非洲猪瘟疫苗研究进展.pdf

饲料博览2023年第4期非洲猪瘟疫苗研究进展时云朵1，孙豪2*，曹恬雪3，郑灿财4（1.四川省水产学校，成都611730；2.雅安市农业农村局，四川雅安625000；3.资阳市雁江区农业农村局，四川资阳641399；4.四川省农业规划建设服务中心，成都610041）摘要：非洲猪瘟是非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、出血性和高度接触性的传染病，最急性和急性感染病死率近100%。猪是非洲猪瘟病毒的唯一自然宿主，该病对养猪业危害巨大，由于非洲猪瘟病毒基因组庞大和免疫逃逸机制复杂，目前尚未有针对该病的有效疫苗，经研究分析，研制基因缺失疫苗和弱毒疫苗前景较为乐观。文章概述了非洲猪瘟疫苗研制面临的挑战和进展，以期为非洲猪瘟疫苗开发及应用提供参考。关键词：非洲猪瘟；基因缺失；弱毒株疫苗中图分类号：S851.33；S852.5+2文献标志码：A文章编号：1001-0084（2023）04-0020-05Research Progress on African Swine Fever VaccineSHI Yunduo1,SUN Hao2*,CAO Tianxue3,ZHENG Cancai4(1.Sichuan Aquacultural Technology School,Chengdu 611730,China;2.Yaan City Bureau of Agriculture,Yaan 625000,Sichuan China;3.Ziyang City Yanjiang Distric Bureau of Agricultural,Ziyang 641399,Sichuan China;4.Sichuan Provincial Agricultural Planning and Construction Service Center,Chengdu 610041,China)Abstract:African swine fever(ASF)is an acute,febrile,hemorrhagic and highly contact infectious diseasecaused by African swine fever virus(ASFV).The mortality rate of the most acute and acute infections isnearly 100%.Swine is the only natural host of ASFV,which does great harm to the pig industry.Due to the largegenome and complex immune escape mechanism of this virus,there is no effective vaccine against the disease atpresent.Through researches and analyses,the development of gene deletion vaccine and attenuated vaccine isoptimistic.An overview of the challenges faced and the progress in the development of African swine fever vaccineswas provided,with the aim of providing references for the development and application of African swine fevervaccines.Key words:African swine fever(ASF);attenuated gene;deletion strain vaccine收稿日期：2023-07-29作者简介：时云朵（1989），女，河北石家庄人，兽医师，硕士，研究方向为预防兽医学。*通信作者：孙豪（1990），男，四川巴中人，兽医师，硕士，研究方向为预防兽医学。非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种猪的传染病，于 1921 年首次在肯尼亚被发现 1，因其临床症状与传统猪瘟高度相似，且发现于非洲而被命名为非洲猪瘟。目前，全球ASF疫情复杂严峻，多国发生ASF疫情，自2018年8月以来，我国先后发生多起ASF疫情，严重威胁生猪产业发展。为全力做好疫情防控，世界多国开展了ASF疫苗研究，我国也紧急开展了疫苗、免疫机制等科技攻关，对ASFV的基因组和免疫机制等方面的研究取得了较大进展，为ASF的疫苗研究奠定基础。本文概述了ASF疫苗研制面临的挑战和研究进DOI:10.20041/ki.slbl.2023.04.004综述Review202023年第4期饲料博览展，为ASF疫苗开发提供参考。1非洲猪瘟疫苗研制面临的挑战1.1非洲猪瘟病毒的形态与结构ASFV呈20面体对称，直径为175215 nm，由外囊膜、衣壳、内囊膜、核壳和类核组成。