宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1表达及与术后复发的关系.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1表达及与术后复发的关系文丽芳1 丁洁21山西医科大学汾阳学院（山西汾阳032200）；2山西省汾阳医院（山西汾阳 032200）【摘要】目的探讨宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与根治术后复发的关系。方法选择2019年10月至2021年4月在医院接受宫颈癌根治术治疗的患者107例作为研究对象，并选择30例子宫良性病变手术切除患者作为对照组；随访1年根据随访结果分为复发组（n=25）和未复发组（n=82）。实时荧光定量检测（qPCR）组织SLIT3、SPARCL1 mRNA 表达水平，免疫组化检测SLIT3、SPARCL1蛋白表达水平，分析SLIT3、SPARCL1蛋白表达与临床病理特征相关性，COX模型分析影响宫颈癌患者根治术后复发的危险因素。结果107 例根治术患者中 25 例患者复发，复发率为 23.36%；SLIT3 低表达患者术后复发率（31.15%）显著高于SLIT3高表达患者术后复发率（13.04%），SPARCL1低表达患者术后复发率（32.31%）显著高于SPARCL1高表达患者术后复发率（9.52%），差异有统计学意义（P 0.05）。宫颈癌组SLIT3、SPARCL1 mRNA表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P 0.05）；复发组患者宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA水平显著低于未复发患者，差异有统计学意义（P 0.05）。宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1蛋白表达与分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度相关（P 0.05）。COX单因素分析显示，分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度、SLIT3蛋白表达、SPARCL1蛋白表达与宫颈癌患者根治术后复发相关（P 50%、SLIT3蛋白低表达、SPARCL1蛋白低表达是影响宫颈癌患者根治术后复发的独立危险因素（P 0.05）。结论宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1水平均低于正常宫颈组织，SLIT3、SPARCL1蛋白低表达是影响宫颈癌根治术后复发的独立危险因素，对预测宫颈癌术后复发具有一定的临床意义。【关键词】宫颈癌；术后复发；SLIT3；SPARCL1【中图分类号】R737.33Study on the relationship between the expression of SLIT3 and SPARCL1 protein and the recurrence after radical operation in cervical cancer WEN Lifang*，DING Jie.*Fenyang College，Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China【Abstract】Objective To investigate the relationship between the expression of SLIT3 and SPARCL1 protein and the recurrence of cervical cancer after radical operation.MethodsFrom October 2019 to April 2021，107 patients who underwent radical surgery for cervical cancer in the hospital were selected as the study subjects，and 30 patients with benign uterine lesions were selected as the control group；The patients were followed up for 1 year and were divided into relapse group（n=25）and non relapse group（n=82）according to the follow-up results.The expression levels of SLIT3 and SPARCL1 mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative analysis（qPCR），and the expression levels of SLIT3 and SPARCL1 protein were detected by immunohistochemistry.The correlation between the expression of SLIT3 and SPARCL1 protein and clinicopathological characteristics was analyzed.Cox model was used to analyze the risk factors of cervical cancer recurrence after radical operation.ResultsThe expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer group was significantly lower than that in control group（P 0.05）；The levels of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of patients with recurrence were significantly lower than those of patients without recurrence（P 0.05）.Among 107 patients with radical operation，25 patients recurred，the recurrence rate was 23.36%.The postoperative recurrence rate of patients with low expression of SLIT3（31.15%）was significantly higher than that of patients with high expression of SLIT3（13.04%）.The postoperative recurrence rate of patients with low expression of SPARCL1（32.31%）was significantly higher than 临 床 研 究doi：10.3969/j.issn.1006-5725.2023.15.009基金项目：山西省高等学校科技创新项目和哲学社会科学研究项目（编号：2022L672）；吕梁市社会发展领域重点研发计划项目（编号：2021SHF49）1907实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15that of patients with high expression of sparcl1（9.52%）.The difference was