基于ITS序列PCR-RFLP鉴别北柴胡混伪品藏柴胡.pdf

2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5方药纵横引用：赖晶，倪琳，葡瑞丽，等.基于ITS序列PCR-RFLP鉴别北柴胡混伪品藏柴胡 J.现代中医药，2 0 2 3,43（5）：10 5-112.现代中医药Modern Chinese Medicine105基于 ITS 序列 PCR-RFLP 鉴别北柴胡混伪品藏柴胡赖晶倪琳葡瑞丽靳婉君君刘富强宋平顺马萧滕宝霞（甘肃省药品检验研究院/国家中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃兰州7 30 0 13）摘要：目的基于ITS序列用PCR-RFLP方法鉴别北柴胡药材掺伪藏柴胡的方法。方法分析并筛选出藏柴胡特有的限制性内切酶AseI，用PrimerPremier5.0设计特异性引物，对引物PCR扩增条件和酶切试验进行优化,并对该方法的准确性进行了考察。结果PCR扩增的目的片段为331 bp,且建立的PCR反应方法对不同的酶均具有适应性。限制性内切酶AseI将藏柴胡切成7 9 bp和2 52 bp两个片段,而北柴胡及其他柴胡均不能被酶切，且掺伪检出限为1%。结论PCR-RFLP方法实现了准确鉴别北柴胡中的混伪品藏柴胡。关键词：藏柴胡；北柴胡;ITS;PCR-RFLP；分子鉴定中图分类号：R282.5D0I:10.13424/ki.mtcm.2023.05.020Identification of Mixed and Counterfeit Zang Chaihu fromBei Chaihu Based on ITS Sequence PCR-RFLPLAI Jing NI Lin LIN Ruili JIN Wanjun LIU FuqiangSONG PingshunMA Xiao TENG Baoxia(Gansu Provincial Institute for Drug Control/National Key Laboratory for Quality Control ofTraditional Chinese Medicine and Dried Pieces,Lanzhou 730013,China)Abstract:Objective To identify the adulteration of Bupleurum chinense with Zang Bupleurum chinense based onITS sequence using PCR-RFLP method.Methods Analysis and screening were conducted to identify the specificrestriction endonuclease Ase I in Tibetan Chaihu.Primer Premier 5.O was used to design specific primers,optimize thePCR amplification conditions and enzyme digestion test,and evaluate the accuracy of this method.Results The targetfragment amplified by PCR was 331 bp,and the established PCR reaction method was adaptable to different enzymes.Restrictive endonuclease Ase I cleaves Zang Bupleurum into 79 bp and 252 bp fragments,while Northern Bupleurumand other Bupleurum cannot be cleaved,and the detection limit for adulteration is 1%.Conclusion The PCR-RFLPmethod has achieved accurate identification of the counterfeit Zang Chaihu in Beichaihu.Key words:Zang Chaihu;Bei Chaihu;ITS;PCR-RFLP;Molecular identification文献标识码：A文章编号：16 7 2-0 57 1(2 0 2 3)0 5-0 10 5-0 8*基金项目：国家药监局中药材及饮片质量控制重点实验室项目（2 0 2 1GSMPA-KL03）*通讯作者：滕宝霞，教授。