核桃多酚对皮质酮损伤PC12细胞的作用机制.pdf

第 41 卷 第 5 期2023 年 9 月食 品 科 学 技 术 学 报Journal of Food Science and TechnologyVol.41 No.5Sep.2023doi:10.12301/spxb202300139文章编号:2095鄄6002(2023)05鄄0068鄄08引用格式:邹存恩,李孟雪,王珂,等.核桃多酚对皮质酮损伤 PC12 细胞的作用机制J.食品科学技术学报,2023,41(5):68-75.ZOU Cunen,LI Mengxue,WANG Ke,et al.Mechanism of walnut polyphenols on PC12 cells injured by corticosteroneJ.Journal of Food Science and Technology,2023,41(5):68-75.核桃多酚对皮质酮损伤 PC12 细胞的作用机制邹存恩1,2,摇 李孟雪1,2,摇 王摇 珂1,2,摇 黎摇 明3,摇 安摇 磊1,*,摇 王友升1,2,*(1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/老年营养与健康教育部重点实验室,北京 100048;2.山东凯普菲特生物科技有限公司 日照华伟大健康产业研究院,山东 日照 276801;3.定州市人民医院 临床营养科,河北 定州 073000)摘摇 要:核桃多酚为核桃粕中的生物活性物质,具有重要的开发和应用价值。为探讨核桃多酚的潜在抗抑郁活性,采用皮质酮诱导的大鼠嗜铬瘤(PC12)细胞损伤模型,以细胞活力、细胞凋亡、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量、细胞内钙离子水平评价核桃多酚在皮质酮损伤模型上的作用,并进一步采用蛋白免疫印迹法探讨核桃多酚对皮质酮损伤 PC12 细胞作用的机制。结果表明:核桃多酚(75、150 滋g/mL)预处理可显著逆转皮质酮损伤引起 PC12 细胞活力降低、细胞凋亡、LDH 释放量增加和钙超载,发挥细胞保护作用;此外,核桃多酚可显著逆转皮质酮诱导的 PC12细胞中 cAMP 依赖性蛋白激酶 A(cAMP鄄dependent protein kinase A,PKA)活性降低,并下凋 cAMP反应原件结合蛋白(cAMP鄄response element binding protein,CREB)133 位丝氨酸的磷酸化和下游靶蛋白脑源性神经营养因子(brain鄄derived neurotrophic factor,BDNF)的表达量;进一步应用 PKA 阻断剂 H89 预处理消除了核桃多酚对皮质酮诱导的 PC12 细胞的保护作用,说明增加 PKA/CREB/BDNF 信号通路活性是核桃多酚发挥抗皮质酮损伤作用必需的。研究结果表明,核桃多酚具有潜在的抗抑郁活性,可能是核桃饮食发挥抗抑郁作用的重要物质基础,其对皮质酮损伤的 PC12 细胞的保护作用与上调 PKA/CREB/BDNF 信号通路有关。研究结果旨在探明核桃多酚的潜在抗抑郁活性及机制,并为核桃粕的高值化利用提供理论参考。关键词:核桃多酚;皮质酮;PC12 细胞;压力应激;神经营养通路中图分类号:TS255郾 1;TS201郾 4摇 摇 摇 摇 摇 文献标志码:A收稿日期:20230313基金项目:国家自然科学基金面上项目(31471626;31972127)。Foundation:National Natural Science Foundation of China(31471626;31972127).第一作者:邹存恩,男,硕士研究生,研究方向为生物活性物质的功能与活性;并列第一作者:李孟雪,女,硕士研究生,研究方向为生物活性物质的功能与活性。摇*通信作者:安摇 磊,女,副教授,博士,主要从事大脑衰老及压力应激干预方面的研究;王友升,男,教授,博士,主要从事食品生物工程方面的研究。摇 摇 随着生活节奏的加快,人们面临的压力持续增加,慢性压力应激引起的大脑功能受损及疾病状态,如抑郁症等,对人体健康的危害正日益凸显。现有缓解压力应激及抗抑郁治疗的药物大多存在不良反应多、起效慢、效率不高和价格昂贵等缺点。