外囊膜的形态与细胞质膜的“单位膜”特征相似，通过宿主细胞膜获得外囊膜 2。衣壳有17 280个蛋白质，1 个主衣壳蛋白 p72 与 4 个次衣壳蛋白（M1249L、p17、p49和H240R）构成5个不对称子和3个对称子结构；次衣壳蛋白形成一个复杂的网络，通过将邻近的衣壳体连接在一起来稳定衣壳，形成衣壳的骨架 3。内囊膜呈单层脂质膜样，源于宿主细胞内质网，含有蛋白 p12、p17、p54 和 pE248R 等 4。核壳是一层厚约30 nm的蛋白层，围绕着类核，主要由蛋白pS273R和聚蛋白pp220及pp62的加工产物构成；蛋白pp220被加工为蛋白p150、p37、p34和p14等，pp62可衍生为蛋白p35和p15等，组成核壳的 6 种主要成分，占病毒粒子总质量的32%4。上述结构细节揭示了ASFV结构稳定性和组装的基础，为ASF疫苗研发开辟了途径。1.2非洲猪瘟病毒具庞大基因组ASFV属非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是唯一双链闭合线性DNA虫媒病毒 5。1995年首次完成ASFV的全基因组测序 6，其基因组的末端是发卡环结构，紧邻末端的是由串联重复序列和多基因家族构成的可变区，中间部分则是比较稳定的基因区 7。可变区基因拷贝数的变化是造成不同地区ASFV分离株基因组大小存在差异的主要因素 8，根据p72基因末端核苷酸的差异分析，现已鉴定出24种ASFV基因型，其中基因1型、2型和8型毒力最强，我国首次发现的ASFV毒株（SY18株）属于基因 2 型 9。ASFV 的 DNA 分子长度为 170193 kb，含 150167 个开放阅读框，编码 150200 种蛋白质10，编码蛋白中已知功能的数量相对较少，制约了ASFV的疫苗研究。1.3非洲猪瘟病毒的免疫逃逸机制ASFV能在自然宿主软蜱和野猪体内复制，弱毒株能引起猪的持续性感染，而绝大部分灭活疫苗无保护作用，即使添加新型免疫佐剂也不能提高灭活疫苗的保护力，提示ASFV具有逃避宿主防御系统的有效机制。ASFV基因组不具有感染性，主要在巨噬细胞的胞浆内进行复制，是一个高度受调控的过程11。ASFV编码许多调节宿主细胞对病毒感染应答的蛋白，其主要策略是调节感染巨噬细胞的信号传导途径，从而干扰大量免疫调节基因的表达。如在ASFV感染早期表达的A238L能够抑制宿主细胞NF-B和NFAT信号通路10，从而调节宿主基因表达；而在感染晚期表达的凋亡抑制蛋白pA224L能够激活NF-B信号通路，通过抑制细胞凋亡，促进ASFV感染细胞的存活，最终利于病毒自身的繁殖与扩散。同时，ASFV感染过程中表达的pDP71L能促进翻译起始因子eIF2a磷酸化，使宿主细胞持续合成蛋白质，抑制自噬体的形成，并抑制细胞凋亡，从而促进病毒在细胞内的大量复制10。目前，对ASFV的研究仍存在较大空白，特别是免疫逃逸机制。持续深入研究ASFV编码蛋白鉴定和蛋白功能，有助于了解ASFV编码蛋白与宿主细胞间的相互作用机制，为研发ASF疫苗提供理论基础。2非洲猪瘟疫苗类型2.1灭活疫苗灭活疫苗是采用物理或化学方式消除病原微生物的致病性，保留免疫原性而获得的疫苗。因制作灭活疫苗的技术成熟，最早被用在ASF疫苗的研制上，但不能提供有效的保护性。即使S.Blome等12将当时最先进的免疫佐剂（Polygen、Emulsigen-D）加入ASFV灭活制剂后免疫仔猪，虽免疫猪均产生了特异抗体，但未观察到免疫保护作用，还轻微加速了临床过程。但开发新型的免疫佐剂，仍是制作有效ASFV疫苗的新尝试。2.2弱毒疫苗弱毒疫苗是预防ASF的潜力最大的疫苗。目前，主要有天然弱毒株疫苗、传代培养弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗。与灭活疫苗相比，弱毒疫苗能够诱导强烈持久的细胞、体液免疫应答，同源保护率高，对免疫动物能提供较高水平的保护，但存在毒力返强的可能，临床副作用严重，生物安全隐患较大。2.2.1天然弱毒株疫苗目前，ASFV 的天然弱毒株有 ASFV/NH/P68、OUR/T88/3、Lvl7/WB/Riel。研究表明，ASFV/NH/P68能促进T淋巴细胞与NK细胞的活性，免疫接种后的猪能抵御ASFV/L60毒株的攻击13，但部分接种猪出现肺炎、流产等多重感染14。经 OUR/T88/3 免疫接种后的猪能抵御 OUR/T88/1、BeninReview综述21饲料博览2023年第4期97/1和genotype X Uganda毒株的攻击。随着CD8+T淋巴细胞的消耗，免疫效果减退15-16，表明该疫苗的保护性存在CD8+T淋巴细胞依赖性，且有异源保护的可能，但免疫的猪会出现发热、关节肿胀等临床症状。Lvl7/WB/Riel 减毒株经口服免疫野猪后能抵御 Arm07 强毒株的攻击，保护率达到92%，但该疫苗生产困难，且可产生高热、肺炎、运动障碍等副作用。因此，生物安全风险限制了天然弱毒株作为防控疫苗的实际使用价值与可行性。2.2.2传代培养弱毒株疫苗ASFV可在猪源细胞系如Vero与CV1细胞内不断传代培养，降低其毒力。