基于宏基因组测序的稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落功能分析.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(9):1 4 6 6-1 4 7 5A c t a A g r i c u l t u r a e B o r e a l i-o c c i d e n t a l i s S i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 1 5h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 1 5基于宏基因组测序的稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落功能分析收稿日期:2 0 2 2-0 6-1 3 修回日期:2 0 2 2-1 1-0 1基金项目:辽宁省2 0 2 0年教育厅科研项目(L N S J Y T 2 0 2 0 0 5)。第一作者:宋 宇,女,学士,高级实验师,主要从事环境微生物学研究。E-m a i l:7 6 3 8 6 9 3 6 5q q.c o m宋 宇,王 鹏,韦月平(辽东学院,辽宁丹东 1 1 8 0 0 3)摘 要 为了分析施入生物有机肥的稻蟹共作稻田(HX T C S)的水稻根际土壤微生物的代谢功能,以生物有机肥稻田(Y J T C S)为对照,利用I l l u m i n a N o v a s e q测序平台对两种稻田成熟期的根际土壤进行宏基因组测序以分析微生物群落的组成及代谢功能。N R注释结果显示,样品中微生物以细菌为主,约占9 8.0 9%,其次为古菌约占1.7 6%,真菌及其他约占0.1 5%。L E f S e分析结果表明,河蟹引入生物有机肥稻田后富集更多的细菌和古菌群落的显著差异分类群。C OG和C A Z y功能基因注释结果显示,HX T C S主要相关功能基因的相对丰度均高于对照组。碳代谢途径基因注释分析结果表明,HX T C S在1 6个碳代谢途径的基因注释的相对丰度均高于对照组,其中丙酮酸代谢和原核微生物的碳固定途径的相对丰度在2种稻田中差异显著(P 0.0 5)。氮代谢功能分析结果表明,HX T C S中的反硝化作用、硝酸盐还原作用和谷氨酰胺合成作用的关键酶基因的相对丰度均高于对照组。研究结果说明:河蟹引入生物有机肥稻田后,增加了根际土壤碳水化合物活性酶和主要代谢途径基因的相对丰度,有助于碳代谢及促进根际土壤氮循环中的反硝化作用、硝酸盐还原作用及谷氨酸的合成作用。关键词 稻蟹共作稻田;宏基因组测序;根际;微生物群落功能 土壤微生物几乎参与了土壤生态系统全部的养分转化过程1,是土壤养分循环和植物对养分利用过程中重要参与者,对维持土壤肥力和植物的生长有重要的作用2。根际离根轴表面数毫米范围之内,是土壤-根系-微生物相互作用的微区域。有研究发现根系分泌物的改变驱动了有益微生物在根际部位的富集,从而增加宿主吸收养分、增强宿主抵抗胁迫的能力3。农作物可通过施用化肥达到增产的目的,但长期大量施用化肥造成土壤板结及破坏土壤微生物区系结构,影响土壤养分的转化4。水稻是世界上重要的粮食作物,现代人们通过在稻田中引入鱼、鸭等生物进行复合种养达到了改善土壤环境和提高水稻产量的目的5-6。徐敏等7研究稻蟹共生系统不同水稻栽培模式土壤理化性状和有效养分的变化规律,结果表明养蟹稻田可显著提高土壤中有机质、碱解氮、速效磷和有效钾含量并能提高水稻产量。土壤微生物的早期研究大都基于平板菌落计数技术、P C R-D G G E、T-R F L P和焦磷酸测序等不可培养的分子分析,如今随着基于I l l u m i n a M i s e q和I l l u m i n a N o v a s e q测序平台的高通量测序技术的发展,土壤微生物群落结构、多样性和功能的研究得到不断深入。宋宇等8探讨了不同稻田共作模式对土壤细菌群落结构的影响,初步揭示了河蟹的引入增加了稻田土壤细菌群落多样性,丰富了细菌群落组成;又进一步研究了河蟹对水稻不同生育期根际土壤细菌群落结构的影响,结果表明河蟹引入生物有机肥稻田后土壤细菌的群落结构会随着生育期发生一定变化,而这种变化和土壤理化因子密切相关9。目前对水稻根际微生物群落的研究多为基于I l l u m i n a M i s e q平台上的群落结构和 多 样 性 的 研 究1 0-1 3,而 对 基 于I l l u m i n a N o v a s e q宏基因组测序平台上的的群落功能分析还少见。本文就是以生物有机肥稻田为对照,基于宏基因组测序来分析施入生物有机肥的稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落功能差异来揭示河蟹的引入对生物有机肥稻田的水稻根际土壤微生物代谢功能的影响,为共作稻田的栽培模式提供理论依据。1 材料与方法1.1 田间试验和土壤样品采集供试水稻是 越光 大米,试验地点是丹东东港市北井子镇盖家坝有机种植农场(3 9 5 4 N,1 2 3 5 0 E),东港市属北温带湿润地区大陆性季风气候。