statistically significant（P 0.05）.The expression of SLIT3 and SPARCL1 in cervical cancer was correlated with the degree of differentiation，clinical stage，lymph node metastasis and depth of stromal invasion（P 0.05）.Cox univariate analysis showed that the degree of differentiation，clinical stage，lymph node metastasis，stromal invasion depth，SLIT3 protein expression and SPARCL1 protein expression were correlated with the recurrence of cervical cancer patients after radical surgery（P 50%，low expression of SLIT3 protein and SPARCL1 protein were independent risk factors for recurrence of cervical cancer patients after radical surgery（P 50%共84例，50%共23例。本次研究获得医院伦理委员会会议表决通过后实施。1.2治疗方法和标本采集所有患者均符合手术指征，根据患者肿瘤大小、临床分期、病理分级等采取标准及个体化的手术及术后辅助治疗5。术中采集患者宫颈癌组织液氮保存备用。1.3实验方法（1）提取组织总 RNA：标本组织剪碎加入 Trizol 试剂（福州飞净生物科技有限公司，货号：PH1420）600 L 和 400 L 充分研磨组织；1.5 mL EP管收集研磨液，5427R超低温离心机（德国艾本德公司）4、12 000 r/min离心15 min；离心后取上清液转移至新EP管中，按1：1体积加入异丙醇，充分混匀后静置10 min再次离心分离；去上清后加入 75%酒精 1 mL，充分混匀后离心；再次去上清，冰上晾干残留酒精，加入适量DEPC水，吹打混匀后溶解提取RNA；使用UV5Nano超微量分光光度计（梅特勒-托利多国际有限公司）测定样本 RNA 浓度，A260/280 在 1.8 2.0 区间内为合格，-20 冰箱保存待用。（2）根据试剂盒说明书准备逆转录反应体系，将 FastKing RT Enzyme Mix加到cDNA去除步骤反应中，充分混匀后42 孵育 15 min；95 孵育 3 min 后合成的 cDNA 反应液-20 保存待下游荧光定量检测。（3）实时荧光定量检测（PCR）：采用 FastKing 一步法 RT-PCR试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司，目录号：KR123，配制扩增反应体系；待测溶液离心后于7500 Fast 实时荧光定量PCR系统（美国赛默飞公司）中检测，参数设置：95 预变性 15 min，95 10 s退火，60 32 s延伸，40 cycles。反应结束后收集数据，计算相对表达水平。SLIT3引物序列：1908实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15上游：ATCAACTGCCTGCGGGTAAA；下游：CAAG-TGGCAGTCGCAAACAA；SPARCL1 引 物 序 列：上游：TTGGCTCCTGGTGTTAGTTC，下游：ATCCTGC-TCTTGG-TTTCCTT。（4）免疫组化检测：标本组织固定于载玻片上，经烘烤、二甲苯浸泡、风干后置于浓度递减的乙醇中静置，每个浓度 5 min；高温抗原修复后将切片洗涤3次；分别加入一抗兔抗人重组抗体（SLIT3 和 SPARCL1，美国 Abcam 公司，货号：ab198726、ab255597），4 冰箱孵育过夜；次日组织表面滴加即用型山羊抗兔二抗；加入预先调制好的DAB显色液进行显色。苏木素染色，按组织按照浓度由低到高排列，分别在不同浓度乙醇、二甲苯、甲苯中静置5 min，树胶封片。根据着色程度和面积进行评分，着色按照强、中、弱、无分别计 3 分、2 分、1 分和 0 分；视野面积超过 75%计4分，超过50%计3分，超过25%计2分，未超过25%计1分。将二种评分方法得出的分数相乘作为最终分数（0 12 分）。5 12 分为高表达，1 4 分为低表达，0 分为不表达。高表达为高表达组，低表达或不表达为低表达组。1.4随访以术后第1天作为随访起点，术后12个月期满或患者复发作为随访终点；每 3 个月通过电话、门诊、住院等多种方式结合的方法进行1次随访；所有患者未失访。1.5统计学方法采用 SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。计量资料经检验符合正态分布采用“x s”表示，独立样本间差异采用 t 检验，多组间比较采用方差分析；不符合正态分布采用非参数检验。采用 COX 回归模型分析术后复发因素。P 0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1随访结果所有患者均随访1年，其中25例患者复发，82例患者未复发。2.2SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宫颈癌、正常宫颈组织中表达宫颈癌组SLIT3、SPARCL1 mRNA表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P 0.05）。见表1。2.3SLIT3、SPARCL1 mRNA 在复发、未复发患者宫颈癌组织中表达复发组患者宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA 水平显著低于未复发患者，差异有统计学意义（P 0.05）。见表2。2.4宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与术后复发107例根治术患者中25例患者术后复发，复发率为 23.36%；根据 SLIT3、SPARCL1 免疫组化检测结果分为SLIT3低表达组（61例）、SLIT3高表达组（46 例）、SPARCL1 低表达组（65 例）、SPARCL1高表达组（42例）。SLIT3低表达患者术后复发率（31.15%）显著高于SLIT3高表达患者术表1SLIT3、SPARCL1 mRNA在宫颈癌、正常宫颈组织中表达Tab.1Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA incervical cancer and normal cervical tissuesx s组别宫颈癌组对照组t值P值例数10730SLIT3 mRMA0.24 0.181.27 0.0530.9340.000SPARCL1 mRNA0.15 0.181.35 0.2131.0870.000ABCD注：A，SLIT3在正常宫颈组织中的表达；B，SLIT3在宫颈癌组织中的表达；C，SPARCL1在正常宫颈组织中的表达；D，SPARCL1在宫颈癌组织中的表达。