研究表明,营养干预或膳食补充剂在改善情绪和预防相关疾病中可能具有独特优势1。核桃(Juglans regia L.),又名胡桃,与腰果、榛86子、扁桃并称世界四大干果。自古以来,核桃就被认为是健脑益智的佳品。核桃营养价值极为丰富,核桃仁含有大量多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfatty acid,PUFAs)、多酚类成分、蛋白质以及多种矿物质等2-3。大量动物和人体实验研究表明,核桃可多方面促进大脑健康4-6。美国一项为期 10 年的健康和营养调查研究数据显示,食用核桃的消费者患抑郁症的风险显著低于不食用核桃的消费者(降低 26%),也明显低于食用其他坚果的消费者(降低 8%)7。最近的一项随机对照实验显示,为期 8 周的核桃饮食干预可明显改善非抑郁健康年轻男性的心境和情绪8。但目前,关于核桃潜在改善心境和抗抑郁的功能组分及作用机制尚不清楚。应激性生活事件可诱发抑郁症已成为不争的事实。当机体感受应激源时,下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA)兴奋性提高,肾上腺分泌的应激激素糖皮质类固醇(glucocor鄄ticoids,GC,人类为皮质醇,啮齿类动物为皮质酮)升高,从而动员储能,提高心血管张力、糖代谢等。适当应激反应有利于机体渡过短期恶劣环境,但若机体长期处于不良应激状态,HPA 功能持续亢进,继而导致 GC 水平持续升高,造成对大脑,特别是海马等关键脑区神经元的选择性损伤,被认为是抑郁症发生发展的生理生化基础。体外实验发现,皮质酮可导致类神经细胞如大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12 细胞)出现损伤和凋亡,模拟应激状态的海马神经元损伤,是目前最常用和最公认的压力应激和抑郁症的体外细胞模型9。经典的抗抑郁药和植物有效成分在该模型上表现出很好的细胞保护作用10-12。前期研究发现,摄食质量分数为 6%和 9%的核桃饲料 8 周,可显著促进 D鄄半乳糖脑老化模型大鼠海马环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(cAMP鄄responsive element鄄binding protein,CREB)的磷酸化及其下游靶蛋白脑源性神经营养因子(brain鄄derived neurotrophic factor,BDNF)的表达,并上调海马齿状回部位神经元再生13。CREB 及其靶蛋白 BDNF 是介导神经营养和神经可塑性的关键分子,CREB 中 133 位点丝氨酸(S133)的磷酸化是激活 CREB 转录活性的关键,cAMP 依赖性蛋白 激 酶 A(cAMP鄄dependent protein kinase A,PKA)是调控这一过程的主要激酶,并受到上游二级信 使 cAMP 的 调 控。大 量 研 究 证 实,PKA/CREB/BDNF 信号是调控海马神经元损伤及保护的关键细胞信号通路14-16。本研究团队在研究中证实,核桃多酚可显著逆转 H2O2诱导的人神经母 细 胞 瘤(SH-SY5Y)细 胞 损 伤,并 上 调 PKA/CREB/BDNF 信号通路活性17。但是,核桃多酚对皮质酮所致 PC12 细胞损伤是否具有保护作用,其机制是否与 PKA/CREB/BDNF 信号通路的调控作用有关尚未见相关报道。鉴于此,本研究拟采用皮质酮损伤的 PC12 细胞模型,探讨核桃多酚的细胞保护作用及信号通路机制,希望为揭示核桃多酚的潜在抗抑郁活性及机制,并为核桃粕资源的高值化利用提供参考。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料与试剂大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12 细胞),购自 美 国 细 胞 培 养 物 收 藏 中 心(ATCC襆CRL1721郾 1TM)。