受黄海影响,具有海洋性气候特点。正常年全年平均气温8.4,降雨量8 8 8 mm。设置施入生物有机肥的稻蟹共作稻田和空白对照的施入生物有机肥稻田的水稻大田试验,两种样地各占地约1 0 0 0 m2。对照组生物有机肥稻田的土壤样品标记为Y J T C S,该稻田施用日照益康有机农业科技发展有限公司生产的海藻生物有机肥(有机质含量3 0%),其分别在3月份和7月份按 1.3 5 k g/h m2施用。稻蟹共作稻田的土壤样品标记为HX T C S。该稻田在和对照组等时等量施入生物有机肥的同时又在4月末放入河蟹苗,按 0.5 k g/h m2投放,1 0月末收蟹。于2 0 2 0年1 0月1 5日(水稻成熟期)在两种稻田上各设置3个1 0 m1 0 m的采样区域,每个区域按照5点采样法选取5个点采用破坏性取样法将水稻整株挖出,勿伤害根系,抖落大块土壤后用无菌菌刷刷取根际区域约1 mm紧密粘附在根表面的土壤,每5株为一个重复,混匀后装入5 0 m L离心管中,在 -8 0 冷冻保存后送至上海美吉生物医药科技有限公司进行D NA提取和宏基因组测序。1.2 土壤D N A提取和宏基因组测序利用E.Z.N.A.R S o i l D NA K i t(Om e g a B i o-t e k,美国)试剂盒进行样品D NA 抽提。提取完成后测定D NA浓度,取2 g D NA样品备送测序公司进行宏基因组测序,采用 I l l u m i n a N o-v a S e q高通量测序平台测序(上海美吉生物医药科技有限公司),测序深度为每样品 6 G B。1.3 宏基因组测序分析使 用f a s t p1 4(h t t p s:/g i t h u b.c o m/O p e n-G e n e/f a s t p,v e r s i o n 0.2 0.0)对r e a d s 3 端和5 端的a d a p t e r序列进行质量剪切;使用基于s u c c i n c t d e B r u i j n g r a p h s原理的拼接软件ME GAH I T1 5(h t t p s:/g i t h u b.c o m/v o u t c n/m e g a h i t,v e r s i o n 1.1.2)对优化序列进行拼接组装,在拼接结果中筛选3 0 0 b p的c o n t i g s作为最终的组装结果;使用M e t a G e n e1 6(h t t p:/m e t a g e n e.c b.k.u-t o-k y o.a c.j p/)对拼接结果中的c o n t i g s进行O R F预测。选择核酸长度1 0 0 b p的基因,并将其翻译为氨基酸序列;用C D-H I T1 7(h t t p:/www.b i o i n f o r m a t i c s.o r g/c d-h i t/,v e r s i o n 4.6.1)对所有样品预测出来的基因序列进行聚类(参数为:9 0%i d e n t i t y、9 0%c o v e r a g e),每类取最长的基因作 为 代 表 序 列,构 建 非 冗 余 基 因 集;使 用S OA P a l i g n e r1 8软 件(h t t p:/s o a p.g e n o m i c s.o r g.c n/,v e r s i o n 2.2 1),分别将每个样品的高质量r e a d s与非冗余基因集进行比对(9 5%i d e n t i-t y),统计基因在对应样品中的丰度信息;使用D i-a m o n d1 9(h t t p:/www.d i a m o n d s e a r c h.o r g/i n-d e x.p h p,v e r s i o n 0.8.3 5)将非冗余基因集的氨基酸序列与非冗余蛋白库(N o n-R e d u n d a n t P r o t e i n S e q u e n c e D a t a b a s e)N R数 据 库 进 行 比 对(B L A S T P比 对 参 数 设 置 期 望 值e-v a l u e为1 e-5),并通过 N R 库对应的分类学信息数据库获得物种注释,然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度。1.4 功能注释方法及数据库使 用 D I AMON D(h t t p s:/g i t h u b.c o m/b b u c h f i n k/d i a m o n d)将 非 冗 余 基 因 集 序 列 与E g g NOG数据库进行比对(参数:b l a s t p;E-v a l u e 1 e-5),获得基因对应的 C OG(C l u s t e r s o f o r-t h o l o g o u s g r o u p s o f p r o t e i n s,直系同源蛋白簇),然后使 用 C OG 对 应 的 基 因 丰 度 总 和 计 算 该 C OG 的 丰 度。