基于UPLC-Q-TOF-MS和UPLC技术的不同规格沉香化学成分分析.pdf

基金项目:福建省科技厅项目(.)同为通信作者作者简介:张荣霜女硕士生研究方向:中药学:.通信作者:范世明男正高级实验师硕士生导师研究方向:药用植物学:.许文男副教授硕士生导师研究方向:中药复方药效物质基础:.基于 和 技术的不同规格沉香化学成分分析张荣霜游飘雪朱美玲范世明许文黄鸣清(.福建中医药大学药学院福建 福州.福建中医药大学科技创新与转化中心福建 福州)摘要:目的 建立了一种超高效液相色谱串联四极杆飞行时间杆质谱法()定性鉴定比较 种沉香药材规格(沉香片、沉香虫漏和沉香勾丝)的化学成分并进行化学计量学分析筛选差异标志物采用 法定量分析 种规格沉香中 种差异标志物沉香四醇和 四氢色酮的含量为沉香质量控制及规格区分提供参考 方法 定性分析色谱条件为 色谱柱(.)流动相为乙腈().甲酸水溶液()梯度洗脱流速.柱温 进样量 质谱条件选择电喷雾离子源()负离子检测模式并用、法、热图法分析了沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝 种不同规格沉香之间的化学成分差异 定量分析的色谱条件为 色谱柱(.)流动相乙腈().甲酸水溶液()梯度洗脱流速.柱温 进样量 结果 法鉴定了沉香药材中的 个化学成分、法可以区分沉香片、沉香虫漏和沉香勾丝并筛选得到沉香四醇和 四氢色酮等 个差异性成分 法测定沉香四醇和 四氢色酮含量考察的浓度范围内呈良好的线性关系(.)沉香片中沉香四醇的含量范围为.四氢色酮的含量为.沉香虫漏中沉香四醇的含量范围为.四氢色酮的含量为.沉香勾丝中沉香四醇的含量范围为.四氢色酮的含量为.结论 通过 建立了一种可以快速、准确鉴别沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝 种不同规格沉香中化学成分的方法建立的 法测定沉香中沉香四醇和 四氢色酮含量方法准确、可靠可以为沉香的质量控制提供新的技术手段关键词:沉香超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法超高效液相色谱质量控制中图分类号:文献标志码:文章编号:():./.(.):()().()().(.).().(/)()药学研究 .().()().(.).().(/)().().()(.).().().().().().:沉香为瑞香科植物白木香(.)含有树脂的木材中国药典 年版记载其可行气止痛温中止呕纳气平喘 用于胸腹胀闷疼痛胃寒呕吐呃逆肾虚气逆喘急 现代药理学研究表明沉香具有神经活性、胃肠调节作用、抗菌、抗炎、镇痛、镇静、治疗哮喘、抗氧化、降血糖、抗肿瘤活性等作用沉香在市场上流通存有沉香片、沉香勾丝、沉香虫漏 种规格沉香片是白木香含有树脂的片状木材 沉香勾丝是用钩刀钩剃沉香木取香时往往要剃到白木和沉香油脂的交界处在剃香过程中白木屑上或多或少都附有一些沉香 这种含沉香油脂极少的沉香木屑叫“勾丝”沉香虫漏()为瑞香科植物白木香树体受到天牛、木蠹蛾或白蚁等蛀干类昆虫蛀蚀伤害形成的含有树脂的木材具有圆形或者椭圆形的虫孔、弯曲交错的虫道(木蠹蛾、天牛幼虫等蛀食)或者大小各异、形状不规则的虫孔(白蚁等蛀食)蛀蚀面具有腐木 三者使用方向不同沉香片多用于中药饮片药用价格高昂沉香虫漏和沉香勾丝多用于沉香制燃“香”但是三者打粉后外观类似不易区分甚至影响沉香优质优价然而目前文献关于三者的化学对比鲜有报道近年来超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱()技术已广泛应用于中药材的化学成分研究并且基于质谱的定性鉴定结果利用化学计量学技术可以有效寻找不同规格间差异性成分通过 等技术定量验证可以找到有效区分定量手段因此本研究拟基于 鉴定并比较沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝之间的化学成分差异性同时对 者中差异指标性成分沉香四醇和 四氢色酮(氯(苯乙基)三羟基四氢色酮)的含量进行测定为沉香药材的优劣的判断提供实验依据 仪器与试药.