E-mail:现代中医药106Modern Chinese Medicine中华人民共和国药典2 0 2 0 年版收载的柴胡为伞形科植物柴胡（Bupleurumchinense DC.）和狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifoliumWild.）的干燥根,根据性状不同,前者习称“北柴胡”,后者习称“南柴胡”。柴胡作为大宗中药材之一,含柴胡的中成药的品种也有很多,如小柴胡颗粒、柴胡疏肝丸、柴胡滴丸等，不仅具解表散热、疏肝和胃等功效，而且据文献报道,加味小柴胡汤对治疗肺部多重耐药菌感染有明显效果 2 。当前,随着不同地方引进栽培，柴胡属出现很多变种。藏柴胡作为柴胡属变种之一，来源于伞形科植物窄竹叶柴胡 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.var.steno-phyllum（W o l f）Sh a n e t Y.Li 的干燥根,主产于云南，四川、贵州、西藏等部分地区 3。我国贵州省药材标准中又以“竹叶柴胡”的名称收载 4。由于北柴胡野生资源短缺和价格高，药材市场出现了以藏柴胡充当正品北柴胡的现象，影响药效和安全问题，因此建立基源鉴定方法十分必要中国药典和日本药局方通过柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总含量控制柴胡质量，欧洲药典英国药典中药材标准和韩国药典以单一指标成分柴胡皂苷a进行质量控制 5。有文献报道利用HPLC和比色法对柴胡中柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d（SSd)及总黄酮的含量来进行柴胡质量评价 6 。SSd 是 SSa 的差向异构体,Sd除了具有与 SSa 相似的抗炎 7 、抗肿瘤 8 和免疫调节 9 的药理作用,SSd还有特定的药理作用,如抗过敏 10 和抗凋亡 。现报道的文献一般利用柴胡皂苷来鉴别柴胡药材真伪，仅靠单一指标对鉴别真伪有很大的局限性，不能更全面控制柴胡质量。编号名称1野生北柴胡2栽培北柴胡3北柴胡4北柴胡5北柴胡6北柴胡7北柴胡2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5PCR-RFLP是利用特定的限制性内切酶识别特异性序列将PCR扩增产物消化切割成大小不同的DNA片段，可直接用琼脂糖凝胶电泳分辨DNA条带大小及多态性的方法。现已有文献报道关于PCR-RFLP鉴定中药材的真伪鉴别,如大黄 12 、木通 13、泽泻 14、川贝母 15、人参 16 。PCR-RFLP方法不仅可以用于物种鉴定，还可以用于不同产地的地理鉴别 17 。本试验旨在筛选藏柴胡的限制性内切酶,并设计引物，对PCR-RFLP方法优化和考查，从而建立适用于快速、稳定鉴别北柴胡混伪品藏柴胡的方法。1仪器与材料1.1仪器VeritiTM96-Well 型PCR仪;LegendMicro21R型高速冷冻离心机;NanoDrop2000型微量核酸定量仪（美国赛默飞世尔科技公司）；SubCell?GT型电泳仪（美国伯乐公司）;Geldoc-It2315型凝胶成像系统（美国UVP公司）。1.2试剂Plant Genomic DNAKit 200 preps植物基因组 DNA提取试剂盒,2 Taq PCR MasterMix，50TAE天根生化科技（北京）有限公司,PrimeSTAR HS Premix,DL500 DNA Marker(TAKARA),Ase I限制性内切酶（美国NEB公司）,2 TaqPCRStarMix（北京康润诚业生物科技有限公司），琼脂糖（美国Invitrogen公司），GelRed（美国Bioti-um公司）。1.3药材北柴胡对照药材（批号：12 0 9 9 2-201509）购于中国食品药品检定研究院。收集了9批北柴胡和2 1批藏柴胡的干燥根，经甘肃省药品检验研究院宋平顺检验师和马萧主任药师鉴定，具体信息见表1。