环丙沙星对短程硝化-厌氧氨氧化工艺脱氮效能的影响.pdf

第37 卷第5期2023年9 月文章编号：16 7 1-3559(2 0 2 3)0 5-0 559-0 6济南大学学报（自然科学版）Journal of University of Jinan(Science and Technology)Vol.37 No.5Sept.2023D0I:10.13349/ki.jdxbn.20230327.001环丙沙星对短程硝化-厌氧氨氧化工艺脱氮效能的影响许会学1，薛晓东，司光超，张馨文!，冯（1济南大学水利与环境学院，山东济南2 50 0 2 2；2.山东省环境保护科学研究设计院有限公司，山东济南2 50 0 13）马锐，魏东1摘要：为了研究不同浓度的氟喹诺酮类抗生素环丙沙星对短程硝化-厌氧氨氧化工艺的脱氮效能的影响，采用连续流式反应器进行分阶段长期实验；采用紫外分光光度法、高效液相色谱法及三维荧光光谱法，对不同阶段反应器的脱氮效能、环丙沙星去除率及可溶性微生物产物荧光特性进行表征。结果表明：当环丙沙星的质量浓度为0.1mg/L时，反应器出水硝态氮的质量浓度由2 8.7 1mg/L增至4 4.2 8 mg/L，一段时间后恢复稳定；反应器对环丙沙星的耐药性逐渐增强，恢复稳定期不断缩短；环丙沙星能够改变微生物物种丰富度和多样性以及各属的相对丰度。关键词：生物脱氮；短程硝化-厌氧氨氧化工艺；环丙沙星；微生物群落结构；毒性评价中图分类号：X523文献标志码：AEffects of Ciprofloxacin on Operation Efficiency ofPartial Nitritation-Anammox Process开放科学识别码（OSID码）：XU Huixue,XUE Xiaodong”,SI Guangchao,ZHANG Xinwen,FENG Rui,WEI Dong(1.School of Water Conservancy and Environment,University of Jinan,Jinan 250022,Shandong,China;2.Shandong Academy of Environmental Science Co.,Ltd.,Jinan 250013,Shandong,China)Abstract:To investigate effects of fluoroquinolone antibiotic ciprofloxacin with different concentrations on nitrogen removalefficiency of partial nitrification-anammox process,a continuous flow reactor was used to carry out a long-term experimentin stages.Nitrogen removal efficiency,ciprofloxacin removal rate,and fluorescence characteristics of soluble microbialproducts in different stages of the reactor were characterized by using ultraviolet spectrophotometry,high performanceliquid chromatography,and three-dimensional fluorescence spectrometry.The results show that when the mass concentra-tion of ciprofloxacin is 0.1 mg/L,the mass concentration of nitrate nitrogen in effluent water of the reactor increases from28.71 mg/L to 44.28 mg/L,and returns to stability after a period of time.Drug resistance of the reactor to ciprofloxacinincreases gradually,and the period of recovery and stability is shortened continuously.Ciprofloxacin can change richnessand diversity of microbial species as well as relative abundance of each genus.Keywords:biological removal of nitrogen;partial nitrification-anammox process;ciprofloxacin;microbial communitystructure;toxicity assessment目前，畜禽养殖行业污染是广受关注的农业面源污染之一。