钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究.pdf

3342钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究韩丽芳，等钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究韩丽芳，田树红海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南海口57 1199【摘要】目目的：基于小动物活体成像检测技术，探讨重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基（rhCNB）的肝癌靶向性。方法：采用肿瘤组织块法建立BALB/c裸小鼠荷人肝癌细胞SMMC-7721原位肝癌模型。原位肝癌模型建立第14天时，按荷瘤动物体重大小随机分为FITC标记的rhCNB（r h CNB-FI T C）给药组和FITC对照组，每组12 只，各取6 只分别用于给药后2 h、2 4h 剖解取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏用小动物活体成像系统进行荧光检测。另取未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠随机分为rhCNB-FITC给药组和空白对照组,rhCNB-FITC给药组12 只，各取6 只分别用于给药后2 h、2 4h 剖解取相同的脏器进行荧光检测。空白对照组6 只,剖解取出相同的脏器进行荧光检测。结果：rhCNBFIT C给予未接种肿瘤的正常动物2 h时，主要分布于动物的肾脏、肝、胃、心和肺，脾脏未见明显分布；2 4h时，主要分布于动物的肾脏，肝、胃、心、肺和脾脏未见明显分布。在原位肝癌模型试验中,rhCNB-FITC给药2 h 时,主要分布于肝肿瘤、肾脏、肺、胃和心脏等组织器官，脾脏内未检测到明显荧光;FITC给药组只有在肝和胃组织中能检测到荧光，而且荧光强度明显弱于rhCNB-FITC给药组;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部（包括正常组织和肝肿瘤组织）的荧光强度比较,P0.01,具有显著统计学意义。rhCNB-FITC给药2 4h时,主要聚集在肝肿瘤、胃、肾脏和肺等组织器官,其中rhCNB在肝肿瘤部位的浓度最高;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝肿瘤部的荧光强度比较,P0.05，具有统计学意义。结论：重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基具有良好的肝癌靶向性。【关键词】原位肝癌；钙调蛋白磷酸酶B亚基；肿瘤靶向性；活体成像系统【中图分类号】R735.7【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.18.002【文章编号】16 7 2-4992（2 0 2 318-3342-0 5Study on the targeting of the B subunit of calmodulin phosphatase in liver cancerHAN Lifang,TIAN ShuhongHainan Drug Safety Evaluation Research Center,Hainan Medical College,Hainan Haikou 571199,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h e t a r g e t i n g o f r e c o mb i n a n t h u ma n c a l mo d u l i n p h o s p h a t a s e B s u b u n i t (r h C-NB)in liver cancer based on small animal imaging.Methods:The in situ liver cancer model of BALB/c nude mousewith human hepatoma cell SMMC-7721 was established by tumor tissue block method.On the 14th day after the es-tablishment of the in-situ liver cancer model,the animals were randomly divided into FITC-labeled rhCNB(rhCNB-FITC)administration group and FITC control group according to their body weight.There were 12 tumorous mice ineach group,and 6 mice were dissected 2 h and 24 h after administration to remove the heart,lung,liver,stomach,bi-lateral kidney and spleen for fluorescence detection by small animal imaging system.18 normal BALB/c nude micewithout tumor inoculation were randomly divided into rhCNB-FITC administration group and blank control