RPMI 1640 培养基,美国 Hyclone 公司;马血清,美国 Biological 公司;胎牛血清,以色列 BiologicalIndustries 公司;胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗,美国 Gibco 公司;H89、皮质酮、2忆,7忆鄄二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针、BDNF 一抗,美国 Sigma 公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒、钙离子试剂盒、二苯甲亚胺细胞凋亡(Hoechst33342)染色试剂盒,碧云天生物技术研究所;3鄄(4,5鄄二甲基噻唑鄄2)鄄2,5鄄二苯基四氮唑溴盐(MTT)、牛血清白蛋白五组分,北京 Biotopped 公司;ECL 显影液,北京全品速生物科技有限公司;茁鄄actin 一抗、p鄄PKA 底物(substrate)一抗、CREB 一抗,美国 CellSingal Technology 公司;p鄄CREB(Ser133)一抗,德国Merck 公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI),北京兰博利德公司;蛋白质定量试剂盒、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗,北京普利莱基因技术有限公司。1郾 2摇 仪器与设备Infinite M1000 PRO 型酶标仪,瑞士 Tecan 公司;Mini鄄PROTEAN Tetra 型垂直电泳槽、Mini鄄PRO鄄TEAN Tetra 型蛋白转印系统、Universal Hood 芋型显影仪,美国 Bio鄄Rad;170 liters 型 CO2培养箱,德国Galaxy S 公司;Axiovert 200 型倒置显微镜,蔡司光学仪器上海国际贸易有限公司。96第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 邹存恩等:核桃多酚对皮质酮损伤 PC12 细胞的作用机制1郾 3摇 实验方法1郾 3郾 1摇 核桃多酚的制备方法及成分鉴定核桃多酚的制备方法参考本课题组前期研究。脱脂核桃粕经粉碎机粉碎后,过 200 目筛备用。按料液比(g颐 mL)1颐 50 加入体积分数为 75%的乙醇搅拌浸提,重复 3 次后合并滤液旋蒸浓缩。浓缩液按1颐 1的体积比用乙酸乙酯萃取 3 次,旋干溶剂得到乙酸乙酯提取物。将提取物依次通过 NKA-9 和 HP-20 大孔吸附树脂进行纯化,洗脱液经 45 益 旋蒸浓缩后,冷冻干燥即得核桃多酚。产物通过UPLC-Q-TOF MS/MS 鉴定成分17。1郾 3郾 2摇 细胞培养采用 RPMI 1640 培养基,配置成含体积分数为10%的马血清、5%的胎牛血清和 1%的双抗的完全培养液。在 37 益、体积分数为 5%的 CO2细胞培养箱中培养 PC12 细胞。3 4 d 传代1 次,取对数生长期的细胞进行后续实验。1郾 3郾 3摇 皮质酮损伤 PC12 细胞模型的建立将 PC12 细胞按照 1 伊 104个/孔的密度接种于96 孔板中,每孔 100 滋L 孵育过夜。用无血清培养基配置 100、200、300、400 滋mol/L 的皮质酮溶液,与PC12 细胞共孵育 24 h,每组设置 6 个复孔。培养结束每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 10 滋L,37 益孵育4 h 后弃去上清液,每孔加入 100 滋L DMSO,振荡 10min 使结晶充分溶解,用酶标仪检测490 nm 处吸光值。相对细胞活力计算方法见式(1)。相对细胞活力=OD(实验)-OD(空白)OD(对照)-OD(空白)伊100%。(1)式(1)中,OD(实验)为处理后细胞孔中溶液的吸光值,OD(对照)为未处理细胞孔中溶液的吸光值,OD(空白)为 PBS 的吸光值。1郾 3郾 4摇核桃多酚预孵育条件下的正常培养 PC12细胞活力的测定将 PC12 细胞按照 1 伊 104个/孔的密度接种于96 孔板中,每孔 100 滋L 孵育过夜。用无血清培养基配制质量浓度为50、75、100、150 滋g/mL 的核桃多酚培养液,加入 96 孔板中,对照组加入无血清培养液,每组 6 个复孔,孵育 24 h。