使 用 D I AMON D(h t t p s:/g i t h u b.c o m/b b u c h f i n k/d i a m o n d)将非冗余基因集序列与 K E G G的基因数据库(G E N E S)进行比对(参 数:b l a s t p;E-v a l u e 1 e-5),根 据KO、P a t h w a y对应的基因丰度总和计算该功能类别的丰度。使用 C A Z y 数据库的对应工具 h mm s c a n 将非冗余基因集与 C A Z y 数据库进行比对,比对参数设置期望值 e-v a l u e 为 1 e-5,获得基因对应的碳水化合物活性酶注释信息,然后使用碳水化合物活性酶对应的基因丰度总和计算该碳水化合物活性酶的丰度。2 结果与分析2.1 微生物门水平群落组成分析N R注释结果显示样品中微生物以细菌为主,约占9 8.0 9%,其次为古菌约占1.7 6%,真菌及其他约占0.1 5%。由图1所示,两种土壤样品在微生物门水平上共有1 0个主要菌群,分别是变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a)、放线菌门(A c t i n o b a c t e-76419期宋 宇等:基于宏基因组测序的稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落功能分析r i a)、绿 弯 菌 门(C h l o r o f l e x i)、酸 杆 菌 门(A c-i d o b a c t e r i a)、G e mm a t i m o n a d e t e s_d_B a c t e r i a、广古菌门(E u r y a r c h a e o t a)、U n c l a s s i f i e d_d_B a c t e r i-a、硝化螺旋菌门(N i t r o s p i r a e)、拟杆菌门(B a c t e-r o i d e t e s)和疣微菌门(V e r r u c o m i c r o b i a)。其中变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a)、放线菌门(A c t i n o b a c-t e r i a)、绿 弯 菌 门(C h l o r o f l e x i)、酸 杆 菌 门(A c-i d o b a c t e r i a)为优势菌门,共占比8 9.1 1%。稻蟹共作稻田(HX T C S)中的变形菌门、放线菌门和广古菌门的相对丰度分别为3 9.8 2%、2 2.7 9%和 0.9 7%低于对照组(Y J T C S)的4 2.2 6%、2 7.1 7%图1 微生物门水平群落组成F i g.1 M i c r o b i a l c o mm u n i t y c o m p o s i t i o n a t p h y l u m l e v e l和1.9 8%。而绿弯菌门、酸杆菌门和疣微菌门的相对丰度分别为1 5.9 5%、1 0.1 5%和1.1 3%则高于Y J T C S的1 2.9 3%、7.1 9%和0.7 3%。2.2 2种稻田根际土壤微生物群落的L E f S e分析为了提供更多关于2种种养模式稻田的根际土壤 微 生 物 群 落 的 信 息,使 用L E f S e来 识 别Y J T C S和HX T C S中L D A得分高于4.0的从门到属水平差异丰度分类群。L E f S e采用线性判别分析(L D A)来估算每个物种丰度对差异效果影响的大 小。如 图2所 示,对 根 际 细 菌 群 落 的L E f S e分析表明2种稻田中有1 6个细菌类群存在显著差异,只有4个在对照组(Y J T C S)中富集,而稻蟹共作稻田(HX T C S)则主要富集绿弯菌门、酸杆菌门及隶属于二者的相关目、科、属等1 2个分类 群。如 图3所 示,对 根 际 古 菌 群 落 的L E f S e分析表明2种稻田中有1 3个明显丰富的分类群。对照组(Y J T C S)中只富集3个而稻蟹共作稻田(HX T C S)则富集深古菌门、广古菌门及隶属于它们的相关纲、目、科及属等1 0个分类群。如图4所示,对根际真菌群落的L E f S e分析表明2种稻田中有1 1个明显丰富的分类群,对照组(Y J T C S)中 富 集6个,而 稻 蟹 共 作 稻 田(HX-T C S)则富集5个分类群。通过2种稻田根际土壤微生物群落的L E f S e分析结果表明河蟹引入生物有机肥稻田后细菌和古菌群落会富集更多的差异分类群。图2 2种稻田根际土壤细菌群落的L E f S e分析结果F i g.2 L E f S e a n a l y s i s o f s o i l f u n g a l c o mm u n i t i e s i n r h i z o s p h e r e o f t w o k i n d s o f r i c e f i e l d s2.3 基于宏基因组土壤微生物功能注释2.3.1 C A Z y功能基因注释 C A Z y(C a r b o h y-d r a t e-A c t i v e e n z y m e s,碳水化合物活性酶)可分为6大蛋白功能模块,即辅助氧化还原酶(AA s)、碳水化合物结合模块(C BM s)、碳水化合物酯酶(C E s)、糖苷水解酶(GH s)、糖基转移酶(G T s)和多糖裂解酶(P L s)。