A.D.Sereda等17将经猪骨髓细胞传代培养后的弱毒株接种猪，结果表明，弱毒株对同源强毒株的攻击可以提供有效的保护。A.Lacasta等18将经CV1传代致弱的E75CV1毒株免疫接种猪后，产生了与亲本不同的免疫途径，能抵御同源毒株的攻击，但不能抵御异源毒株。西班牙、葡萄牙曾利用传代致弱毒株免疫猪却产生灾难性后果。近年来，随着分子生物学技术的进步，尤其是基因编辑技术的突破性进展，基于自然毒株弱化的方式已逐渐被淘汰，因此传代培养弱毒株是未来有望推向市场的候选疫苗，俄罗斯研制的传代细胞适应株（Arriah CV-1株）已被欧盟作为重点研究的候选株19。2.2.3基因缺失弱毒株疫苗利用基因编辑、同源重组等现代分子生物学技术敲除ASFV的毒力相关基因，获得基因缺失毒株，用于疫苗研制。目前，研究主要集中在敲除免疫逃逸基因或与病毒复制有关的基因。M.V.Borca等20敲除ASFV-G10分离株的8D基因，获得ASFV-G-8DR 基因缺失株，通过肌肉注射和滴鼻接种的方式接种猪后，表现出与ASFV-G相同的毒力，且病毒血症值也没有差异，表明8DR基因的缺失与ASFV-G分离株的毒力明显下降无关。而P.L.Monteagudo 等21敲除 ASFV-BA71 分离株的EP402R基因，获得BA71CD2基因缺失株，免疫接种后，诱导特异性 CD8 T 细胞识别同源株BA71、异源株 E75 及 ASFV-G，产生交叉保护作用。此外，V.ODonnell等22敲除ASFV-G07株的9GL基因，获得ASFV-G-9GL基因缺失株，肌肉注射接种后，可以抵御同源毒株的攻击，继续敲掉UK基因，获得ASFV-G-9GL/UK双基因缺失株，接种后，对于同源毒株的攻击提供100%的保护，且安全性比 ASFV-G-9GL 更高。表明，在ASFV基因缺失弱毒株疫苗研究时，为减弱毒力，提高保护性，要采取不同毒株敲除不同的基因或同一毒株同时敲除几个基因的方式。因此，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的Chen W.等23同时敲除ASFV的7个基因，构建ASFV基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，免疫接种SPF猪、商品猪和怀孕母猪，能抵御强毒株的攻击，且未见返强，表明该基因缺失株具有较好的保护性和安全性，有望用于ASF防控中，但交叉保护性有待进一步验证。2.3基因工程疫苗2.3.1亚单位疫苗亚单位疫苗是利用特异性基因和蛋白的表达来产生特异性免疫应答的一类疫苗，具有安全性高、特异性强的特点。ASF亚单位疫苗主要是利用真核或原核细胞作为表达载体，表达具有中和表位的保护性抗原基因（如结构蛋白基因p12、p30、p54、p72、pp62和膜蛋白基因CD2v等），产生的蛋白质或多肽诱导机体产生中和抗体，然而已研发的亚单位疫苗尚不能有效抵御强毒株的攻击。G.P.Paulino等24认为ASFV的p72、p54及p30蛋白疫苗能够抑制病毒的依附及内化过程，从而影响病毒复制，在病毒攻击易感细胞后中和病毒，但免疫接种后的猪不能抵御强毒株的攻击。J.G.Neilan等25利用杆状病毒表达ASFV的p30、p54、p72及p22蛋白，免疫接种猪后均可有效诱导产生中和抗体，能延迟猪发病，但不能提供有效的免疫保护。J.K.Jancovich等26用痘病毒表达ASFV的47个蛋白，免疫接种后，致死剂量的强毒株攻击后，猪的血液和淋巴组织中病毒基因组水平显著降低，表明单一抗原引起的机体免疫应答不足以提供全面的保护。M.V.Murgia 等27利用甲型病毒载体表达ASFV的p30、p54和p72蛋白先行免疫接种启动免疫原性，然后用减毒活病毒疫苗加强免疫的策略，能扩大对ASFV表位的识别。齐艳丽等28利用大肠杆菌载体，结合细胞融合技术，获得ASFV的p54蛋白单克隆抗体，其最低效价为1 2 500，与猪伪狂犬病等病毒不发生交叉反应，能识别p54蛋白C端127-146aa肽段。这表明鉴定更多的ASFV保护性抗原，是提高亚单位疫苗免疫效力的思路。综述Review222023年第4期饲料博览2.3.2DNA疫苗ASF的DNA疫苗与亚单位疫苗相似，前者是将ASFV的抗原基因克隆入真核表达载体后，直接导入机体内，在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而激活猪特异性的体液免疫和细胞免疫。但其免疫原性与亚单位疫苗相似。J.M.Argilaguet等29-30和A.Lacasta等31研究发现，用ASFV的基因（P54、P30）构建的重组质粒DNA疫苗（pCMV-PQ），接种小鼠后能诱导免疫反应，而免疫猪却不能诱导免疫反应；为提高猪的免疫应答，将ASFV基因（P54、P30、sHA）与猪白细胞抗原特异性抗体或血凝素构建新的重组质粒DNA疫苗（pCMV-APCH1PQ、pCMV-sHAPQ），可成倍增强猪的免疫应答，但不能抵御强毒株的攻击；为增强诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应，将ASFV基因（P54、P30、sHA）及泛素融合构建重组质粒 DNA 疫苗（pCMV-UbsHAPQ），在缺乏抗体的情况下诱导特异性T细胞应答，且部分免疫猪抵御了ASFV的致命攻击，表明T细胞免疫与预防 ASF密切相关；为证明存在具有保护潜能的CD8 T细胞决定因子，构建了包含4 000多个单个质粒克隆的表达库，每个克隆随机包含ASFV基因组的Sau3AI限制性片段（p54、p30和血凝素）融合到泛素，用该表达库免疫猪，对E75强毒株致死攻击的保护率为60%，表明ASFV基因组中存在额外的保护性决定因素。