孵育结束采用 MTT法检测细胞活力变化。1郾 3郾 5摇 核桃多酚预孵育条件下的皮质酮模型 PC12细胞活力的测定将 PC12 细胞按照 1 伊 104个/孔的密度接种于96 孔板中,每孔 100 滋L 孵育过夜。加入 50、75、100、150 滋g/mL 的核桃多酚培养液,对照组和模型组加入无血清培养液,孵育 12 h。12 h 后,弃原培养液,模型组和核桃多酚处理组加入 200 滋mol/L 皮质酮(根据 1郾 3郾 3 中实验结果选用 200 滋mol/L 的皮质酮建立慢性应激模型),对照组加入无血清培养液,孵育 24 h。孵育结束用 MTT 法测定细胞活力。1郾 3郾 6摇 PC12 细胞凋亡检测将 PC12 细胞按照 1 伊105个/mL 接种于 6 孔板中,孵育过夜。加入质量浓度为75、150 滋g/mL 的核桃多酚溶液,对照组和模型组加入无血清培养液,孵育 12 h。弃原培养液,模型组与核桃多酚处理组加入 200 滋mol/L 的皮质酮溶液,孵育 24 h。处理结束后用 PBS 洗涤 1 次,并用质量分数为 4%的多聚甲醛固定 15 min,之后用 PBS 洗涤 5 min,重复 3 次。用 Hoechst 33342 染色液(原液稀释100 倍)在37 益下孵育 10 min,PBS 洗涤 5 min,重复 3 次,再用 PI(5 滋g/mL)溶液染色 5 min,用 PBS 洗涤 5 min,重复3 次后,在荧光显微镜下观察并拍照。1郾 3郾 7摇 LDH 释放水平检测按照 1郾 3郾 6 中的方法进行实验,细胞培养结束后,每孔取 1 mL 细胞培养液,离心后取上清液按试剂盒说明书操作,通过测定 LDH 在反应体系中生成的丙酮酸的量来表示 LDH 的活性。用酶标仪检测样品在 450 nm 处的吸光值。按式(2)和式(3)计算培养液中 LDH 活性和相对 LDH 活性。LDH 活性=OD(实验)-OD(对照)OD(标准)-OD(空白)伊0郾 2 伊1 000;(2)相对 LDH 活性=测定组 LDH 活性对照组 LDH 活性伊100%。(3)式(2)中,OD(实验)为处理后细胞孔中溶液的吸光值,OD(对照)为未处理细胞孔中溶液的吸光值,OD(标准)为标准品的吸光值,OD(空白)为 PBS 的吸光值;LDH 活性,U/L。式(3)中,相对 LDH 活性,%。1郾 3郾 8摇 细胞内钙离子水平检测将 PC12 细胞按照 1 伊 104个/孔的密度接种于96 孔 黑 边 透 明 底 板,孵 育 过 夜。加 入 75、150 滋g/mL 的核桃多酚培养液,孵育 12 h。12 h后,加入含有 200 滋mol/L 的皮质酮溶液,孵育24 h。弃 去 培 养 液,加 入 无 血 清 培 养 液 配 制 的5 滋mol/L探针溶液,37 益 培养 30 min。用 PBS 洗07食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 9 月涤 3 次除去未装载的探针。采用酶标仪进行双波长检测,激发波长为 340 nm 和 380 nm,发射波长为 510 nm。用 340 nm 和 380 nm 两个荧光波长的比值来表示细胞内的钙离子浓度,最后结果用相对于对照组钙离子浓度的比值表示。1郾 3郾 9摇 PKA/CREB/BDNF 信号通路活性检测按照 1郾 3郾 6 中的方法进行实验,细胞培养结束后,采用蛋白免疫印迹法检测细胞内 PKA/CREB/BDNF 活性或表达量。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液在冰上裂解细胞,离心收集蛋白,采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离,采用湿转法将蛋白转至 PVDF 膜上,用质量分数 5%的脱脂奶粉室温封闭1 h。再 分别加入一抗 p鄄PKA substrate(1 颐2 000)、p鄄CREB(1颐 2 000)、CREB(1颐 4 000)、BDNF(1颐 4 000)、茁鄄actin(1颐 4 000),4 益 摇床孵育过夜。PBST 缓冲液洗涤 10 min,重复 3 次,加入二抗室温孵育 1 h,PBST 缓冲液再洗涤 10 min,重复 3 次。