如表1所示,HX T C S在6大蛋白 功能模块基 因的相对丰 度均高于对 照组Y J T C S。其中GH s、G T s和P L s差异显著(P0.0 5)。8641西 北 农 业 学 报3 2卷图3 2种稻田根际土壤古菌群落的L E f S e分析结果F i g.3 L E f S e a n a l y s i s o f s o i l a r c h a e l c o mm u n i t i e s i n r h i z o s p h e r e o f t w o k i n d s o f r i c e f i e l d s图4 2种稻田根际土壤细菌群落的L E f S e分析结果F i g.4 L E f S e a n a l y s i s o f s o i l f u n g a l c o mm u n i t i e s i n r h i z o s p h e r e o f t w o k i n d s o f r i c e f i e l d s表1 碳水化合物活性酶相对丰度T a b l e 1 R e l a t i v e a b u n d a n c e o f c a r b o h y d r a t e-a c t i v e e n z y m e s处理T r e a t m e n t辅助氧化还原酶AA s碳水化合物结合模块C BM s碳水化合物酯酶C E s糖苷水解酶GH s糖基转移酶G T s多糖裂解酶P L sY J T C S0.0 4 4 5 a0.0 1 2 5 a0.0 6 5 2 a0.1 6 1 1 a0.1 7 0 8 a0.0 0 8 3 aHX T C S0.0 4 9 4 a0.0 1 2 9 a0.0 7 3 0 a0.1 8 7 7 b0.2 0 2 9 b0.0 1 1 7 b注:小写字母表示不同蛋白功能模块的差异性,相同的表示无差异,不同的表示差异显著(P0.0 5),下同。N o t e:L o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e t h e d i f f e r e n c e o f d i f f e r e n t p r o t e i n f u n c t i o n a l m o d u l e s,t h e s a m e o n e s i n d i c a t e n o d i f f e r e n c e,a n d t h e d i f-f e r e n t o n e s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P0.0 5),t h e s a m e b e l o w.2.3.2 C OG功能基因注释 将测序结果E g g-NOG数据库进行对比(表2),C OG(C l u s t e r s o f O r t h o l o g o u s G r o u p s,蛋白相邻类的聚簇)将基因功能分为2 5个大类,包含于四大功能:细胞过程和信号(C e l l u l a r p r o c e s s e s a n d s i g n a l i n g)、信息存储 和 处 理(I n f o r m a t i o n s t o r a g e a n d p r o c e s s-i n g)、代谢(M e t a b o l i s m)和未知的功能特征(P o v-e r t y c h a r a c t e r i s t i c s)。功 能注释结果 表 明HX-T C S在相对丰度排名前2 0的基因功能中有1 9个基因功能的相对丰度均高于对照组Y J T C S。其中氨基酸转运与代谢和脂质转运与代谢基因的相对丰度在2种稻田中差异显著 (P0.0 5)。2.3.3 碳代谢途径基因注释分析 宏基因组测序结果发现两种土壤样品共有1 6个碳代谢相关途径,如表3所示,HX T C S在所有碳代谢途径的基因注释的相对丰度均高于对照组Y J T C S。其中丙酮酸代谢和原核微生物的碳固定途径的相对丰度在2种稻田中差异显著(P0.0 5)。2.3.4 氮代谢功能分析 氮代谢在土壤氮素循环中起到重要作用。本研究主要针对硝化作用、反硝化作用、固氮作用、硝酸盐还原作用和谷氨酰胺合成等5个氮转化过程(图5)。宏基因组测序分析结果显示硝化作用因相关酶基因缺失表现不完整。铁氧还蛋白-硝酸还原酶(E C:1.7.7.2)、硝酸还原酶(醌)(E C:1.7.5.1)、硝酸还原酶(细胞色素)(E C:1.9.6.1)、亚硝酸还原酶(NO生成)(E C:1.7.2.1)、一氧化氮还原酶(细胞色素C)(E C:1.7.2.5)、氧化亚氮还原酶(E C:1.7.2.4)是反硝化过程的关键酶。固氮酶(E C:1.1 8.6.1)是固氮作用的关键酶。