表1北柴胡和藏柴胡信息表拉丁学名Bupleurum chinenseBupleurum chinenseBupleurum.chinenseBupleurum chinenseBupleurum chinenseBupleurum chinenseBupleurum chinense来源（产地）甘肃省华亭县甘肃省华亭县甘肃省和政县甘肃省武都区甘肃省环县甘肃省镇原县甘肃省陇西县2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.433No.5编号名称80北柴胡北柴胡10藏柴胡11藏柴胡12藏柴胡13藏柴胡14藏柴胡15藏柴胡16藏柴胡17藏柴胡18藏柴胡19藏柴胡20藏柴胡21藏柴胡22藏柴胡23藏柴胡24藏柴胡25藏柴胡26藏柴胡27藏柴胡28藏柴胡29藏柴胡30藏柴胡2方法2.1酶切位点选择及PCR-RFLP引物设计将GenBank数据库中的北柴胡和藏柴胡的ITS序列利用DNAMAN软件比对,北柴胡和藏柴胡的ITS序列存在多个 SNP位点变异，藏柴胡有 Ase I限制性内切酶酶切位点（AT-TAAT）,北柴胡无此酶切位点。通过PrimerPremier5.0软件设计内含此酶切位点的鉴别引物BmF-BmR（见表2），送华大基因（北京）有限公司合成。表2 PCR扩增引物序列引物名称序列(5 to3)BmFGTAACAAGGTTTCCGTAGBmRTTCACACCAAGTATCGCA2.2基因组DNA提取耳取适量药材用7 5%乙醇消毒后用灭菌超纯水冲洗，晾干，粉碎，称取药材粉末约30 mg，置于1.5mL离心管中,采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,加人50 L洗脱缓冲液,于-2 0 保存备用。2.3PCR扩增条件优化现代中医药Modern Chinese Medicine续表1北柴胡和藏柴胡信息表拉丁学名Bupleurum chinenseBupleurum chinenseBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophyllumBupleurum marginatum var.stenophylumBupleurum marginatum var.stenophyllum用1、7、9、10、13号样107来源（产地）陕西省陈仓区山西省陵川县甘肃省正宁县甘肃省镇原县甘肃省陇西县甘肃省康乐县甘肃省临洮县甘肃省临洮县临洮燕园柴胡专营甘肃省临洮县甘肃省临洮县陇西县中泰中药材销售公司甘肃省临洮县临洮燕园柴胡专营临洮燕园柴胡专营甘肃省窑店镇甘肃省临洮县甘肃省临洮县甘肃省陇西县甘肃省药材市场甘肃省陇西县甘肃省陇西县四川药材市场品对特异性鉴别引物进行PCR扩增，为获得最适特异性PCR反应条件,分别考察退火温度（58、6 0、62、6 3）、循环数（2 5、30、35个循环）、不同酶（2 Taq PCR StarMix、Pr i m e ST A R H S Pr e m i x)对 PCR扩增的影响。2.4酶切体系及条件考察用1、7、9、10、13号样品对酶切条件进行优化，分别考察酶切时间（5、10、15、30 和6 0 min）和酶切底物(6、10 和12.5L)。2.5电泳用2.5%的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物及酶切产物，在130 V电压的条件下电泳约50min，然后利用凝胶成像分析仪拍照。3结果分析3.1不同退火温度考察分别设置58,6 0,6 2 和634个退火温度进行考查。退火温度为6 0，扩增条带均清晰可见，无假阳性条带；温度上升至63时,不易扩增出条带。因此,为保证PCR具有良好的重复性,采6 0 作为此方法的退火温度。结果见图1。现代中医药108Modern Chinese Medicine2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5A500bp400bp300bp200bp150bp100bp50bpCM空白500 bp400 bp300bp200bp150bp100bp50bp注:A.58;B.6 0;C.6 2 ;D.6 3;M.D L50 0 D NA M a r k e r;空白.空白对照;1、7、9、10、13分别与样品信息表中的样品对应。3.2不同循环数考察将PCR循环数分别设置为2 5、30、35个循环。2 5、30 个循环时，有清晰的扩增条带；当35个循环时，有假阳性条带出现。因此为保证扩增的稳定性及区分度，选择30 个循环作为扩增循环参数。结果见图2。