加入 ECL 化学发光液,并采用凝胶成像仪进行曝光检测,通过 Image J 软件进行分析,以 茁鄄actin 为内参计算相对灰度值,用来表示目标蛋白的表达水平。进行 3 次平行实验。*表示与未处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01);#表示与仅皮质酮处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01)。图 1摇 核桃多酚对皮质酮处理的 PC12 细胞活力的影响Fig.1摇 Effect of walnut polyphenol treatment on viability of corticosterone鄄treated PC12 cells1郾 3郾 10摇 H89 阻断实验PC12 细胞种板后过夜培养,加入含有 10 滋mol/L的 PKA 抑制剂 H89 的空白培养液预处理1 h。加入质量浓度为 75、150 滋g/mL 的核桃多酚,另设未经H89 阻断的加药组,孵育 12 h。弃原培养液,加入含200 滋mol/L 的皮质酮培养液,孵育 24 h,通过 MTT法测定阻断 PKA 后的细胞活力;另加入质量浓度为100 滋g/mL 的核桃多酚,细胞处理方法与 MTT 法相同。采用蛋白免疫印迹法测定阻断 PKA 后的PKA/CREB/BDNF 信号通路活性。1郾 4摇 数据处理采用GraphPad Prism 6 软件进行分析,结果以平均值 依 标准误差(SEM)表示,每个实验结果至少进行3 次平行实验。多组间比较采用单因素方差分析(one鄄way ANOVA),组间两两比较采用 Dunnet t 检验,P 0郾05 表示差异显著,P 0郾01 表示差异极显著。2摇 结果与分析2郾 1摇 核桃多酚预孵育对皮质酮诱导的 PC12 细胞活力的影响建立皮质酮诱导的 PC12 细胞损伤模型,模拟压力应激状态时高应激激素水平对大脑神经元损伤状态,实验结果如图 1。由图 1(a)可知,皮质酮作用 24 h 后能够剂量依赖性地诱导 PC12 细胞活力降低。200 滋mol/L 皮质酮处理的 PC12 细胞活力下降至对照组的 60%左右(P 0郾 01),适宜进行保护作用的评价。因此,确定建立皮质酮损伤细胞模型的条件为 200 滋mol/L 皮质酮作用 24 h。在核桃多酚保护作用实验前,先考察核桃多酚对正常培养的 PC12 细胞的影响。由图 1(b)可见,核桃多酚(50、75、100、150 滋g/mL)作用 12 h 对PC12 细胞活力无明显影响,而较高浓度的核桃多酚(200 滋g/mL)显著降低了细胞活力至 80%左右(P 0郾 01),提示该浓度对 PC12 细胞存活有害。因此选用50 150 滋g/mL 剂量进行保护作用实验。由图 1(c)可见,与损伤细胞相比,用核桃多酚预处理12 h,显著提高了皮质酮诱导的 PC12 细胞活力(P 0郾 01)。核桃多酚质量浓度为 150 滋g/mL 时的作用效果最显著(P 0郾 01)。基于细胞活力的量效17第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 邹存恩等:核桃多酚对皮质酮损伤 PC12 细胞的作用机制实验结果,后续实验选择代表性有效剂量 75 滋g/mL和 150 滋g/mL 开展相关研究。2郾 2摇 核桃多酚预孵育对皮质酮诱导的 PC12 细胞凋亡、LDH 释放及钙离子含量的影响为了进一步评价核桃多酚对皮质酮损伤的PC12 细胞的保护作用,观察核桃多酚对细胞凋亡、细胞外 LDH 释放量和细胞内钙离子浓度的影响,实验结果见图 2。采用 Hoechst 33342 染色法,通过观察细胞染色质的变化评价细胞凋亡情况。由图 2(a)可知:正常活细胞呈弥散均匀低蓝色荧光,细胞核结构正常;皮质酮处理后,细胞核皱缩、染色质固缩凝聚,呈现出典型的凋亡样形态,发出亮蓝色荧光的凋亡细胞增多,而且晚期凋亡细胞的细胞膜受损,PI 嵌入 DNA 显示浅红色荧光,坏死细胞 DNA 也被 PI 染色,呈现亮红色荧光;75、150 滋g/mL 的核桃多酚预处理后细胞核染色质形态正常化,凋亡细胞数量明显降低。