖掘等重复行为增加的总体趋势。在埋珠实验中，母鼠妊娠第 1013 d暴露于300600 mg kg-1 VPA 可增加子代小鼠的埋珠数量。在探索行为方面，大多数研究显示产前暴露VPA 子代的探索行为减少。对于产前暴露 VPA子代在旷场实验中活动是否减少也存在争议。在一些研究中，产前暴露VPA的后代小鼠表现出高活跃性，而在其他研究中，产前暴露VPA的后代小鼠表现出活动量减少29。此外，VPA暴露大鼠模型也可用于 ASD 候选药物的筛选。Juybari等30研究表明，VPA暴露（妊娠第12.5 d，腹腔注射600 mg kg-1）会诱导雄性子代大鼠产生ASD样行为，增加痛阈，而白藜芦醇可以部分改善这些行为缺陷。在分子机制方面，研究者对VPA在胚胎发育早期诱发ASD的分子机制进行了初步探究，发现VPA暴露通过调节一些信号通路，如组蛋白高乙酰化、Wnt信号通路、ERK-p21通路和脑内-氨基丁酸水平，从而影响大脑发育和神经网络成熟，最终导致后代出现 ASD样行为表型。VPA啮齿类动物模型除了与ASD患者在行为学和解剖学上具有一定的相似性外，还表现出与ASD患者相似的肠道菌群失调，这使得VPA啮齿类动物模型成为研究ASD的最佳模型之一31。妊娠期注射高剂量VPA（400600 mg kg-1）可诱导子代小鼠或大鼠出现社交和认知障碍，重复性行为增加等ASD核心症状。然而，高剂量VPA可能导致小鼠产前死亡或子代数量减少。已有研究发现，低、中剂量VPA暴露也被用于构建ASD的啮齿动物模型。例如，Wei等32报道在妊娠第17 d单次皮下注射100或200 mg kg-1 VPA会导致小鼠的新物体识别能力受损和恐惧条件反射行为异常。因此，产前低或中等剂量的VPA暴露可能与高剂量VPA暴露诱发不同的行为改变。此外，鼠龄也会影响 VPA 的造模效果，例如，Chaliha等29报道，与VPA暴露的年轻啮齿动物相比，老年啮齿动物暴露于VPA表现出更少的社交和探索行为。因此，建议研究者在进行行为学测试时应确保受试动物处于幼年年龄范围内，并同时使用雄性和雌性动物进行实验，以反映实验因素对ASD患者两性的影响。3.2BTBR特发性小鼠模型BTBR T+/tpr3tf/J（BTBR）小鼠品系来源于携带Discldel、T+、Itpr3tf和Cox7a2ll 4种基因突变的近交系小鼠，BTBR小鼠最初由哥伦比亚大学的Dunn将携带短尾基因的小鼠与携带簇状基因突变的小鼠杂交，使其连续近交获得33。BTBR 小鼠的异常行为主要由编码犬尿氨酸3-单加氧酶的Kmo基因的3个单核苷酸多态性引起。BTBR小鼠能够很表3常用的啮齿类动物模型在ASD研究中的应用以及优缺点Table 3The application,advantages and disadvantages of commonly used rodent models in ASD study啮齿类动物模型产前丙戊酸暴露模型BTBR特发性小鼠模型MIA模型表型特征社交能力受损；超声发声频率降低，持续时间缩短；呈现出理毛和挖掘等重复性行为增加的总体趋势；表现出与ASD患者相似的肠道菌群失调31表现出明显的学习和认知障碍、社交障碍、发声能力异常；表现出增加的重复行为34表现为超声发声频率降低，社会偏好减少，刻板行为增多；胃肠道屏障缺陷，肠道微生物群紊乱潜在应用探 究 VPA 诱 导ASD分子机制；筛选候选药物，如白藜芦醇30探索ASD的病理；筛选候选药物筛选 ASD 的潜在治疗方法，如脆弱拟杆菌37优点可以模拟典型和核心ASD表型表型和解剖学特征与ASD患者一致显示 ASD 的核心症状和常见的神经病理学改变缺点目前尚无统一、标准化的模型构建方法BTBR小鼠的异常行为主要由Kmo基因的3个单核苷酸多态性引起Poly I：C诱导MIA模型的方法不统一，注射剂量、注射时间、注射次数不一514方靖靖，等：孤独症谱系障碍实验模型研究进展好地模拟临床ASD患者的核心症状，因此被广泛用于ASD的病理机制和筛选候选药物的相关研究中。