仪器 飞行时间质谱仪(美国 公司)超高效液相色谱仪(美国 公司)超高效液相色谱仪(美国 公司)型十万分之一分析天平(德国 公司)台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)超纯水机(美国 公司)研磨仪德国莱驰()公司.试药 甲醇、乙腈(质谱纯德国 公司)甲酸(色谱纯阿拉丁试剂上海有限公司)沉香四醇对照品(批号:中国食品药品检药学研究 .定研 究 院)四 氢 色 酮(批 号:.)沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝样品由福建中医药大学黄鸣清教授收集并经范世明正高级实验师鉴定均为瑞香科白木香(.)见图 批沉香药材(为沉香片、为沉香虫漏、为沉香勾丝)用于 分析 为沉香片、为沉香虫漏、为沉香勾丝连同 用于 含量测定 样本存放于福建中医药大学药学院标本室.沉香片.沉香虫漏.沉香勾丝图 种沉香药材 方法与结果.色谱与质谱条件.色谱与质谱条件 色谱柱(.)流动相乙腈().甲酸水溶液()梯度洗脱(.)流速.柱温 进样量 飞行时间质谱采用电喷雾负离子模式毛细管电压.喷雾器压力.碰撞能量 脱溶剂气流:氮气流速 脱溶剂温度 锥孔气流:氮气锥孔电压.流速 离子源温度 四极杆离子能量.碰撞气体:氩气 质谱测定数据采用全扫描负离子模式采集数据采集范围/.含量测定色谱条件 色谱柱为 (.)以乙腈为流动相为 以.甲酸水为流动相 梯度洗脱(.)流速为.检测波长为 柱温为.进样量为 .溶液的制备.对照品溶液的制备分别精密称取沉香四醇和 四氢色酮对照品适量分别置于 量瓶中用甲醇溶解稀释至刻度分别制成浓度为 沉香四醇和 的 四氢色酮的单一对照品母液其他不同质量浓度的混合对照品溶液由对照品母液逐级稀释即得.供试品溶液的制备 取各沉香粉末(过三号筛).精密称定置具塞锥形瓶中精密加入乙醇 密塞称定重量浸泡.超声处理 (功率 频率 )放冷再次称定重量用 乙醇补足减失的重量用高速离心机 离心 取上清液用.微孔滤膜滤过 取续滤液 即得供试品溶液 用于 含量测定 精密移取供试品溶液 置于 量瓶中用 甲醇稀释定容至刻度摇匀即得用于 成分鉴定.沉香的化学成分鉴定结果.成分鉴定 沉香样品在“.”项下色谱条件及质谱条件进行分析沉香的乙醇提取液的 总离子流图()(见图).沉香片.沉香虫漏.沉香勾丝图 种不同品类的沉香的总离子流图 化合物的鉴定方法是:首先通过查阅国内外沉香化学成分研究相关文献建立沉香化学成分数据库 其次根据 总离子流图上各药学研究 .个色谱峰所得到的化合物分子离子峰信息通过.软件在 的质量偏差范围内计算其精确分子式与前期已建立的化学成分数据库进行比对对各个色谱峰化合物进行初步鉴定第三为了进一步确认化学结构采用 模式对各个分子离子峰进行碰撞诱导解离()通过二级质谱的裂解获得化合物相应的碎片离子根据碎片离子的精确质量数信息推测质谱裂解情况 共鉴定出沉香中 个化学成分(见表)以峰 为例 给出分子离子峰.为一级质谱离子.质谱软件计算出化学分子式与沉香化学成分数据库比对与文献报道的沉香四醇分子式一致 再根据 二级碎片离子有/经过裂解推测二级质谱上/峰为/为 /为 /为/峰为可能的裂解图(见图)其他化合物的推测使用了相似的策略根据 测得的分子离子峰、二级碎片离子信息由 .