饲料中通常会加入一定量的抗生素用收稿日期：2 0 2 2-0 6-14基金项目：国家自然科学基金项目（52 2 7 0 0 7 1)第一作者简介：许会学（1997 一），女，山东济南人。硕士研究生，研究方向为水污染监测与控制工程。E-mail：10 30 7 54 57 6 q q.c o m。通信作者简介：魏东（198 5一），男，山东济南人。副教授，博士，硕士生导师，研究方向为水污染控制。E-mail：w e i d o n g 50 6 16 3.c o m。网络首发地址：https:/ 0 2 3-0 3-2 7 T15:03:41560进而对污水厂的稳定运行带来一定影响1,因此开展抗生素对污水处理厂运行效能的影响评价具有重要的研究意义。短程硝化-厌氧氨氧化(PN/A）工艺是一种新型生物脱氮技术,用于有效处理高含量氨氮废水,与传统生物脱氮工艺相比，具有大幅减少耗氧量和无需碳源消耗的优势2 。通常,厌氧氨氧化菌（AnAOB）对抗生素十分敏感,例如四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类等。其中,环丙沙星（CIP）是一种通过抑制革兰氏阴性菌的脱氧核糖核酸（DNA)转录和复制抑制微生物的活性的一种氟喹诺酮类抗生素3,具有抗菌谱广、抗菌性强、药效好和易于吸收等优点，在养殖行业中应用广泛4 。近年来，在污水处理厂中频繁检测到各类抗生素,对脱氮工艺造成一定的影响,因此,本文中考察CIP对PN/A工艺运行效能影响,对于推广PN/A工艺具有重要意义。1材料与方法1.1实验装置与运行方法PN/A反应器采用上流式运行模式，顶部设有滤网进行泥水分离（见图1）。反应器内径和高度分别为12、30 cm,有效容积为3.4 L。实验过程中,反应器填充体积分数为4 0%的K3型微生物填料，单个K3填料直径、高度分别为2 5、12 mm。反应器采用黑色遮光布进行避光遮挡。反应器底部安装磁力搅拌器，以保证废水充分混合，搅拌速度控制为12 0 r/min。曝气过程中，通过气泵将空气引入反应器底部，并控制系统溶解氧(DO)质量浓度稳定在0.5 0.8 mg/L。通过加热棒将反应器温度的稳定控制在30 32，PN/A工艺水力停留时间（HRT)设定为2 4 h。Cb口中串a合成废水a一进水桶；b一溢流口；c一曝气装置；d一温度计；e加热棒；fK3型微生物填料；g磁力搅拌器；P蠕动泵。图1短程硝化厌氧氨氧化反应器济南大学学报（自然科学版）1.2桂模拟废水和接种污泥采用人工模拟废水，进水氨氮质量浓度约为200mg/L。进水通过碳酸氢钠调节反应器内水体pH为7.2 7.8。模拟废水中其他组分如下：磷酸二氢钾，质量浓度为10.0 mg/L；氯化钙，质量浓度为2 2.7 mg/L；七水合硫酸镁，质量浓度为12.3mg/L；微量元素物质成分如表1所示。根据CIP投加量，实验分为4 个运行阶段，第I阶段(1 4 0 d)、第阶段（4 1 10 2 d)、第阶段（10 3 12 4 d)和第IV阶段(12 5 16 0 d）。4 个阶段的CIP投加量分别为0、0.1、5、10 mg/L。接种污泥为实验室处理高氨氮废水的PN/A污泥，初始污泥质量浓度(MLSS)控制在4.0 g/L。表1微量元素浓度类型物质FeSO47H20微量元素IEDTAZnSO4 7H,0CoCl,6H,OMnCl,4H,0CuSO45H,0微量元素NaMo042H,0NiCl26H,0NaSe0410H20H,BO4EDTA注：EDTA为乙二胺四乙酸。1.3测定项目及分析方法1.3.1水质测试d采用紫外分光光度计（7 52 N型，上海仪电分析有限公司），根据国家标准GB/T7479一19 8 7、GB/T74931987和环境保护行业标准HJ/T3462007中的方法定期检测出水氨氮（NHt-N）、亚硝态氮（NO,-N）、硝态氮（NO;-N）的含量。NO;-N测试前f利用离子吸附树脂进行预处理，避免水样中CIP测a试干扰。采用高效液相色谱仪（Agilent1260型，美国安捷伦科技有限公司)测定CIP浓度5,色谱P环丙沙星g第37 卷质量浓度/(mg/L)5.00050004302409902502201902101415000柱为C18柱，柱温为4 0,测试波长为2 7 8 mm，流动相中磷酸与乙腈的体积比为8 2:18。1.3.2微生物产物分析溶解性微生物产物（SMP）的三维荧光光谱图使用荧光光度计仪（LS-55型，美国Perkin-Elmer公第5期司)获得。