3.3不同聚合酶考察除上述方法中使用的聚合酶2 TaqPCR Mastermix外，本试验还考察了2 Taq PCR StarMix 酶和 Prime STAR HS PremixAM空白500bp500bp400bp400 bp300bp300bp200bp200bp150bp150bp100bp100bp50 bp50bp注：A.25个循环；B.30个循环；C.35个循环；M.DL500DNAMarker；空白.空白对照图2 不同循环数PCR电泳图ABM空白3500bp400bp300bp200bp150bp100bp50bp3.4酶切体系及条件考察酶切时间分别为5、BM空白910131013图1不同退火温度下PCR电泳图酶对该PCR扩增的影响。PCR反应体系为2 0 L,包括2 TaqPCRMastermix10L,正反向引物0.4L,DNA模板1L,无菌水补足至2 0 L;反应条件为9 43min,30个循环(9 430 s,6020s,722 0 s）,7 2 5m i n。用不同聚合酶均能扩增出单一DNA条带，说明PCR扩增条件适用于不同酶。结果见图3。BCM空白10注:A.2 Taq PCR StarMix;B.Prime STAR HS PremixM空白500bp4005p300bP200515050bpDM空白500bp400bp300bp200bp150bp100bp50 bp1013M空白500bp400bp300bp200bp150bp100bp50bp图3不同酶PCR电泳图10、15、30 及6 0 min，藏柴胡均能被限制性内切酶7M空白500bp400bp300bp200 bp150bp100bp50bp9101310131013102023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5AseI酶切切割成7 9 bp和2 52 bp两条DNA条带。随着酶切反应时间的增长，藏柴胡酶切后的两条DNA条带逐渐变亮。考虑到非特异性扩增和酶切后7 9 bp的DNA条带不清晰引起的误判，酶切时间为1 h。结果见图4。分别设置6、10、12.5L的PCR扩增产物梯度,酶切1 h。北柴胡不能被酶切,藏柴胡被酶切AM空白500bp400bp300bp200bp150bp100 bp50 bpDM空白500bp400bp300 bp200bP150BP100 bp50 bp注：A.酶切时间为5min;B.酶切时间为10 min;C.酶切时间为15min;D.酶切时间为30 min;E.酶切时间为60 minAM空白500bp400bP3006P298150100bp50 bp3.5适用性的考察按照上述PCR-RFLP方法对北柴胡对照药材、9 份北柴胡和2 1份藏柴胡进行鉴别。PCR反应体系为2 0 L,包括2 TaqPCRMastermix10L,正反向引物0.4L,DNA模板1L,无菌水补足至2 0 L;反应条件为9 43min,30个循环(9 4 30 s,60 2 0 s,7 2 20s）,7 2 5m in。结果表明,北柴胡和藏柴胡均能扩增出一条331bp的单一DNA条带（图6 A）。用限制性内切酶AseI酶切后2 1份藏柴胡均被酶切成大小不同的两条条带，分别为7 9 bp和2 52bp;而北柴胡对照药材和北柴胡药材均不能被酶现代中医药Modern Chinese Medicine成7 9 bp和2 52 bp两条DNA条带。随着PCR产物量的增大,酶切后的两条DNA条带逐渐变亮。结果见图5。综上所述,酶切反应总体积2 0 L,反应体系包括10 酶切缓冲液2 L,限制性内切酶AseI（10 U/L）0.4L,PCR反应液10 L,无菌超纯水7.6 L,酶切反应在37 水浴反应1h。BC13M空白500bp400bp300bp100bp50bpE1013图4不同酶切时间下PCR-RFLP电泳图BC791013注：A:PCR扩增产物6 L;B:PCR扩增产物10 L;C:PCR扩增产物12.5L10913M空白500bp400bp300bp200bP150bp100 bp50bpM空白0500bp400B200bp150bp100 bp50bpM空白500bp200bp150bP100 bp50 bp图5不同PCR产物量酶切电泳图切（图6 B）。说明该PCR-RFLP反应方法适用于鉴别藏柴胡。3.6掺伪检出限考察为考察藏柴胡特异性PCR扩增对北柴胡中掺伪藏柴胡的鉴别能力。按0%（北柴胡）、1%、3%、5%、10%、2 5%、50%、75%、10 0%（藏柴胡）比例将藏柴胡掺于北柴胡中,充分混匀即可。使用上述PCR-RFLP方法。掺有1%的藏柴胡,酶切后有很浅的条带；随着藏柴胡掺人量增加，酶切条带越来越清晰。