group.A-mong them,6 blank control group were dissected and the same organs were taken out for fluorescence detection.rhC-NB-FITC administration group of 12,6 of the same organs were dissected at 2 h and 24 h after administration for flu-orescence detection.Results:rhCNB-FITC was mainly distributed in the kidney,liver,stomach,heart and lung ofnormal animals without tumor inoculation for 2 h,but not in the spleen.At 24 h,it was mainly distributed in the kid-ney,but not in the liver,stomach,heart,lung and spleen.In the in-situ liver cancer model test,rhCNB-FITC wasmainly distributed in liver tumor,kidney,lung,stomach,heart and other tissues and organs after 2 h administration,and no obvious fluorescence was detected in the spleen.Fluorescence was detected only in liver and stomach tissues inFITC administration group,and the fluorescence intensity was significantly lower than rhCNB-FITC administration【收稿日期】20230323【修回日期】2023-04-24【基金项目】海南省自然科学基金资助项目（编号：8 18 MS068）【作者简介】韩丽芳（198 2 一），女，河南安阳人，助理研究员，研究方向：创新药物的药理学与毒理研究。E-mail：448 37 52 0 6 q q.c o m【通信作者】田树红（198 0），男，云南大理人，副研究员，研究方向：创新药物的药理学与毒理研究。E-mail：18 0 8 98 6 2 90 0 16 3.c o m型Modern Oncology 2023,:3342-33463343：MODERNONC.31.No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学group.The comparison of fluorescence intensity of liver(including normal tissue and liver tumor tissue)between rhC-NB-FITC administration group and FITC control group was statistically significant(P0.01).At 24 h after admin-istration,rhCNB-FITC mainly concentrated in liver tumor,stomach,kidney,lung and other tissues and organs,andthe concentration of rhCNB was the highest in liver tumor.The fluorescence intensity of liver tumor in rhCNB-FITCadministration group and FITC control group was compared,P0.05,which had statistical significance.Conclusion:Recombinant human calmodulin phosphatase B subunit has good targeting properties for liver cancer.Key wordshepatocellular carcinoma in situ,calmodulin phosphatase B subunit,tumor targeting,in vivo imagingsystem2021年，全球新发癌症病例约192 9万例，肝癌91万例，占新发癌症总数的4.7%，癌症死亡病例996 万例，肝癌83万例，占癌症死亡总数的8.3%1,肝癌死亡病例数占肝癌发病数的91.2%。可见肝癌死亡率很高。因此，在现有治疗手段的基础上探索其他治疗肝癌的方法对于肝癌患者具有重要意义。钙调蛋白磷酸酶（CaN)是一种真核钙离子和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。它是一种异二聚体蛋白，由一个催化亚基钙调神经磷酸酶A和一个紧密结合的豆蔻酰化钙离子结合亚基钙调神经磷酸酶B组成,后者包含一个活性位点双核金属中心2-3。其中,A亚基为催化亚基，分子量为6 0 6 1kD;B亚基为调节亚基，编码基因位于2 号染色体，分子量为19.3kD,含有4个Ca*结合位点4-5,主要分布于细胞的质膜、胞浆、细胞核、胞外、细胞骨架和线粒体。研究表明，外源性rhCNB可以通过网络蛋白依赖性受体介导的内化,并以时间和浓度依赖性的方式被细胞吸收到许多不同的肿瘤细胞中发挥抗肿瘤作用6 。