亚硝酸还原酶(E C:1.7.7.1)、96419期宋 宇等:基于宏基因组测序的稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落功能分析表2 C O G功能蛋白注释丰度T a b l e 2 A n n o t a t i o n a b u n d a n c e o f C O G f u n c t i o n a l p r o t e i n处理 T r e a t m e n tY J T C SHX T C S信息存储和处理I n f o r m a t i o n s t o r a g e a n d p r o c e s s i n gA、R NA的加工与修饰R NA p r o c e s s i n g a n d m o d i f i c a t i o n0.0 0 0 0 7 a0.0 0 0 0 6 aB、染色质结构与动力C h r o m a t i n s t r u c t u r e a n d d y n a m i c s0.0 0 0 3 1 a0.0 0 0 3 4 aJ、翻译、核糖体结构与生物发生T r a n s l a t i o n,r i b o s o m a l s t r u c t u r e a n d b i o g e n e s i s0.0 2 1 9 5 a0.0 2 4 4 8 aK、转录T r a n s c r i p t i o n0.0 1 7 6 5 a0.0 1 9 4 3 aL、复制、重组和修复R e p l i c a t i o n,r e c o m b i n a t i o n a n d r e p a i r0.0 3 0 6 5 a0.0 3 2 6 9 a细胞过程和信号C e l l u l a r p r o c e s s a n d s i g n a l i n gD、细胞周期控制,细胞分裂,染色体分配C e l l c y c l e c o n t r o l,c e l l d i v i s i o n,c h r o m o s o m e,p a r t i t i o n i n g0.0 0 3 7 9 a0.0 0 4 2 6 aM、细胞壁/膜/膜生物发生C e l l w a l l/m e m b r a n e/e n v e l o p b i o g e n e s i s0.0 2 4 9 6 a0.0 2 9 1 1 aN、细胞运动C e l l m o t i l i t y0.0 0 1 8 0 a0.0 0 1 8 3 aO、翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白P o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n,p r o t e i n t u r n o v e r,c h a p e r o n e s0.0 1 9 2 1 a0.0 2 2 0 3 aT、信号转导机制S i g n a l t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m s0.0 2 9 5 8 a0.0 3 4 1 7 aU、细胞内转运、分泌和囊泡转运I n t r a c e l l u l a r t r a f f i c k i n g,s e c r e t i o n a n d v e s i c u l a r t r a n s p o r t0.0 0 6 7 5 a0.0 0 7 7 0 aV、防御机制D e f e n s e m e c h a n i s m s0.0 0 8 8 7 a0.0 1 0 0 1 a代谢m e t a b o l i s mC、能源生产和转换E n e r g y p r o d u c t i o n a n d c o n v e r s i o n0.0 4 5 2 2 a0.0 4 9 7 9 aE、氨基酸转运与代谢Am i n o a c i d t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 4 5 0 2 a0.0 5 1 6 0 bF、核苷酸转运与代谢N u c l e o t i d e t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 1 0 6 0 a0.0 1 2 0 4 aG、碳水化合物运输和代谢C a r b o h y d r a t e t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 3 0 4 2 a0.0 3 3 6 0 aH、辅酶转运与代谢C o e n z y m e t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 1 3 5 6 a0.0 1 5 0 3 aI、脂质转运与代谢L i p i d t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 1 3 1 3 a0.0 