结果见图7。01379131013500bp400bp300bp200bp150bp100bp50bpM空白1013现代中医药110Modern Chinese Medicine2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43No.5AM 空白对照500bp400bp300bp200bp150bp100bp50bpAM空白对照15161718192021222324252627 282930500bp400bp300bp7988100bp50bpM空白对照1B500bp400bp300bp200bp50bpBM空白对照15161718192021 222324252627282930500bp400bp300bp200bp150bp100bp50bp232344556789101112131467891011121314注：A:PCR扩增电泳图;B：A s e I 酶切电泳图。空白：空白对照；对照：北柴胡对照药材图6不同产地北柴胡和藏柴胡样品PCR-RFLP电泳图M 空白对照M空白0500bp400bp300 bp200bP150bp100 bp50 bp图7北柴胡中掺假不同比例藏柴胡的PCR-RFLP电泳图3.7不同产地掺假验证取不同产地的北柴胡与藏柴胡，随机比例掺兑。所有样品均能扩增出一条331bp的单一DNA条带，掺有藏柴胡的混合样均被酶切成7 9 bp和2 52 bp两条DNA条带。结果见图8。35102550 75100(%)500bp400bp300bp200bp168850bp注：空白.空白对照；对照.北柴胡对照药材；1.北柴胡（镇原)掺入藏柴胡（镇原);2.北柴胡（陇西)掺入藏柴胡（临洮）;3.野生北柴胡（华亭)掺入藏柴胡（镇原）;4.北柴胡（和政)掺入藏柴胡（临洮）图8 不同产地混合样品PCR-RFLP电泳图一一2023年9 月第43卷第5期Sep.2023Vol.43 No.54讨论在市场中存在以藏柴胡冒充北柴胡药材或掺杂混用的现象,这严重影响药材质量、药效和用药安全。随着DNA分子鉴定技术越来越成熟，可以从基因层面解决以化学成分为主的传统鉴定带来的不足，为中药材鉴定提供更加准确、可靠的手段。ITS序列是位于核糖体DNA（r D NA）上具有高度重复，各位点间协同进化，可用于属、种的鉴定。谢晖等 18 通过对9 种柴胡属植物进行ITS序列测序后同源性比对,结果发现柴胡属属内两两比对同源性均大于8 8%，同种植物大于9 9%。Lin等 19 对柴胡3个种（柴胡、高氏柴胡、阿尔泰柴胡)设计出序列特异性寡核苷酸探针（SSOP），分别和样品ITS区扩增产物杂交,通过扫描检测可鉴定不同种的柴胡。因DNA测序和DNA芯片技术制备样本时间长及程序多，该方法在日常检验中有一定的局限性。PCR-RFLP方法作为DNA鉴定的方法之一,具有简单、稳定、专属性强和反应灵敏等优势，在药用植物鉴定中发挥着关键作用。本试验以ITS序列作为分子标记,依据北柴胡和藏柴胡的种间差异,筛选藏柴胡的特异性限制性内切酶AseI（A T T A A T）,设计含酶切位点的引物，建立了北柴胡药材及饮片中掺伪藏柴胡的检查方法。PCR-RFLP反应又受到PCR反应体系、反应条件以及酶切时间等的影响,其中,最重要的是退火温度、引物浓度和循环数，引物浓度与退火温度选择不好会造成非特异性扩增,出现假阳性 2 0 。在酶切反应时,底物浓度也会影响酶切的效果,当底物浓度过低可能会导致酶切后的条带不清晰，可能会有一定的误判。本试验对该PCR扩增条件、不同聚合酶、酶切反应条件考察，建立了能够检测北柴胡中含1%藏柴胡掺伪检出限的PCR-RFLP方法。PCR-RFLP方法提高了目的DNA的相对特异性、灵敏度,极大程度降低了PCR的假阳性,保证鉴定结果的准确性。在历年抽检过程中，存在掺杂非药用部位的问题 2 12 2 。本试验存在一定的局限性,因是从北现代中医药Modern Chinese Medicine柴胡和藏柴胡的基源出发，只能定性的鉴别北柴胡中是否掺有藏柴胡,但对于是否掺杂北柴胡非药用部位还有待于解决。但该PCR-RFLP方法依然是可用于鉴别北柴胡中掺伪藏柴胡手段之一，可供质控部门参考使用。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典 M.一部.北京：中国医药科技出版社,2 0 2 0：2 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