LDH 广泛存在于各种细胞中,当细胞膜不再完整或受损时,LDH 就释放到培养基中,因此细胞外 LDH 水平是细胞损伤的重要指标。由图 2(b)可知,皮质酮处理的细胞培养液中,LDH 水平显著升高到对照组的 1郾 5 倍左右(P 0郾 01)。核桃多酚预处理后显著降低了 LDH 的释放。同样的核桃多酚预处理显著降低了由皮质酮导致的细胞内钙离子水平升高图 2(c)。这些结果进一步证实了核桃多酚对PC12 细胞的保护作用。#表示与未处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾01);*表示与仅皮质酮处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾01)。图 2摇 核桃多酚预孵育对皮质酮处理的 PC12 细胞凋亡、LDH 释放及钙离子含量的影响Fig.2摇 Effects of walnut polyphenol preincubation on apoptosis,LDH release and calcium ion concentrationof corticosterone鄄treated PC12 cells2郾 3摇 核桃多酚预孵育对皮质酮诱导的 PC12 细胞PKA/CREB/BDNF 神经营养通路的影响PKA 是调控 CREB 磷酸化的主要上游激酶,可诱导 CREB 磷酸化而激活 CREB 介导的转录活性。本研究中,应用 PKA 磷酸化底物的抗体来检测 PKA的活性18,实验结果见图 3。Western blot 结果图 3(a)表明,皮质酮处理显著降低了 PC12 细胞PKA 磷酸化底物表达,抑制 PKA 的活性(P 0郾 05),而核桃多酚(75、150 滋g/mL)处理显著上调PC12 细胞 PKA 活性,并显著增加 CREB Ser133 位点的磷酸化水平图 3(b)及其下游蛋白 BDNF 的表达(P 0郾 01)图 3(c)。这些结果表明,核桃多酚处理显著上调了 PC12 细胞 PKA/CREB/BDNF 神经营养通路,这与前期的研究结果相一致,可能是核桃多酚发挥抗皮质酮损伤的重要机制。2郾 4摇 阻断 PKA 活性对核桃多酚预孵育的皮质酮诱导 PC12 细胞的影响在确定核桃多酚可显著上调 PKA/CREB/BD鄄NF 信号通路基础上,应用 PKA 特异性抑制剂 H89(10 滋mol/L)预处理 PC12 细胞 1 h,观察核桃多酚对皮质酮诱导的 PC12 细胞活力的影响和阻断效果,实验结果见图 4。图 4(a)显示,单独用 H89 处27食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇摇 2023 年 9 月为未处理细胞,为皮质酮处理细胞。#表示与未处理细胞相比,组间数据具有显著差异(P 0郾 05),#表示与未处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01);*表示与仅皮质酮处理细胞相比,组间数据具有显著差异(P 0郾 05),*表示与仅皮质酮处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01)。图 3摇 核桃多酚对皮质酮处理的 PC12 细胞 PKA/CREB/BDNF 神经营养信号通路的影响Fig.3摇 Effects of walnut polyphenols on PKA/CREB/BDNF neurotrophic signaling pathway incorticosterone鄄treated PC12 cells为未处理细胞,为皮质酮处理细胞,为皮质酮与 H89 共处理细胞,为仅 H89 处理细胞。#表示与未处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01);*表示与仅皮质酮处理细胞相比,组间数据具有显著性差异(P 0郾 05),*表示与仅皮质酮处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01);&表示与同等剂量多酚处理细胞相比,组间数据具有显著性差异(P 0郾 05),&表示与同等剂量多酚处理细胞相比,组间数据具有极显著差异(P 0郾 01)。