BTBR小鼠是目前公认的特发性ASD动物模型，其核心症状与 ASD 患者的临床症状最为相似，并可稳定地遗传给后代。BTBR小鼠在三箱社交能力实验中表现出明显的社交动机和社交能力缺乏等社交功能障碍。在直接社会互动实验中，BTBR小鼠嗅探、跟随等探索性社会行为明显减少。在USV测试中，当BTBR小鼠离开母鼠的笼子时，BTBR小鼠发出异常高频、高振幅的超声波。研究人员认为这种行为类似于ASD儿童在被迫与母亲分离时的大声哭泣。相比之下，成年BTBR小鼠面对陌生小鼠的气味时，发出的超声波数量减少，这与人类ASD患者的语言沟通障碍相似。此外，研究还表明，BTBR小鼠的重复行为增加，如独居、挖掘、理毛和埋珠等34。BTBR小鼠的解剖特征也与ASD患者存在一定一致性。例如，在BTBR小鼠中，中枢神经系统的器质性病变主要集中在皮质、胼胝体和海马发育不良方面，最显著的神经解剖学特征是胼胝体100%丢失和海马关联严重减少，这些特征与ASD患者的临床表现相似33。截至目前，研究发现的导致BTBR小鼠ASD相关行为的分子机制主要包括大脑胶质细胞突触投射异常、兴奋/抑制失衡、多种神经递质失衡如单胺能递质（5-HT 和多巴胺）失衡和胆碱能递质传递系统失衡、神经炎症、神经发生障碍或异常、细胞内信号选择性中断等35。3.3母体免疫激活模型母体免疫激活（maternal immune activation，MIA）模型的研究来源于对ASD致病因素的大规模流行病学调查，母亲孕期尤其是前3个月的感染与子代患ASD的风险密切相关。在动物实验中，将妊娠雌性小鼠或大鼠暴露于聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I：C）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、模拟病毒、细菌等环境中可以成功构建MIA模型，这些因素通过诱导母体免疫反应来激活免疫系统，其中孕期母体暴露于Poly I：C是最常用的MIA模型。Poly I：C是一种人工合成的干扰素诱导剂，具有类似于病毒的双链RNA结构，用于模拟人类病毒感染。在雌鼠妊娠第10.5、12.5、14.5 d注射5 mg kg-1 Poly I：C可成功建立MIA小鼠模型，子代小鼠会出现 ASD的核心症状36。在 USV测试中，MIA子代小鼠在面对不同社会刺激时超声发声频率降低，提示MIA子代小鼠存在语言交流障碍。在三室社交能力测试中，MIA子代小鼠的社会偏好显著降低，提示MIA子代小鼠存在社会交往障碍。在埋珠和理毛实验中，MIA子代小鼠的重复刻板行为增加。这些结果表明，Poly I：C免疫激活模型的子代小鼠表现出与ASD患者非常相似的行为学特征，如社会交往障碍、理毛、重复筑巢和刻板行为等。此外，在妊娠第12.5 d注射20 mg kg-1 Poly I：C也可以成功构建ASD小鼠模型，子代小鼠出现胃肠道屏障缺陷、肠道菌群紊乱和血清代谢物变化等现象，口服脆弱拟杆菌可改善MIA小鼠的肠道通透性和肠道微生物组成，同时可以改善言语沟通、刻板印象、焦虑和感觉运动行为等缺陷37。但由于母体的免疫反应不同和MIA子代行为差异，啮齿动物MIA模型构建中的注射剂量、注射时间和注射次数均不一致，因此目前尚无统一的Poly I：C诱导MIA模型构建方法。