2 0 3 3 bP、无机离子转运与代谢I n o r g a n i c i o n t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 2 6 5 2 a0.0 2 8 9 6 aQ、次级代谢生物合成、运输和代谢S e c o n d a r y m e t a b o l i t e s b i o s y t h e s i s,t r a n s p o r t a n d m e t a b o l i s m0.0 1 0 0 1 a0.0 1 1 0 2 a表3 碳代谢途径基因注释丰度T a b l e 3 A n n o t a t i o n a b u n d a n c e o f c a r b o n m e t a b o l i s m p a t h w a y g e n e s序号N u m b e r代谢通路标识M e t a b o l i c p a t h w a y代谢途径 I d e n t i f i c a t i o n o f m e t a b o l i s m p a t h w a yY J T C SHX T C S1K o 0 0 0 1 0糖酵解/异生G l y c o l y s i s/G l y c o n e o g e n e s i s0.0 4 6 8 8 a0.0 5 1 2 5 a2K o 0 0 6 3 0乙醛酸和二羧酸代谢G l y o x y l i c a c i d a n d d i c a r b o x y l i c a c i d m e t a b o l i s m0.0 4 6 0 0 a0.0 5 2 9 8 a3K o 0 0 6 4 0丙酸代谢P r o p i o n i c a c i d m e t a b o l i s m0.0 3 5 0 4 a0.0 3 9 7 4 a4K o 0 0 0 2 0三羧酸循环T r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e0.0 4 0 1 9 a0.0 4 5 0 5 a5K o 0 0 5 0 0淀粉和蔗糖代谢S t a r c h a n d s u c r o s e m e t a b o l i s m0.0 3 4 6 7 a0.0 3 6 7 6 a6K o 0 0 6 5 0丁酸代谢B u t y r i c a c i d m e t a b o l i s m0.0 3 7 5 5 a0.0 4 0 2 5 a7K o 0 0 0 3 0戊糖磷酸途径P e n t o s e p h o s p h a t e p a t h w a y0.0 3 2 3 3 a0.0 3 4 8 2 a8K o 0 0 0 4 0戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化 M u t u a l t r a n s f o r m a t i o n o f p e n t o s e a n d g l u c u r o n i c a c i d0.0 0 8 9 2 a0.0 0 9 9 7 a9K o 0 0 6 6 0 C 5支化二元酸代谢C 5 b r a n c h e d d i b a s i c a c i d m e t a b o l i s m0.0 1 1 8 2 a0.0 1 2 7 1 a1 0K o 0 0 5 6 2磷酸肌醇代谢P h o s p h o i n o s i t i d e m e t a b o l i s m0.0 0 6 2 9 a0.0 0 7 3 2 a1 1K o 0 0 6 2 0丙酮酸代谢P y r u v a t e m e t a b o l i s m0.0 5 7 9 7 a0.0 6 3 3 7 b1 2K o 0 0 5 2 0氨基糖和核苷酸糖代谢Am i n o s u g a r a n d n u c l e o t i d e s u g a r m e t a b o l i s m0.0 3 2 7 0 a0.0 3 7 3 1 a1 3K o 0 0 0 5 2半乳糖代谢G a l a c t o s e m e t a b o l i s m0.0 1 3 3 2 a0.0 1 4 9 9 a1 4K o 0 0 0 5 3抗坏血酸和醛酸代谢A s c o r b i c a c i d a n d a l d o i c a c i d m e t a b o l i s m0.0 0 3 3 6 a0.0 0 4 0 8 a1 5K o 0 0 0 5 1果糖和甘露糖代谢F r u c t o s e a n d m a n n o s e m e t a b o l i s m0.0 1 4 6 4 a0.0 1 5 9 7 a1 6K o 0 0 7 2 0原核微生物的碳固定途径C a r b o n f i x a t i o n p a t h w a y o f p r o k a r y o t i c m i c r o o r g a n i s m s0.0 5 3 1 9 a0.0 5 8 5 6 b0741西 北 农 业 学 报3 2卷亚硝酸还原酶(NA DH)(E C:1.7.1.1 5)、亚硝酸还原酶(细胞色素,氨形成)(E C:1.7.2.2)是硝酸盐还原 作 用 的 关 键 酶。