前期预实验重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基（recombinanthumancalcineurinsubunitB,rhCNB）能有效抑制肝癌细胞及其实体瘤的生长，对正常肝细胞无抑制作用，但其肝癌靶向性尚需进一步研究。本研究先用FITC荧光标记rhCNB并建立BALB/裸小鼠荷人肝癌细胞SMMC-7721原位肝癌模型，运用小动物活体成像系统检测rhCNB不同时间点在荷瘤小鼠体内的分部情况，为rhCNB的肿瘤靶向性研究及其评价提供依据。1材料与方法1.1实验材料rhCNB，由海口奇力制药有限公司提供；FITC标记的rh-CNB(rhCNB-FITC）,代号：2 48 3-蛋白-FITC,规格：1mL/瓶，保存条件：-8 0 避光长期保存，厂家：上海友科生物科技有限公司;FITC对照品，规格：1mL/瓶，保存条件：-8 0 避光长期保存，厂家：上海友科生物科技有限公司；肿瘤细胞株，人肝癌细胞SMMC-7721,购于中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司。1.2实验动物及饲养条件42只SPF级BALB/c裸小鼠，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验时体重18 2 2 g，性别均为雄性。实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2 0 16-0 0 0 2，实验动物质量合格证：No.43004700035420，实验动物使用许可证号：SYXK（琼）2 0 17-0 0 13。实验动物饲养的环境条件符合国家标准（G B1492 5-2 0 10）对SPF级实验动物环境条件的要求。实验室温度为2 0 2 6，最大日温差/4，相对湿度为40%70%，最小换气次数15（次/h），空气洁净度为7 级，相同区域的最小压差10 Pa，沉降菌最大平均浓度3（CFU/0.5h 90mm平皿），氨浓度14mg/m,噪声不高于6 0 dB，动物照度为15 2 0 lx。1.3方法1.3.1细胞混悬液RATBY小下移植瘤模肿瘤细胞体外常规培养至对数生长期（刚复苏的细胞应传代2 次以上），消化离心脏后制成浓度约110 7 个细胞/mL的细胞混悬液,0.1mL/只接种于小鼠右侧腋窝皮下。注射完后应用干净的干棉签按压针眼至无细胞混悬液溢出。1.3.2建立BALB/c多植瘤模型7 取生长良好的皮下移植瘤，用眼科剪剪成大小约为2mm2mm2mm的肿瘤组织块备用。实验采用MatrxVIP3000型气体麻醉系统对实验动物进行气体麻醉，麻醉剂为异氟烷。动物麻醉后，取仰卧位，用组织剪逐层剪开皮肤，开口长度约为1cm，暴露出肝脏。先用带缝合线的缝合针（410)穿过肿瘤组织，再从肝右叶内测穿至外侧，然后打一个手术结,轻轻拉紧，剪断手术线即可。这样肿瘤组织刚好可以夹在肝右叶和肝左叶之间，不会与其它组织黏连，最后逐层缝合好腹腔，创口消毒，小心饲养。1.3.3动物分组分别取原位接种人肝癌细胞SMMC-7721的BALB/c裸小鼠2 4只，按体重序随机分为FITC标记的rhCNB给药组和FITC对照组，每组12 只，其中6 只在给药后2 h进行荧光检测，剩余6 只在给药后2 4h进行荧光检测。另取18 只未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠，12 只给予FITC标记的rh-CNB,其中6 只在给药后2 h进行荧光检测,6 只在给药后2 4h进行荧光检测，6 只不给药作为正常对照1.3.4给药剂量、药体积和给药浓度FITC标记的rhCNB-FITC样品中rhCNB浓度为0.2mg/mL,给药体积为10 mL/kg，因此，给药剂量为2 mg/kg。其中,FITC的浓度为0.34mg/mL(389.38g/M8.7110-4M0.34mg,0.34mg1mL=0.34mg/mL）,给药剂量为3.4mg/kg；阳性对照品中FITC的浓度为0.31mg/mL(389.38g/M8.0710-4M0.31mg,0.31mg1mL=0.31mg/mL）。为了使阳性对照给予的FITC剂量与供试品一致，在不改变其浓度的条件下只有增加给药体积，给药体积为3.4mg/kg=0.31 mg/mL10.97 mL/kg。1.3.5给药途径和给药频率rhCNB-FITC给药组和FITC对照组尾静脉注射给药，给药1次。1.3.6检测指标用小动物活体成像系统对荷瘤BALB/c裸小鼠心脏、肺、肝（含肿瘤）、胃、双侧肾脏和脾脏进行FITC荧光发光值检测，分析FITC标记的rhCNB是否靶向作用于肿瘤部位。3344：钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究韩丽芳，等如果供试品FITC标记的rhCNB给药组在肿瘤部位检测到的荧光发光值强于FITC阳性对照组动物肿瘤部位的荧光发光值，则说明rhCNB在肿瘤部位具有靶向聚集作用。所得数据用SPSS统计软件进行分析。1.3.7统计学分析采用SPSS27.0统计分析软件进行统计分析，结果以xs表示，各组间的差异采用单因素方差分析,P0.05为差异具有统计学意义，P0.01为差异具有显著统计学意义2结果2.11正常BALB/c裸小鼠的心、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏部位的荧光值检测对未接种正常动物组小鼠心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏荧光检测，当最小值（Min）调至510 时，所有动物除胃（内容物）以外，均未见明显荧光信号（图1）。