仪器参数设定如下：发射波长E为2 0 0 400nm，增量为10 nm；激发波长E为2 8 0 550 nm，间隔5nm，增量为0.5nm;激发狭缝和发射狭缝均保持在10 nm，扫描速率设置为2 4 0 0 nm/min。1.3.3细胞活性检测采用活性氧试剂盒（S0033S型，碧云天生物技术有限公司）和乳酸脱氢酶释放检测试剂盒（C0016型，碧云天生物技术有限公司）6 检测微生物样品胞内活性氧水平和乳酸脱氢酶释放。1.3.4微生物分析方法收集4 个不同阶段的微生物样品进行冷冻保存并送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16 S核糖体核糖核酸(rRNA)检测。通用引物对采用515F806R（5-G T G CCA G CM G CCG CG G T A A-3）和（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)对 16 S rRNA基因的高变区V4进行扩增7 ,使用Silva（Re l e a s e 138）240第1阶段第阶段第阶段第IV阶段220200180(1/u)/泌鲁望160140120100806040200在反应4 0 d后，向PN/A反应器中投加CIP至质量浓度为0.1mg/L（第阶段）。由图2（a）可知,在反应 4 1 8 0 d,出水 NH-N、NO z-N、NO;-N的质量浓度分别为0.7 7、2.0 1、4 4.2 8 mg/L。NO 3-N浓度增加说明系统的脱氮性能受到轻微干扰，CIP的存在使AnAOB菌活性受到抑制,但未对AOB菌的活性造成明显的抑制 。此外，刚投加CIP的前5d，CI P去除率在30%左右，主要是通过污泥吸附作用去除，一段时间后CIP的去除率降低至10%以下，说明CIP在污泥中已经达到吸附饱和，且生物降解作用不大，由于CIP对微生物的胁迫作用影响了系统脱氮过程，因此系统无法再去除CIP。图2(b)还显示，第阶段CIP的去除率从30.14%逐渐降低到19.56%，说明当污泥吸附达到饱和后，CIP将不再被去除。在反应92 10 2 d，出水NO;-N许会学,等：环丙沙星对短程硝化-厌氧氨氧化工艺脱氮效能的影响样品的群落物种组成。2结果与讨论2.1PN/A反应器的脱氮效能PN/A反应器脱氮效能如图2 所示。通过控制温度及曝气量等条件，使PN/A反应器的脱氮效能达到最优并维持稳定（第I阶段）。由图2（a）可见，第I阶段的NH-N去除率达到97.10%，出水NO3-N、NO z-N的平均质量浓度分别为2 8.7 1、1.49mg/L，实现了短程硝化菌（AOB）和AnAOB菌同步生长，且PN/A系统中NO;-N的积累量占NH+-N消耗量的15%,接近11%的理论值8 ,因此PN/A反应器运行效果良好，在不改变现有调控条件的情况下可进行下一阶段的CIP毒性试验阶段。107第阶段8进水CIP(/u)/吾望出水CIP-进水NH,-N6+出水NH,-N+出水NO;-N+出水NO;-N20406080100120 140160时间/d(a)氮素浓度的变化图2 短程硝化厌氧氨化工艺脱氮效能质量浓度降低至2 3.6 0 mg/L，与对照阶段相似，说明微生物对低浓度的CIP具有耐药性10 ，经过一段时间的适应期后，对微生物的抑制作用减弱，从而恢复了PN/A反应器的脱氮效能。从反应10 3d起，反应器中CIP的质量浓度增加至5mg/L(第阶段）。由图2(a)可看出,在反应103110d,出水NO;-N的质量浓度由2 8.30 mg/L增加至6 3.32 mg/L,在经过持续7 d的增加后,开始降低至2 4.7 7 mg/L，可认为PN/A工艺在质量浓度为5mg/L的CIP刺激下,对AOB菌的活性未造成明显影响，但抑制了反硝化菌（NOB)的活性，促进PN/A反应器脱氮效能的恢复。在反应12 5d后继续增加CIP的质量浓度至10mg/L（第IV阶段）。由图2（a)可知，出水NO;-N的质量浓度开始出现波动并持续增加至4 0.0 5mg/L，561数据库（http:/www.arb-silva.de）统计4 个微生物第阶段第IV阶段40.80.60.40.24060(b)环丙沙星(CIP）的去除80时间/d100120140562在反应14 5d后降低至2 4.99mg/L后逐渐平稳，CIP没有被明显去除，表明PN/A反应器可承受质量浓度为10 mg/L的CIP冲击负荷，并在短时间内可恢复至出水NH-N、NO;-N质量浓度分别为O、19.56mg/L的脱氮性能。在经过12 0 d左右的由低浓度到高浓度的CIP刺激下，PN/A反应器对CIP的耐药性逐渐增强，随着时间的延长各阶段的恢复期缩短，系统表现出了良好的脱氮性能。2.2溶解性微生物产物SMP是一种水溶性的异构复合体，主要包含腐殖质、蛋白质、多糖等，广泛的存在于污水处理系统中1。图3是PN/A工艺4 个运行阶段的SMP三维荧光光谱图。