LPS诱导的MIA模型也是相对常见的ASD动物模型。Kirsten等38在妊娠第9.5 d通过向母鼠腹腔注射100 g mg-1 LPS构建ASD模型，子代表现出语言交流障碍、学习记忆能力下降、重复刻板行为增加等行为特征，但子代的社交能力未受影响。此外，用LPS构建的ASD模型大鼠纹状体中多巴胺、5-HT及其代谢物也有所减少39。3.4基于ASD易感基因构建的啮齿动物模型随着基因工程技术的快速发展，研究人员通过基因测序技术筛选了大量ASD相关易感基因。与此同时，Cre-lox、归巢核酸内切酶、锌指核酸内切酶、转录激活因子效应物核酸酶、CRISPR/Cas9等基因编辑技术的快速发展，使遗传动物模型近年来广泛应用于ASD的研究中。通过在啮齿类动物中突变ASD相关易感基因，构建了多种ASD遗传动物模型。目前，用于构建ASD啮齿动物模型的常见ASD易感基因（表4）主要包括NLGN基因家族、NRXN基因家族、SHANK基因家族、甲基化CpG 结 合 蛋 白 2（methyl-CpG binding protein 2，MECP2）、FMR1、结节性硬化症复合物1/2（tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）、PTEN和泛素蛋白E3连接酶A（ubiquitin-protein ligase E3A，UBE3A）等。3.4.1NLGN 基因家族NLGN 家族是一类存在515生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology于突触后膜的细胞黏附分子，由 5 个家族成员（NLGN-1、NLGN-2、NLGN-3、NLGN-4X、NLGN-4Y）组成，这些细胞黏附分子是介导突触发育和成熟的关键蛋白。此外，它们还可以调节-氨基丁酸和谷氨酸能突触，影响中枢神经系统的兴奋/抑制平衡，大量研究表明NLGN与ASD等神经发育疾病的发生密切相关。不同的NLGN基因在神经元发育过程中可能发挥不同的功能，NLGN-1在突触形成和突触可塑性的诱导和调节中发挥着重要作用，并能影响实验动物的社交和记忆能力。NLGN-1基因敲除小鼠表现出理毛行为显著增加，空间学习和记忆缺陷，这与海马长时程增强受损相似40。NLGN-2存在于抑制性突触中，NLGN-2基因敲除小鼠表现出探索活动减少，超声发声减少且时间短等异常行为，但同时 NLGN-2敲除小鼠表现出正常的社会行为，并未检测到刻板或重复行为增加的行为学特征41。NLGN-3是一种编码突触后蛋白的基因，对突触的成熟和传递具有重要作用，近年来研究发现 NLGN-3 是诱导或促进 ASD 发生的基因之一，NLGN-3 R451C 基因敲入小鼠的社交能力受损，空间学习能力增强，这些行为改变伴随着抑制性突触传递的增加，而兴奋性突触没有明显变化42。人类遗传学分析发现，NLGN-4基因与ASD表4基于ASD易感基因构建的啮齿动物模型在ASD研究中的应用以及优缺点Table 4The application,advantages and disadvantages of rodent models based on ASD susceptibility genes in ASD studyASD易感基因NLGN家族NRXN家族SHANK家族MECP2FMR1TSC1/2PTENUBE3A表型特征NLGN-1基因敲除小鼠表现出空间学习记忆缺陷，刻板行为增多40；NLGN-2基因敲除小鼠表现出探索活动减少、超声发声减少等行为异常41；NLGN-3 R451C 基因敲入小鼠的社交能力受损，空间学习能力增强42；NLGN-4 基因敲除小鼠表现出社会交