heartlung,RO135%-2.196e+09RO125%-3.412e+09ROII5%10.00125%-2.100c+09RO1115%RO125%-3.014c+09RO135%-2.497e+09ROL15%-39.08.010liverstomach7.06.0kidney5.0spleenB图1正常BALB/c裸小鼠主要生命器官荧光图A-C：胃部所检测到的荧光为胃内容物所产生的荧光。Fig.1Fluorescence image of major vital organs in normal BALB/c nude miceA-C:The fluorescence detected in the stomach is that produced by the stomach contents.2.2正常BALB/c裸小鼠给予rhCNB-FITC后各主要器官的荧光值检测rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠后2 h、2 4 h,剖检取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏,用小动物活体成像系统进行荧光检测。结果表明,rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常动物2 h时，主要分布于动物的肾脏、肝脏、胃、心脏和肺，脾脏未见明显分布（表1、图2 A-B）。r h C-NB-FITC给予正常动物2 4h时，主要分布于动物的肾脏，荧光值为4.15E+092.28E+09，肝、胃、心、肺和脾脏未见明显分布（图2 C）。说明通过尾静脉注射进人动物体内的绝大部分rhCNB能在2 4h内通过肾脏代谢。表1正常BALB/c裸小鼠给予rhCNB-FITC2h时的组织器官荧光强度(xs,p/s/W/cm)Tab.1Fluorescence intensity in tissues and organs of normal BALB/cnude mice treated with rhCNB-FITC for 2 h(x s,p/s/W/cm?)OrgansFluorescencevalueHeart1.48E+09 5.87E+08(n=6/6)Lung4.79E+09 7.65E+08(n=6/6)Liver1.81E+103.35E+09(n=6/6)Stomach1.24E+10 3.12E+09(n=6/6)Kidney(bilateral)3.44E+10 7.48E+09(n=6/6)Spleen注：n为动物数，“/后的数字为动物总数，“/前的数字为检测到相应脏器荧光值的动物数。“_”表示未检测到明显的荧光信号。“肝”和“胃”已减去空白对照组动物肝脏和胃（包括内容物）的平均荧光值。Note:n is the number of animals,the number after /is the totalnumber of animals,and the number before /is the number of animalswhose corresponding organ fluorescence value is detected.indi-cates that no obvious fluorescence signal is detected.Liver and stomach have been subtracted from the mean fluorescence values ofliver and stomach(including contents)of blank control animals.2.3rhCNB在人肝癌细胞SMMC-7721原位移植瘤模型动物肿瘤部位的聚集rhCNB-FITC给药组和FITC阳性对照组动物分别在给予rhCNB-FITC和FITC后2 h、2 4h，剖检取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏，用小动物活体成像系统进行荧光检测从表2 可以看出，在原位肝癌模型试验中，rhCNB-FITC给药2 h时，主要分布于肝、肾脏、肺、胃和心脏等组织器官，脾脏内未检测到明显荧光。FITC给药组只有在肝和胃组织中能检测到荧光，而且荧光强度明显弱于rhCNB-FITC给药组。rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部（包括正常组织和肝肿瘤组织)的荧光强度比较,P0.01,具有显著统计学意义。原位肝癌模型组动物给予rhCNB-FITC与未接种肝肿瘤的正常组动物给予rhCNB-FITC比较,P0.05,具有统计学意义。说明rhCNB在肝肿瘤部位有明显聚集，即对肝肿瘤具有较强的靶向性。从表3可以看出，rhCNBFI T C 给药2 4h时，主要聚集在肝、胃、肾脏和肺等组织器官。6 只动物的肝肿瘤和胃部均能检测到明显荧光，2 只动物的肺部能检测到明显荧光，5只动物的肾脏能检测到明显荧光，脾脏内未检测到明显荧光。FITC在3只动物的肝脏和4只动物的胃部能检测到明显荧光，而且荧光强度弱于rhCNB-FITC。r h CNB-FI T C给药组与FITC对照组肝肿瘤部的荧光强度比较,P0.05,具有统计学意义。而且，未接种肿瘤的正常动物在给予rhCNB-FITC给药2 4h时,肝脏内已未能检测到明显荧光。说明rh-CNB在原位肝癌动物模型中，2 4h时主要聚集在肝肿瘤部位。rhCNB-FITC给药2 h时，肾脏内的荧光强度（即药物浓度)最高，说明rhCNB在体内可能主要通过肾脏排泄。其次是肝肿瘤、胃和肺。其中,肝脏的荧光强度主要集中在肝肿瘤组织部位,且明显强于FITC对照组肝肿瘤组织和正常肝组织（图2 D-E）。说明rhCNB给予原位肝癌荷瘤动物后MODERNON31,No.182023年0 9 月3345.