软件计算出精确分子量与对照品或文献中报道的沉香化学成分数据进行比对共推测鉴定出 个化合物其中化合物、因为分子离子峰信息与数据库无法匹配但是二级裂解均具有/碎片离子(见图)与 ()母核化合物二级碎片离子相一致因此推测其是()的衍生物结果见表 图 峰(沉香四醇)可能的裂解图表 种不同类别沉香的化学成分鉴定结果序号/分子式误差/以负模式收集的碎片离子鉴定结果.().().().().().().().().().().().().”.()药学研究 .表 (续)序号/分子式误差/以负模式收集的碎片离子鉴定结果.().().().().().().().().多元统计分析 基于上述鉴定结果将所采集的质谱数据先通过 .软件进行峰对齐、峰提取、峰鉴别、归一化等预处理将峰面积数据进行正交偏最小二乘法判别分析()结果见图 将 批沉香中 种成分的峰提取结果绘制聚类热图结果见图.定量测定.专属性试验 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各 按“.”项下色谱条件进样分析 供试品溶液与混合对照品溶液在相同位置具有相同色谱峰专属性良好结果见图.方法学考察.线性关系考察取“.”项下方法制备的对照品溶液用 甲醇稀释配制系列梯度浓度的对照品混合液 按“.”项下色谱条件测定峰面积用对照品质量浓度为横坐标()峰面积为纵坐标()进行回归绘制标准曲线得到回归方程和相关系数结果见表 表 线性关系考察结果成分回归方程线性范围/检测限/定量限/沉香四醇 .四氢色酮 .精密度取“.”项下制备的对照品溶液按“.”项下色谱条件 内连续进样 次测定测定各成分的峰面积分别计算其峰面积的其精密度结果(见表)表明仪器精密度良好.稳定性按“.”项下方法制备供试品 为沉香片 为沉香虫漏 为沉香勾丝图 批沉香样品 得分图()和 值图()溶液(批次)分别于、按“.”项下色谱条件进样测定测定各成分的峰面积求出峰面积的 结果见表 表明供试品溶液在 内稳定.重复性精密称取同一批沉香样品 份(批次)按“.”项下方法制备供试品溶液按“.”项下色谱条件进样测定计算 个化合物的含量及其 结果见表 表明方法重复性良好.回收率 精密称取“.”项下已测知含药学研究 .为沉香片 为沉香虫漏 为沉香勾丝图 批次沉香 个成分峰面积热图分析量的沉香样品(批次)份约.按照重复性试验测得的结果近似 加入近似等量的对照品按“.”项下方法制备供试品溶液按“.”项下色谱条件进样测定待测成分的量计算回收率结果见表 表 各化合物的精密度、重复性、稳定性试验结果()成分精密度稳定性重复性()()质量分数()()沉香四醇.四氢色酮.含量测定分别精密称取不同批次的沉香样品粉末(过 号筛).各 份分别按“.”项下方法制备供试品溶液按“.”项下色谱条件进样测定峰面积计算各批次沉香样品中 种化合物的含量结果见表 表 沉香样品中 个待测成分的回收率试验结果()分析物取样量/样品中含量/加入量/测得量/回收率()平均回收率()()沉香四醇四氢色酮.对照品.沉香片.沉香虫漏.沉香勾丝.沉香四醇峰.四氢色酮峰图 沉香中 个化学成分色谱图表 批沉香各成分的含量()批号沉香四醇四氢色酮批号沉香四醇四氢色酮批号沉香四醇四氢色酮.箱型图分析进一步用 软件根据不同品类的沉香 的含量测定数据结果分析生成沉香四醇和 四氢色酮含量的箱型图如图 所示图 沉香中沉香四醇()和 四氢色酮()含量箱型图(为标准筛选出引起不同批次间差异较大的化学成分发现包括沉香四醇()、四氢色酮()以及化合物 ()()、()、()()、”()、()()、()()、()()、()()、()()、()()、()()、()()、()()、()共 个成分的 值均大于 分提示这些化合物是造成不同批次沉香差异性的主要化学成分并通过进一步的热图分析发现 种不同规格的沉香 