其中，图3(a)是第I阶段（未投加CIP)在不同Ex、E处有2 个特征峰，分别是A峰(E,=270290 nm,Em=350nm)和B峰(E,=210230nm，Em=4 2 5n m），分别属于色氨酸类和芳香类400相对强度380-25.0036055.00135.0340215.0295.0320375.0300455.0535.0280全260240220200300400380360340320300280260240220200300350激发波长Em/nm(c)第阶段图3溶解性微生物产物（SMP）三维荧光光谱2.3徐微生物细胞活性及毒性响应在不同浓度的CIP刺激下微生物细胞活性氧(ROS)水平和乳酸脱氢酶（LDH）释放量的变化如图4 所示。从图4(a)中可以看出,ROS水平与CIP济南大学学报（自然科学版）蛋白质类物质。相较于图3（a），图3(b)是第阶段（CIP的质量浓度为0.1mg/L），在Ex、E分别为2 50 2 90、350 nm和2 0 0 2 2 0、4 2 5nm处各有1个特征峰，属于腐殖酸类物质，由于腐殖酸类物质与细胞外酶可以形成稳定的复合物，因此可以抵抗热变性、脱水和蛋白水解。SMP中腐植酸类物质能够对活性酶提供更好的保护，保证酶的活性12 。图3(c)中C、D、E峰是第阶段(CIP的质量浓度为5mg/L），相对强度分别为38 2.17、7 7.19 和159.52，而在图3(d)（CI P的质量浓度为10 mg/L)中，3个峰的相对强度分别增大至97 9.8 4、14 9.8 6和4 31.56，可能是在高浓度抗生素的刺激下微生物的代谢作用逐渐增强所致。为了抵抗毒性物质的胁迫作用，PN/A反应器产生更多的微生物产物，以强化、恢复和稳定系统的性能。400380360340320300280615.0695.0775.0855.0935.0350400激发波长Em/nm(a)第I阶段峰日峰峰D400450第37 卷相对强度-25.0055.00135.0215.0295.0375.0455.0535.0峰C615.0260695.0775.0240855.0220935.0峰D200450500500550550相对强度-25.0055.00135.0215.0295.0375.0455.0535.0615.0695.0775.0855.0935.0300400380360340320300280260240220200300浓度呈正相关,ROS 水平增大会引起细胞的凋亡13。由于一般好氧菌有内源性的抗氧化系统来处理活性氧的不良影响，因此在质量浓度为5mg/L的CIP刺激下不会产生过多的ROS,然而,更高浓度的CIP350400450500激发波长Em/nm(b)第阶段峰日峰山350400激发波长Em/nm(d)第IV阶段550相对强度-25.0055.00135.0215:0295.0375.0455.0535.0615.0695.0775.0855.0935.0450500550第5期则刺激更多活性氧的产生。当CIP的质量浓度大于10mg/L时,细胞分泌过多的ROS,破坏细胞抗氧化系统，消耗大量内源性抗氧化剂，导致细胞大量凋亡,ROS开始攻击蛋白质、酶和DNA，使整个AOB菌和AnAOB菌的代谢相关酶失活，影响PN/A反应器的脱氮效能14 微生物细胞在受到抗生素的刺激后会向外界450400350300%/SO25020015010050第I阶段第阶段第阶段第IV阶段反应器运行阶段(a)细胞活性氧(ROS)水平图4 不同的环丙沙星（CIP）浓度下细胞活性氧水平和乳酸脱氢酶释放2.4微生物群落结构特征采用16 SrRNA扩增子测序技术对不同实验阶段的微生物样品进行检测，得到微生物群落结构及相对丰度如图5所示。从图中可以看出，在不同浓度的CIP刺激下，PN/A反应器中微生物的生长环%/706050403020100第I阶段第阶段第阶段第IV阶段(b)属水平图5反应器不同运行阶段微生物群落结构及相对丰度许会学，等：环丙沙星对短程硝化-厌氧氨氧化工艺脱氮效能的影响1009080706050403020100第I阶段第阶段第阶段第IV阶段(a)门水平100一其他90一地下水假红育菌属Pseudoxanthomonas80norank-f-norank-o-SBR1031-微白霜菌属Micropruina-JG36-GS-52一魏氏柠檬酸杆菌属Vicinamibacteraceae-SWB02-暖蝇菌属Caldilineaceae一厌氧氨氧化菌属Candidatus_Brocadia-MBNT15-厌氧氨氧化菌属Candidatus_Kuenenia563释放LDH，根据LDH的含量可以判断细胞膜是否被破坏，因此LDH含量也是细胞毒性评价的指标。如图4(b)所示，LDH含量随着CIP的浓度增加并没有明显的变化，系统中微生物细胞的完整性可以得到修复，说明PN/A反应器中的微生物随着时间延长逐步对CIP具有耐药性和恢复脱氮效率的能力。