谷 氨 酰 胺 合 成 酶(E C:6.3.1.2)、谷氨酸合酶(NA D P H)(E C:1.4.1.1 3)、谷氨酸合酶(NA DH)(E C:1.4.1.1 4)、谷氨酸合酶(铁氧还蛋白)(E C:1.4.7.1)、谷氨酸脱氢酶(E C:1.4.1.2)、谷氨酸脱氢酶NA D(P)+(E C:1.4.1.3)、谷氨酸脱氢酶N A D P+(E C:1.4.1.4)是谷氨酰胺合成作用的关键酶。如图6所示,在反硝化作用中,硝酸还原酶(醌)基因n a r H和n a r Y、铁氧还蛋白-硝酸还原酶基因n a r B、硝酸还原酶(细胞色素)基因n a-p Y、亚硝酸还原酶(NO生成)基因n i r S、一氧化氮还原酶(细胞色素C)基因n o r B和氧化亚氮还原酶基因n o s Z在HX T C S的 相对丰度均 高于Y J T C S。其中铁氧还蛋白-硝酸还原酶基因n a r B和硝酸还原酶(细胞色素)基因n a p Y在HX T C S中的相对丰度都显著高于Y J T C S(P0.0 5)。在固氮作用中,固氮酶基n i f D和n i f K在HX-T C S中的相对丰度略低于Y J T C S。在硝酸盐还原作 用 中,亚 硝 酸 还 原 酶(NAD基 因n i r B和n i r D在HX T C S中的相对丰度和Y J T C S相当,而亚硝酸还原酶n i r A基因和亚硝酸还原酶(细胞色素,氨形成)基因n r f A在HX T C S中的相对丰度要高于Y J T C S。在谷氨酸合成作用中,谷氨酰胺 合 成 酶 基 因g l n A和G L U L、谷 氨 酸 合 酶(NA D P H)基 因g l t B和g l t D、谷 氨 酸 合 酶(NADH)基因 G L T 1、谷氨酸合酶(铁氧还蛋白)基因G L U和g l t S、谷氨酸脱氢酶基因g u d B和r o c G、谷氨酸脱氢酶 NA D(P)+基因 G L UD 1-2、谷氨酸脱氢酶NA D P+基因g d h A在HX-T C S的相对丰度均高于Y J T C S。因此,河蟹引入图5 土壤氮素循环过程F i g.5 P r o c e s s o f s o i l n i t r o g e n c y c l e 图6 氮代谢途径中主要酶基因的相对丰度F i g.6 R e l a t i v e a b u n d a n c e o f m a j o r e n z y m e g e n e s i n n i t r o g e n m e t a b o l i s m p a t h w a y17419期宋 宇等:基于宏基因组测序的稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落功能分析生物有机肥稻田后促进了根际土壤氮循环中的反硝化作用、硝酸盐还原作用及谷氨酸的合成作用。3 讨论与结论为进一步探讨河蟹对生物有机肥稻田的水稻根际土壤微生物群落的影响,利用宏基因组测序技术对土壤微生物群落和功能进行研究。通过N R物种注释发现,微生物均以细菌为主,其次为古菌,真菌和病毒等占比很小。微生物群落门水平的组成分析表明河蟹有机肥稻田的绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度均高于对照组。研究证实,大多数绿弯菌门具有反硝化能力2 0。酸杆菌门具有降解植物残体多聚物、参与铁循环、具有光合能力和参与单碳水化合物代谢的功能2 1。2种稻田根际土壤微生物群落的L E f S e分析结果表明稻蟹共作稻田中富集更加丰富的深古菌门(B a t h-y a r c h a e o t a)和奇古菌门(T h a u m a r c h a e o t a)及隶属于它们的相关目、属。深古菌门是地球上数量最多的古菌群之一,通过宏基因组学研究证实,它们的生理活动与蛋白质和纤维素的降解及以二氧化碳的固定有关2 2。有研究报道奇古菌门菌门是一类可同时参与自然界C、N元素循环的古菌2 3。河蟹引入生物有机肥稻田后,增加了碳水化合物活性酶基因的6大蛋白功能模块即辅助氧化还原酶(AA)、碳水化合物结合模块(C BM)、碳水化合物酯酶(C E)、糖苷水解酶(GH)、糖基转移酶(G T)和多糖裂解酶(P L)的相对丰度。其中GH、G T和P L与对照组Y J T C S的相对丰度差异显著。糖苷水解酶(GH)包括大量参与淀粉、纤维素、木聚糖和几丁质等多糖代谢的酶。碳水化合物结合模块(C BM)可与多糖结合,提高糖苷水解酶(GH)降解复杂碳水化合物的催化效率。碳水化合物酯酶(C E)可降解植物纤维。糖基转移酶(G T)可裂解酸性多糖中的糖苷键。多糖裂解酶(P L)主要作用于阴离子多糖,通过消除机制降解糖苷键。因此,河蟹的引入有助于增强水稻根际土壤微生物对碳水化合物和多糖类物质的降解