2.3.3病毒活载体疫苗细胞免疫在ASF防控中扮演重要角色，而CTL的效应更是免疫效果的保证，因此，可利用病毒活载体在机体内持续复制与表达的特性研制病毒活载体疫苗。目前，常用腺病毒、伪狂犬病病毒、牛痘病毒或新城疫病毒作为载体构建疫苗，可有效刺激细胞免疫和CTL效应。S.Lokhandwala等32-33研制的腺病毒载体的非洲猪瘟病毒抗原具有免疫原性，能引起猪强烈的免疫反应，但不能抵御强毒株的攻击34-35。表明病毒活载体疫苗免疫保护效力需要进一步评价。3小结ASF在国内已得到有效控制，但其危害性不可忽视，研发安全有效的ASFV疫苗仍是当下亟须解决的问题。目前，在ASFV基因序列、功能结构、入侵方式及宿主对其免疫应答等方面的研究取得了较大进展，并尝试了多类别的疫苗研发，虽获得了一定的效果，但仍没改变尚无有效疫苗可用的现状，应持续深入加强病毒与宿主相互作用的基础性研究。弱毒活疫苗能持续诱导机体产生中和抗体，成为可提供高效、安全的保护性疫苗的首选，但毒力返强问题是其致命弱点，因此采用现代生物学技术，敲除毒力基因，获得减毒基因缺失株是研制疫苗值得关注的研究方向。同时，更高效的免疫佐剂探索、更多的抗原位点识别研究及多种疫苗的相互联用，也是今后值得关注的方向。此外，高效安全的特异性疫苗虽是防治ASF的最佳手段，但在疫苗研制举步维艰的情况下，可采用针对病毒转录复制过程来抑制病毒增殖，如RNA干扰技术、有机试剂阻断技术等，同时要持续加强生物安全风险控制，切断病毒传播途径，同样也能达到防控ASF的目的。参考文献 1 MONTGOMERY E R.On a form of swine fever occurring inBritish east Africa(Kenya colony)J.Journal of ComparativePathology&Therapeutics,1921,34:159-191.2 BROOKES S M,DIXON R L K,PARKHOUSE M E.Assembly ofAfrican swine fever virus:quantitative ultrastructural analysis invitro and in vivoJ.Virology,1996,224(1):84-92.3 WANG N.ZHAO D M.WANG J L,et al.Architecture of Africanswine fever virus and implications for viral assemblyJ.Science,2019,366:640-644.4 SALAS M L,GANDR S.African swine fever virus morphogenesisJ.Virus Research,2013,173(1):29-41.5 DIXON L K,ABRAMS C C,BOWICK G,et al.African swinefever virus proteins involved in evading host defence systemsJ.Veterinary Immunology&Immunopathology,2004,100(3/4):117-134.6 YEZ R J,RODRGUEZ J M,NOGAL M L,et al.Analysis of thecomplete nucleotide sequence of African swine fever virusJ.Virology,1995,208(1):249-278.7 DIXON L K,CHAPMAN D,NETHERTON C L,et al.Africanswine fever virus replication and genomicsJ.Virus Research,2013,173(1):3-14.8 孙怀昌.非洲猪瘟病毒研究进展J.中国预防兽医学报,2006,28(1):117.9 花群俊.非洲猪瘟十大特点及防控策略J.云南农业科技,2019(1):55-57.10王晓丽,孙蕾,刘文军,等.非洲猪瘟病毒编码蛋白功能研究进Review综述23饲料博览2023年第4期展J.微生物学通报,2019,46(7):1827-1836.11王涛,孙元,罗玉子,等.非洲猪瘟防控及疫苗研发:挑战与对策J.