图 4摇 H89 预处理后核桃多酚对皮质酮处理的 PC12 细胞活力和 PKA/CREB/BDNF 信号通路的影响Fig.4摇 Effect of walnut polyphends on cell viability and PKA/CREB/BDNF signal pathwayin corticosterone鄄induced PC12 cells摇理不影响 PC12 细胞活力,而用 H89 预处理取消了核桃多酚(75、150 滋g/mL)的细胞保护作用。同样,在 H89 作用于 PC12 细胞的情况下,PKA 磷酸化底物、磷酸化 CREB 和 BDNF 表达量上调作用均出现被抑制的现象图 4(b)、(c)、(d)。研究结果表明,上调 PKA/CREB/BDNF 通路是核桃多酚改37第 41 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 邹存恩等:核桃多酚对皮质酮损伤 PC12 细胞的作用机制善皮质酮引发 PC12 细胞损伤作用的关键机制。3摇 讨摇 论压力应激会引起胞内信号传导及基因表达变化,从而引起特定脑区神经营养障碍,神经可塑性下降。神经营养因子及其信号转导通路失调或改善是抑郁症发生与康复的重要细胞内机制19。BDNF是神经营养因子家族重要成员,是 CREB 的关键下游靶蛋白,BDNF 与其特异性受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)结合后,能够在促进神经元的生长、分化,维持成熟神经元功能和突触可塑性方面发挥重要作用20。上调 CREB 活性及其靶蛋白 BDNF 表达水平被认为是抗抑郁剂发挥作用的重要靶标和神经营养机制21。研究表明,膳食多酚的消耗量和抑郁相关症状具有显著的负相关22。鞣花单宁(ellagitannins,ETs)和鞣花酸(ellagic acid,EA)是重要的膳食多酚,存在于多种水果、蔬菜和坚果中,研究显示,这些多酚类物质在多种动物模型上表现出良好的抗抑郁活性23-24,并可显著增加抑郁小鼠海马 BDNF 表达量25。核桃中的多酚类化合物主要为鞣花单宁类物质26,前期研究中我们应用 UPLC/MS 分析本研究中的核桃多酚样品,发现其主要为鞣花单宁或鞣花酸类成分,包括 pedunculagin/casuariin、casuari鄄nin/casuarictin、strictinin/isostrictinin、tellimagrandinI、valoneic acid dilactone、sanguisorbic acid dilactone、glansrin C、glansrin B、praecoxin A/platycariin 和鞣花酸17,进一步提示核桃多酚及其中的鞣花单宁类成分可能是核桃抗抑郁作用的重要功效组分。4摇 结摇 论本研究采用皮质酮诱导的 PC12 细胞损伤模型,通过细胞活力、LDH 释放量和钙离子浓度等指标评价核桃多酚的细胞保护作用,并进一步采用蛋白免疫印迹分析与化学阻断方法相结合的方式,探讨核桃多酚细胞保护作用的分子机制。研究结果显示,核桃多酚可显著逆转皮质酮诱导的 PC12 细胞活力降低、细胞凋亡、LDH 释放和钙超载,发挥细胞保护作用,提示核桃多酚具有潜在的抗抑郁活性。进一步的机制研究表明,核桃多酚可显著上调皮质酮损伤 PC12 细胞PKA/CREB/BDNF 活性或表达,并且这一调控作用是核桃多酚发挥细胞保护作用的关键机制。本研究报道了核桃多酚的潜在抗抑郁活性,但限于体外细胞实验,可进一步采用动物实验评价核桃多酚的抗抑郁活性及神经营养作用。核桃加工的主要产品为核桃油,榨油的同时生成了大量的副产物核桃粕,而核桃多酚是核桃粕中重要的生物活性物质之一。目前核桃粕主要作为饲料或被废弃。对核桃多酚活性及作用机制的研究可望为核桃粕资源高值化利用以及将核桃多酚作为一种抗抑郁功效成分提供理论参考。参考文献:1摇 MARX W,MOSELEY G,BERK M,et al.Nutritional 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