第31卷第18 期现代肿瘤医学2h,在肝肿瘤部位有大量聚集，即对肝肿瘤具有较强的靶向性。rhCNB-FITC给药2 4h时,肝肿瘤组织部位的荧光强度（即药物浓度）最高，其次胃和肾脏（图2 F）。正常肝组织部位未见明显荧光。说明rhCNB给予荷瘤动物后2 4h，在肝肿瘤部位仍然有大量聚集，即对肝肿瘤具有较强的靶向性。2h24hrhCNB-FITCFITCrhCNB-FITCFITC1heartlung1.00.80.61010liver0.4stomach0.2kidneyspleenB1.8lungheart10361531-5.38-4091.6liver.1.41.210”stomach1.0livertumo55315-4090.8kidney0.6spleen353-30220DFSectionpictureFluorescentpicture图2 rhCNB在实验动物各主要生命器官的分布及肿瘤靶向A、D：正常动物和原位肝癌荷瘤动物心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和胃的剖检图;B：正常动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后2 h荧光图;C：正常动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后2 4h荧光图;E：原位肝癌荷瘤动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后2 h荧光图;F:原位肝癌荷瘤动物分别给予rhCNB-FITC和FITC后2 4h荧光图。Fig.2 Distribution and tumor targeting of rhCNB in major living organs of experimental animalsA,D:Necropsy charts of the heart,liver,spleen,lungs,kidneys,and stomach of a normal animal and in situ hepatocellular carcinoma bearing animals.B:Normal animals were given rhCNB-FITC and FITC respectively.C:Normal animals were given rhCNB-FITC and FITC respectively for 24 h fluores-cence map.E:Fluorescence images of in situ hepatocellular carcinoma bearing animals given rhCNB-FITC and FITC at 2 h.F:Fluorescence images for 24h after rhCNB-FITC and FITC were given to animals with in situ hepatocellular carcinoma.表2 原位肝癌小鼠模型给予rhCNB-FITC和FITC2h的组织器官荧光强度(xs)Tab.2Fluorescence intensity of organ of rhCNB-FITC and FITC for 2 h in mouse model of in-situ hepatocellular carcinoma(xs)Fluorescencevaluep/s/W/cm?GroupHeartLungLiverStomachKidney(bilateral)3.08E+097.74E+09 5.27E+10 7.55E+095.42E+10rhCNB-FITC2.10E+09(n=5/6)3.99E+09(n=6/6)2.82E+10*(n=6/6)7.73E+09(n=6/6)1.39E+10(n=6/6)4.21E+09 2.84E+09FITC4.89E+09(n=6/6)3.36E+09(n=6/6)注：“*”表示rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部（包括正常组织和肝肿瘤组织）比较,P=0.0020.01，具有显著统计学意义。“”表示原位肝癌模型组动物给予rhCNB-FITC与未接种肝肿瘤的正常组动物给予rhCNB-FITC比较,P=0.0140.05,具有统计学意义。“n”为动物数，“/”后的数字为动物总数，“/前的数字为检测到相应脏器荧光值的动物数。“_”表示未检测到明显的荧光信号。“肝”和“胃”已减去空白对照组动物肝脏和胃（包括内容物）的平均荧光值。Note:*means the comparison of liver(including normal tissue and liver tumor tissue)between rhCNB-FITC administration group and FITCcontrol group(P=0.002 0.01),with significant statistical significance.r e p r e s e n t s t h e c o mp a r i s o n b e t w e e n r h CNB-FIT C g i v e n t o a n i ma l s i nthe orthotopic liver cancer model group and those given to animals in the normal group without liver tumor inoculation(P=0.0140.05),which hasstatistical significance.n is the number of animals,the number after /is the total number of animals,and the number before /is the number ofanimals in which the corresponding organ fluorescence value is detected.indicates that no obvious fluorescence signal is detected.3讨论CaN被细胞内钙浓度增加激活8 ,与钙调蛋白激活的激酶9 一起，CaN直接将钙信号传导与蛋白质磷酸化状态联系起来，并在许多信号传导过程中发挥重要作用0 。