生物工程学报,2018,34(12):1931-1942.12BLOME S,GABRIEL C,BEER M.Modern adjuvants do not enhance the efficacy of an inactivated African swine fever virus vaccine preparationJ.Vaccine,2014,32(31):3879-3882.13GIL S,SEPLVEDA N,ALBINA E,et al.The low-virulent African swine fever virus(ASFV/NH/P68)induces enhanced expression and production of relevant regulatory cytokines(IFN,TNFand IL12p40)on porcine macrophages in comparison to the highlyvirulent ASFV/L60J.Archives of Virology,2008,153(10):1845-1854.14ARIAS M,TORRE A D L,DIXON L,et al.Approaches and perspectives for development of African swine fever virus vaccinesJ.Vaccines,2017,5(4):35.15OURA C A L,DENYER M S,TAKAMATSU H,et al.In vivodepletion of CD8+T lymphocytes abrogates protective immunity toAfrican swine fever virusJ.Journal of General Virology,2005,86(Pt 9):2445-2450.16KING K,CHAPMAN D,ARGILAGUET J M,et al.Protection ofEuropean domestic pigs from virulent African isolates of Africanswine fever virus by experimental immunisationJ.Vaccine,2011,29(28):4593-4600.17SEREDA A D,BALYSHEV V M,KAZAKOVA A S,et al.Protective properties of attenuated strains of African swine fever virusbelonging to seroimmunotypes-J.Pathogens,2020,9(4):274.18LACASTA A,MONTEAGUDO P L,NGELES J M,et al.Liveattenuated African swine fever viruses as ideal tools to dissect themechanisms involved in viral pathogenesis and immune protectionJ.Veterinary Research,2015,46(1):1474.19戈胜强,张潇月,吕艳,等.非洲猪瘟病毒细胞传代致弱株研究进展J.中国动物检疫,2021(6):76-81.20BORCA M V,ODONNELL V,HOLINKA L G,et al.Deletion ofCD2-like gene from the genome of African swine fever virusstrain Georgia does not attenuate virulence in swineJ.ScientificReports,2020,10(1):494.21MONTEAGUDO P L,LACASTA A,LPEZ E,et al.BA71CD2:a new recombinant live attenuated African swine fever virus withcross-protective capabilitiesJ.Journal of Virology,2017,91(21):e01058-e0105817.22ODONNELL V,RISATTI G R,HOLINKA L G,et al.Simultaneous Deletion of the 9GL and UK Genes from the African swinefever virus Georgia 2007 isolate offers increased safety and protection against homologous challengeJ.Journal of Virology,2016,91(1):e01760-e01716.23CHEN W,ZHAO D,HE X,et al.A seven-gene-deleted Africanswine fever virus is safe and effective as a live attenuated vaccine inpigsJ.Science China Life