个差异性成分的响应差异比较:沉香片中化合物、等响应最大优于沉香虫漏和沉香勾丝但化合物、的响应较小沉香虫漏中化合物、等响应值高于沉香片和沉香勾丝但化合物、的响应值均较低沉香勾丝中大部分化合物的响应值较低仅有化合物 和 响应值相对较高从 定性鉴定并分析筛选了沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝 种规格的差异性成分如何进一步验证其分析的可靠性需要进一步的含量测定验证结合中国药典中沉香指标性成分有沉香四醇()和 四氢色酮()本文进一步利用 技术对两者含量进行测定结果结合箱型图发现沉香片中沉香四醇的含量显著高于沉香虫漏和沉香勾丝沉香虫漏和沉香勾丝没有差别沉香虫漏中 四氢色酮含量显著高于沉香片和沉香勾丝而沉香片和沉香勾丝的含量较为接近 测定含量结果与 和热图分析结果相一致即从定量角度也验证了沉香 种不同规格的差异性并且提示基于 测定沉香四醇和 四氢色酮含量也可以作为不同规格沉香分类的参考依据之一 通过利用 的快速鉴定以及化学计量学的差异分析可以快速筛选中药不同规格中的差异性成分进一步的根据 鉴定结果筛选合适的指标进行 的定量验证并构建定量方法可为从中药复杂体系中发现其规格区分的差异性 提供技术参考综上本试验建立了不同规格沉香药材(沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝)鉴定化学成分的分析方法并建立其化学计量学分析方法 法可同时测定沉香中沉香四醇和 四氢色酮的含量可作为区分不同品种沉香的质量标志物为沉香的质量控制提供新的依据参考文献:国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版(一部).北京:中国医药科技出版社:.:.():.(下转第 页)药学研究 .妆品中 种甘草化学成分的分析及定量检测为化妆品原料和产品的监管提供技术支持参考文献:胡耿黄绮韵张甜等.甘草黄酮类化学成分研究.中草药():.王建国周忠刘海峰等.甘草的活性成分及其在化妆品中的应用.日用化学工业():.张福欣宋佳烜刘晓东等.甘草黄酮抗氧化及免疫活性.中国兽医学报():.包芳白海英彭静文等.栽培甘草的化学成分及其抗菌活性研究.中国现代中药():.周越美冯超史煜华等.甘草浸膏 指纹图谱及多指标成分含量测定研究.中国现代应用药学():.文瑾杨海宁车宏伟等.同时测定疏清口服液中甘草素、甘草酸铵含量.药学研究():.胡婷高智强尹彦超等.法测定乌拉尔甘草与光果甘草中 个黄酮类成分的含量.药物分析杂志():.段伟萍李缘嫒郑云枫等.基于/法分析生、炙甘草中水溶性成分.中成药():.崔园园周永峰马艳芹等.基于 法分析生、炙甘草中化学成分的差异性.中国药房():.马海娟高简张亚丽等.基于 的甘草成分快速鉴定及质谱裂解途径研究.中华中医药杂志():.杜茹芸陆志芸虞成华.高效液相色谱法测定化妆品中光甘草定的含量.香料香精化妆品():.方继辉唐国辉陈张好.反相高效液相色谱法同时测定化妆品中甘草苷和甘草酸的含量.香料香精化妆品():.高俊飞朱荃段婷婷等.超高效液相色谱测定化妆品中 种植物美白成分.日用化学工业():.陆军李莹.高效液相色谱法测定化妆品中 种甘草成分.理化检验(化学分册)():.(收稿日期:)(上接第 页)刘洋洋王帅周岳等.“通体结香技术”所产沉香提取物对胃肠动力及胃溃疡的作用.国际药学研究杂志():.().():.().():.().():.董梦妤焦立超姜笑梅等.沉香的资源分布、识别与贸易现状.木材工业():.周麟.奇楠沉香.上海:上海译文出版社有限公司:.顾小辉王国全周亚奎等.虫漏沉香的基本特征及其品质评价.中国现代中药():.任娟刘晓李伟东等.基于/的白芍炒制前后化学成分研究.世界中医药():.陈俊可曾锐.基于 的代谢组学技术对粗茎秦艽不同部位化学成分研究.中草药():./.():.(收稿日期:)药学研究 .