CaN存在于真核生物中，从单细胞生物到人都较为保守。研究表明,rhCNB能对肝癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤起抑制作用12-14,但对肿瘤的靶向研究甚少。本文通过FITC 标记的rhCNB和原位肝癌荷瘤小鼠模型，利用小动物活体成像系统对rhCNB的肝癌靶向性进行了系统分析,结果表明,rhCNB具有良好的肝癌靶向性,2 4h时主要聚集在肝肿瘤部位。（编校：闫沛）3346钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究韩丽芳，等2019年1月，国家药品监督管理局受理rhCNB的临床试验申请（治疗用生物制品1类），同年4月获得临床试验默示许可，本研究为rhCNB临床前试验内容之一。表3原位肝癌小鼠模型给予rhCNB-FITC和FITC24h的组织器官荧光强度(xs)Tab.3Fluorescence intensity of organ of rhCNB-FITC and FITC for 24 h in mouse model of in-situ hepatocellular carcinoma(xs)Fluorescencevaluep/s/W/cm?GroupHeartLungLiverStomachKidney(bilateral)2.95E+091.53E+106.94E+09 4.55E+09 rhCNB-FITC2.10E+09(n=2/6)7.72E+09*(n=6/6)1.22E+10(n=6/6)2.58E+09(n=5/6)2.92E+09 7.88E+08 FITC1.87E+09(n=3/6)3.60E+09(n=4/6)注：“*”表示rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部（包括正常组织和肝肿瘤组织）比较,P=0.0330.05,具有统计学意义。Note:*indicates that the comparison of liver(including normal tissue and liver tumor tissue)between rhCNB-FITC administration group andFITC control group(P=0.033 0.05)has statistical significance.由于动物的皮肤、毛、胃内容物、胆汁、肠道微生物和饲料等在与FITC荧光染料相同的激发光和发射光波长范围内都能产生相对较强的荧光。而且检测到的荧光强弱还与发光部位的厚度有关，即与荧光穿透相关。比如活体检测时，检测到的小鼠体表组织的荧光要强于内部组织。药物从尾静脉注射进人动物体内后，荧光物质较为分散，此时也无法看到药物的聚集现象接种肝癌模型的FITC标记的rhCNB给药组和FITC对照组活体动物在当前给药剂量、给药浓度和给药体积下均无法检测到药物在肿瘤部位的聚集作用。给药后5min和2 h时，供试品组和对照组活体动物体表荧光强度较为接近，无明显差异。给药后2 4h时，供试品组的体表荧光要明显强于阳性对照组动物，这可能与供试品在表浅组织（如淋巴组织）的分布有关。但此时仍然无法检测到药物在肿瘤部位的聚集情况。因此，为了查清药物在动物各重要组织器官的分布和聚集情况，将动物剖检，取出其心、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏，再用小动物活体成像系统进行检测，这样能更加直观和准确的检测药物在上述主要生命器官及肿瘤部位的聚集情况。由于动物的组织、胃肠道内容物和饲料在与FITC荧光染料相同的激发光和发射光波长范围内都等产生相对较强的荧光。因此,对未接种正常动物组1 6 号动物心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏荧光检测，当最小值（Min）调至510时，所有动物除胃（内容物）以外，均未见明显荧光信号。计算出空白对照组动物胃（包括内容物）的荧光值，在计算FITC标记的rhCNB给药组和FITC对照组的胃（包括内容物）和肝脏的荧光值时，应减去空白对照组动物胃（包括内容物）和肝脏的平均荧光值。【参考文献】1SIEGEL RL,MILLER KD,FUCHS HE,et al.Cancer statistics,2021J.CA Cancer J Clin,2021,71(1):7-33.2LAO M,ZHANG X,YANG H,et al.RCAN1-mediated calci-neurin inhibition as a target for cancer therapy J.Mol Med,2022,28(1):69.3CREAMER TP.Calcineurin J.Cell Commun Signal,2020,18(1):137.4GALON 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