Sciences,2020,63(5):623-634.24PAULINO G P,RODRGUEZ F,OVIEDO J M,et al.Neutralizingantibodies to different proteins of African swine fever virus inhibitboth virus attachment and internalizationJ.Journal of Virology,1996,70(8):5689-5694.25NEILAN J G,ZSAK L,LU Z,et al.Neutralizing antibodies toAfrican swine fever virus proteins p30,p54,and p72 are not sufficient for antibody-mediated protectionJ.Virology,2004,319(2):337-342.26JANCOVICH J K,CHAPMAN D,DEBRA T,et al.Immunization ofpigs by DNA prime and recombinant vaccinia virus boost to identify and rank African swine fever virus immunogenic and protective proteinsJ.Journal of Virology,2018,92(8):e02219-e02217.27MURGIA M V,MOGLER M,CERTOMA A,et al.Evaluation ofan African swine fever(ASF)vaccine strategy incorporatingpriming with an alphavirus-expressed antigen followed by boostingwith attenuated ASF virusJ.Archives of Virology,2019,164(2):359-370.28齐艳丽,刘桃雪,于海,等.非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体植被及抗原表位鉴定J.畜牧兽医学报,2023,54(1):281-292.29ARGILAGUET J M,PREZ-MARTN E,GALLARDO C,et al.Enhancing DNA immunization by targeting ASFV antigens toSLA-bearing cellsJ.Vaccine,2011,29(33):5379-5385.30ARGILAGUET J M,PREZ-MARTN E,NOFRARAS M,et al.DNA vaccination partially protects against African swine fevervirus lethal challenge in the absence of antibodiesJ.PLoS ONE,2012,7(9):e40942.31LACASTA A,BALLESTER M,MONTEAGUDO P L,et al.Expression library immunization can confer protection against lethalchallenge with African swine fever virusJ.Journal of Virology,2014,88(22):13322-13332.32LOKHANDWALA S,SURYAKANT D W,JOCELYN B,et al.Induction of robust immune responses in swine by using a cocktail of adenovirus-vectored African swine fever virus antigensJ.（下转第30页）综述Review24饲料博览2023年第4期support for treatment of hepatic lipidosis in a llamaJ.Journal-American Veterinary Medical Association,2000,217(10):1531-1535.24DULPHY J P,DARDILLAT C,JAILLER M,et al.Comparativestudy of forestomach digestion in llamas and sheepJ.Reproduction Nutrition Development,1997,37(6):709-725.25LEMOSQUET S,DARDILLAT C,JAILLER M,et al.Voluntaryintake and gastric digestion of two hays by llamas and sheep:influence of concentrate supplementationJ.The