180160140%/吾HaT120100806040200第I阶段第I阶段第阶段第IV阶段反应器运行阶段(b)乳酸脱氢酶(LDH)释放量境发生变化，从而引起4 个阶段的微生物群落结构发生变化。如图5（a)所示，在微生物门水平主要门分别为变形菌门Proteobacteria、浮霉菌门Planctomycetes、绿弯菌门Chloroflexi和拟杆菌门Bacteroidetes。这4其他-芽单胞菌门Gemmatimonadetes疣微菌门Verrucomicrobiae-变形菌门NB1-j-放线菌门Actinobacteria酸杆菌门Acidobacteriae拟杆菌门Bacteroidota大肠杆菌门MBNT15绿弯菌门Chloroflexia浮霉菌门Planctomycetes变形菌门Proteobacteria564种优势菌种的比例从第I阶段到IV阶段呈上升趋势。其中,绿弯菌门属于兼性厌氧菌15,其相对丰度从第阶段的16.5%下降到第四阶段的10.1%。变形菌纲的相对丰度由第阶段的18.4%增加到第阶段的38.3%，而发育期末期则下降到2 4.4%，通过利用细菌分泌的胞外聚合物增强生物膜结构，提高抵抗抗生素胁迫作用的能力。此外，浮霉菌门的相对丰度从11.8%（第阶段）增加到2 3.9%（第IV阶段）。浮霉菌门属于革兰氏阴性菌，是一种厌氧菌，多生长在淡水区域且大多数细菌具有脱氮功能,其中包含AnAOB菌16 。在CIP长期暴露下，PN/A反应器的优势门绿弯菌门和浮霉菌门逐渐增加。另外,随着实验时间的增加和CIP浓度的增加，芽单胞菌Gemmatimonadota对CIP的敏感度提升，导致其相对丰度显著降低17 。在属水平上，假丝酵母菌属CandidatusKuene-nia作为典型的AnAOB菌,在PN/A反应器中为优势菌（见图5(b)），其相对丰度在第阶段为12.6%,在第阶段下降至4.6%，在第IV阶段略有上升至9.4%。典型的AOB菌属Nitrospira也在反应器中被发现,相对丰度在第阶段为3.4%,在第IV阶段结束时降至1.3%。3结论本文中选用CIP作为典型抗生素,对PN/A反应器处理含抗生素的高氨氮废水时的脱氮性能进行研究,并评价了不同浓度的环丙沙星对PN/A反应器中微生物群落的毒性影响，得到以下主要结论：1)在CIP的长期刺激下,PN/A反应器对 CIP显现出一定的耐药性，各实验阶段的恢复期缩短，系统具有长期稳定的脱氮性能。2)在CIP的抑制作用下,溶解性微生物产物的主要成分是腐殖酸类和蛋白质类物质，通过增强微生物的代谢作用来抵抗CIP的胁迫作用，强化、恢复并稳定PN/A反应器的脱氮性能。3)高浓度的CIP会刺激细胞产生更多ROS,而LDH可以稳定释放，保证了微生物具有恢复脱氮效率的能力。4)CIP对PN/A反应器的微生物群落结构有明显影响,优势菌种的增多保证了系统脱氮性能的稳定性。参考文献：1 HUANG L,XU Y B,XU J X,et al.Antibiotic resistance genes济南大学学报（自然科学版）21LI H Y,YAO H,LIU T,et al.Achieving simultaneous nitrogenand antibiotic removal in one-stage partial nitritation-anammox(PN/A）p r o c e s s J.En v i r o n m e n t I n t e r m n a t i o n a l,2 0 2 0,14 3:105987.3唐琳钦，覃容华，叶紫裕，等厌氧氨氧化过程毒性物质的胁迫及其活性研究J.水处理技术，2 0 2 1，4 7(7)：2 5.4WESTB M,LIGGIT P,CLEMANS D L,et al.Antibiotic resist-ance,gene transfer,and water quality patterms observed in water-ways near CAFO farms and wastewater treatment facilities J.Water,Air,&Soil Pollution,2011,217(1/2/3/4):473.5 金燕琴高效液相色谱法测定盐酸环丙沙星的含量J中国实用医药，2 0 11,6(8)：4 1.6武原原，李姗姗，吴淑妍，等。Ni2*和金霉素共存对序批式反应器性能、微生物活性及其微生物群落的影响J中国海洋大学学报（自然科学版），2 0 2 1，51（10）：8 9.7HAN F,ZHANG M R,SHANG H G,et al.Microbial communitysuccession,species 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