HE 染色，200图1免疫组化检测SLIT3、SPARCL1在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达Fig.1Immunohistochemical detection of the expression of SLIT3 and SPARCL1 in cervical cancer and normal cervical tissue表2SLIT3、SPARCL1 mRNA在复发、未复发患者宫颈癌组织中表达Tab.2Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patientsx s 组别复发组未复发组t值P值例数2582SLIT3 mRMA0.120.110.280.155.9460.000SPARCL1 mRNA0.090.080.170.152.5520.0121909实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15后复发率（13.04%），SPARCL1低表达患者术后复发率（32.31%）显著高于SPARCL1高表达患者术后复发率（9.52%），差异有统计学意义（P 50%、淋巴结转移、中/高分化程度、a 分期赋值为 1。COX 单因素分析显示，分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度、SLIT3表达、SPARCL1表达与宫颈癌患者根治术后复发相关（P 50%、SLIT3 低表达、SPARCL1 低表达是影响宫颈癌患者根治术后复发的独立危险因素（P 45岁 45岁病理类型 鳞癌 腺癌分化程度 低 中/高临床分期 a/b a淋巴结转移 有 无肿瘤最大径 4 cm 4 cm基质浸润深度 50%50%例数7334782927806245258235728423SLIT3低表达（n=61）451647141051471485318434318高表达（n=46）2818311517291531172917294152值2.0131.2385.87821.2538.3250.6615.399P值0.1560.2660.0150.0000.0040.4160.020SPARCL1低表达（n=65）41245015857442175821444520高表达（n=42）3210281419231824182414283932值2.0241.35914.6656.45814.6720.0128.440P值0.1550.2440.0000.0110.0000.9120.0041910实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.153讨论作为早期宫颈癌的主要治疗方法，宫颈癌根治术有效提高了患者总生存率6-7，但是术后复发率尤其是局部复发居高不下，术后复发和转移仍旧是临床面临的重要难题。术后辅助放疗、化疗及同步放化疗是宫颈癌患者生存获益的主要方式。通过更多的特异性指标预测患者术后复发对于患者预后意义重大。神经导向因子是一种在神经系统发育过程中调控神经元的发生与迁移、对神经元轴突传达吸引或排斥信号的生物分子，包括 SLITS、Ephrins、Semaphorins 等诸多分子家族8-10。许多神经导向因子和炎症、肿瘤发展等病理过程密切相关。相关研究发现，SLIT/Robo信号通路可调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、侵袭、粘附等，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥巨大作用11。有研究指出，SLIT3在多种肿瘤组织中的表达显著低于正常组织，且SLIT3低或过表达会影响肿瘤增殖、侵袭等行为12。NARAYAN等13研究显示，SLIT3/Robo信号通路相关蛋白在宫颈癌组织中低表达或不表达，可能是由于DNA甲基化调控导致的。SPARCL1是细胞基质蛋白（SPARC）中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白家族成员。SPARCL1蛋白是具有抗粘附、抗增殖和抗致癌效果的细胞基质蛋白，调控细胞间粘附、迁移和侵袭，可通过调节肿瘤生长和分化参与肿瘤的发生与发展14。近年来相关研究显示，SPARCL1在多种恶性肿瘤组织中的表达下调甚至缺失，这也加快了肿瘤的侵袭和转移15。相关研究发现 SPARCL1 与宫颈癌发病过程中的癌前病变和迁移过程有关，可能是一种新的癌症预测标志物，也是宫颈癌发生和发展的潜在治疗靶点16。本研究中，宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA表达明显低于正常宫颈组织，且与术后未复发患者比较，术后复发患者宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA 表达明显偏低，同时宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1蛋白表达与分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度相关，提示宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1在宫颈癌病情发展和预后中有重要参与。对SLIT3、SPARCL1蛋白表达分组患者研究显示，低表达患者术后复发率明显高于高表达患者，提示SLIT3、SPARCL1蛋白表达与患者术后复发密切相关。通过COX单因素和多因素分析显示，中/高分化、a分期、淋巴结转移、基质浸润深度 50%、SLIT3低表达、SPARCL1低表达是影响宫颈癌患者根治术后复发的独立危险因素，可作为宫颈癌根治术预后预测的有效指标。综上所述，宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征和术后复发关系密切，具有成为宫颈癌病情和预后评估的生物标志物的潜力。表5COX单因素分析Tab.5COX single factor analysis因素分化程度临床分期淋巴结转移基质浸润深度SLIT3SPARCL10.7150.7820.6180.7340.7800.823S.E.0.2560.3020.2580.2700.2780.315Wald7.5110.838.825.318.959.77P值0.0080.0030.0070.0110.0060.005OR1.8792.2352.0121.7522.1252.22495%CI1.562 3.3521.781 4.8701.562 3.3951.324 3.2741.420 4.1541.512 4.079表6COX多因素分析Tab.6COX Multi-factor Analysis因素中/高分化a分期淋巴结转移基质浸润深度50%SLIT3蛋白低表达SPARCL1蛋白低表达0.5620.7950.6350.5740.4230.825S.E.0.2120.2850.3010.2150.2540.247Wald7.128.897.565.458.158.19P值0.0060.0020.0060.0090.0050.005OR1.7581.9861.9151.5621.8932.01295%CI1.420 3.3591.514 4.8541.435 4.0121.185 2.7931.450 3.3141.545 4.1581911实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15【Author contributions】WEN Lifang and DING Jie：experimental design and implementation.DING Jie：experimental evaluation and data processing.WEN Lifang：writing the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.参考文献1 庞然然，李扬，韩丽萍.血清miR-367、miR-383表达水平与宫颈癌根治术后复发及预后的相关性 J.现代肿瘤医学，2021，29（7）：1196-1200.2 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