Journal ofAgricultural Science,1996,127(4):539-548.26National Research Council(US).Nutrient requirements of smallruminants.sheep,goats,cervids and new world camelidsM.Washington DC:National Academy Press,2007.27MCDOWELL L R,ARTHINGTON J D.Minerals for grazing ruminants in tropical regionsJ.Minerals For Grazing Ruminants inTropical Regions,2005,46(9):789-791.28王帅,张巧灵.羊驼的中国化养殖J.安徽农业科学,2009,49(20):9491-9492.29刘红岩,何淑平,马宪隆,等.反刍动物营养中必需的微量元素:钴J.北方牧业,2023,21(2):28.30张济福.钴的营养学功能及其在畜禽生产中的应用J.养殖与饲料,2020,19(1):49-53.31KINCAID R L,LEFEBVRE L E,CRONRATH J D,et al.Effect ofdietary cobalt supplementation on cobalt metabolism and performance of dairy cattleJ.Journal of Dairy Science,2003,86(4):1405-1414.32KINCAID R L,BLAUWIEKEL R M,CRONRATH J D.Supplementation of copper as copper sulfate or copper proteinate forgrowing calves fed forages containing molybdenumJ.Journal ofDairy Science,1986,69(1):160-163.33杨在宾,贾志海,李淑青,等.日粮钼、铜水平对肉牛铜生物学利用率和需要量的影响J.中国农业大学学报,2007,12(2):45-49.34VAN SAUN R J.Nutritional requirements and assessing nutritionalstatus in camelidsJ.Veterinary Clinics:Food Animal Practice,2009,25(2):265-279.35VAN SAUN R J.Vitamin D and phosphorus interrelationships inalpacasJ.Penn State Extension,2016,88(2):1-3.36BABAZADEH D,RAZAVI S A,ABD EL-GHANY W A,et al.Vitamin D deficiency in farm animals:a reviewJ.Nutrition,2022,1(1):10-16.37HERDT T H.Blood serum concentrations of selenium in femalellamas(Lama glama)in relationship to feeding practices,region ofUnited States,reproductive stage,and health of offspringJ.Journal of Animal Science,1995,73(2):337-344.38SAN MARTIN HOWARD F A.Comparative forage selectivity andnutrition of South American camelids and sheepD.State of Texas:Texas Tech University,1987.39FRASER M D,BAKER D H.A comparison of voluntary intakeand in vivo digestion in guanacos(Lama guanicoe)and sheep given fresh grassJ.Animal Science,1998,67(3):567-572.40JOHNSON L W.Nutrition of llamasJ.Veterinary clifiics of northAmerica:Food Animal Practice,1989,5(1):98-99.41JOHNSON L W.Llama nutritionJ.The Veterinary Clinics ofNorth America:Food Animal Practice,1994,10(2):187-201.42STLZL A M,LAMBERTZ C,HUMMEL J,et al.Dry matterintake and feed selection in South American